LAMPIRAN Lampiran 1. Tahapan Penelitian Kultur Stok S. thermopillus, L. bulgaricus, dan B. bifidum MRS agar miring Peremajaan S. thermopillus, L. bulgaricus, dan B. bifidum Pengukuran OD dan Pembuatan Kultur Starter S. thermopillus, L. bulgaricus, dan B. bifidum Uji Konfirmasi Morfologi sel S. thermopillus, L. bulgaricus, dan B. bifidum Pembuatan Yoghurt dengan Starter S. thermopillus, L. bulgaricus, dan B. bifidum dengan perbandingan konsentrasi 1:1:0, 1:1:0.5, 1:1:1, 1:1:1.5 Perhitungan Jumlah BAL dan Bakteri Psikrptrofik Pengukuran aktivitas protease (metode Lowry) Pengukuran kadar asam laktat (titrasi) xx
Lampiran 2. Spesifikasi Alat dan Bahan No Nama Alat Merk/Type Kegunaan Tempat 1 Autoklaf HL36E (Hirayama Sterilisasi Alat dan Manufacturing Corp.) Bahan 2 ph meter Thermo Electron Mengukur ph medium Corporation (RL060P) dan Larutan 3 Shaker Inkubator Lab Companion SI- 600 Menginkubasi bakteri 4 Mikroskop Olympus CO11 Mengamati sel bakteri 5 UV- Vis Shimadzu UV mini Spektrophotometer 1240 Mengukur nilai OD Lab. Lingkungan 6 Sentrifuge Eppendorf Centrifuge Memisahkan 541R supernatan 7 Hot plate & stirrer Ika C-Mag HS7 Memanaskan medium 8 Mikropipet & tip Ep. Research park Mengambil suspensi 9 Inkubator Memmert Menginkubasi bakteri 10 Anaerobic jar Oxoid anerojar Menginkubasi bakteri anaerob 11 Buret & statif PTFE stopcock Titrasi Asam Laktat Lab. Fiosiologi Tumbuhan 12 Cawan petri Iwaki Pyrex Kultivasi bakteri 13 Tabung Reaksi Iwaki Pyrex Uji Biokimiawi & peremjaan bakteri 14 Labu Erlenmeyer Iwaki Pyrex Wadah medium 15 Gelas Ukur Iwaki Pyrex Mengukur larutan 16 Pipet Ukur Iwaki Pyrex Mengambil larutan 17 Refrigerator Show case Menyimpan sampel & media 18 Beaker glass Iwaki Pyrex Wadah medium & larutan 19 UV Cabinet Camag UV Cabinet II Melihat perpendaran warna koloni bakteri No Nama Bahan Spesifikasi Kegunaan 1 Alkohol 70% Disinfeksi meja kerja 2 Buffer Tris- HCl 0,05 M Larutan buffer 3 HCl 0,1 M Pelarut dalam pembuatan larutan standar 4 Kasein 2% Substrat enzim protease 5 Buffer fosfat 0,5 M Larutan buffer 6 NaOH 1 N Uji titrasi asam laktat 7 Fenolftalin 0,1% Indikador warna uji asam laktat 8 Folin ciocalteu Pereaksi uji aktivitas protease 9 Tirosin 10 mm Larutan standar 10 TCA 10% Penghenti reakasi aktivitas protease 11 MRSB oxoid Media tumbuh BAL 12 King s B oxoid Media tumbuh Pseudomonas sp. xxi
13 Susu Sapi Bahan dasar yoghurt 14 Skim Bahan untuk yoghurt 15 Akuades Pelarut xxii
Lampiran 3. Komposisi dan Pembuatan Media Pertumbuhan S. thermophilus, L. bulgaricus dan B. bifidum (Oxoid, 2009) a. Pembuatan Media demann Rogosa Sharpe Agar (MRSA) Komposisi : Peptone 10 g Lab-Lemco powder 8 g Yeast extract 4 g Glucose 20 g Sorbiton Mono-oleate 1 ml Dipotasium hydrogen phosphate 2 g Sodium acetate 3H 2 O 5 g Triammonium citrate 2 g Magnesium Sulphate 7H 2 O 0,2 g ManganeseSulphate 4H 2 O 0,05 g Agar 10 g Akuades add 1000 ml ph 6,2 ± 0,2 Cara pembuatan: Sebanyak 62 Gram MRS Agar dilarutkan ke dalam 1000 ml akuades dalam beaker glass, dihomogenkan dengan hot plate dan magnetic stirrer sampai homogen. ph media diukur sekitar 6,2 ± 0,2 dengan mencelupkan kertas ph universal ke dalam media MRSA, apabila ph media terlalu asam maka ditambahkan NaOH 1 N dan apabila terlalu basa maka ditambahkan HCl 1 N. Setelah itu media dituang ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 ml, ditutup dengan cotton plug dan disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121 o C, tekanan 2 atm selama 15 menit. Kemudian disimpan pada papan cetakan miring sampai memadat. b. Pembuatan Medium demannrogosa Sharpe Broth (MRSB) Komposisi : Peptone 10 g Lab-Lemco powder 8 g Yeast extract 4 g Glucose 20 g Sorbiton Mono-oleate 1 ml Dipotasium hydrogen phosphate 2 g Sodium acetate 3H 2 O 5 g Triammonium citrate 2 g Magnesium Sulphate 7H 2 O 0,2 g Manganese Sulphate 4H 2 O 0,05 g Akuades add 1000 ml Cara pembuatan: Sebanyak 52 Gram MRS broth dilarutkan ke dalam 1000 ml akuades dalam labu Erlenmeyer, dihomogenkan dengan hot plate dan magnetic stirrer sampai homogen. ph media diukur sekitar 6,2 ± 0,2 dengan mencelupkan kertas ph universal ke dalam media MRSA, apabila ph media terlalu asam maka ditambahkan NaOH 1 N dan apabila terlalu basa maka ditambahkan HCl 1 N. Media MRSB dituang ke dalam tabung reaksi sebanyak 8 ml, kemudian ditutup dengan cotton plug, dilanjutkan dengan sterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 ºC tekanan 2 atmosfer selama 15 menit xxiii
c. Pembuatan Medium King B Komposisi Protease Pepton K 2 HPO 4 MgSO 4 Gliserol Akuades Agar 20 gr 1,5 gr 1,5 gr 10 gr 1000 ml 20 gr Cara pembuatan: Sebanyak 53 Gram King B dilarutkan ke dalam 1000 ml akuades dalam labu Erlenmeyer, dihomogenkan dengan hot plate dan magnetic stirrer sampai homogen. ph media diukur sekitar 7,2 ± 0,2 dengan mencelupkan kertas ph universal ke dalam media MRSA, apabila ph media terlalu asam maka ditambahkan NaOH 1 N dan apabila terlalu basa maka ditambahkan HCl 1 N. Media MRSB dituang ke dalam tabung reaksi sebanyak 8 ml, kemudian ditutup dengan cotton plug, dilanjutkan dengan sterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 ºC tekanan 2 atmosfer selama 15 menit xxiv
Lampiran 4. Pembuatan Starter S. thermophillus, L. bulgaricus dan B. bifidum (Koroleva, 1991) S. thermophillus (St) L. bulgaricus (Lb) atau B.bifidum (Bb) Susu bubuk skim 8.5 gr + sukrosa 10 gr Susu bubuk skim 8.5 gr + akuades 100 ml + ekstrak ragi 0.1 gr + akuades 100 ml Sterilisasi (tindalisasi) Medium tumbuh (A) 1.0% St/Lb/Bb dalam pepton 0.1% Media tumbuh (B) (OD ± 0.5) inkubasi 12 jam. 37 o C inkubasi 24 jam. 37 0 C Kultur Induk Kultur Induk 3 ml kultur induk + media 3 ml kultur induk + media tumbuh (A) 97 ml tumbuh (B) 97 ml inkubasi 6 jam. 37 o C Feed Starter inkubasi 12 jam. 37 o C Feed Starter 3 ml feed starter + media 3 ml feed starter + media tumbuh (A) 97 ml tumbuh (B) 97 ml inkubasi 6 jam. 37 o C Bulk Starter inkubasi 12 jam. 37 o C Bulk Starter xxv
Lampiran 5. Tahapan Kerja Uji Aktivitas Enzim Protease Bahan Sampel Standar Kontrol 1. Ekstrak enzim kasar 0,5 ml - 0,5 ml 2. Buffer tris-hcl (0,005 M ph 7) 0,5 ml - 0.5 ml Divorteks dan diinkubasi 37 o C, 5 menit 1. TCA 0,4 M - - 1 ml 2. 2% kasein dalam 0,05 M buffer fosfat ph 7 0,5 ml - 0,5 ml Diinkubasi 37 o C, 10 menit 1. TCA 0,4 M 1 ml - - Divorteks dan disentrifuge selam 10 menit, 4000 rpm 1. Supernatan 0,5 ml - 0,5 ml 2. Tirosin dengan - 0,5 ml - berbagai konsentrasi 3. Na 2 CO 3 0,5 M 2,5 ml 2,5 ml 2,5 ml Dihomogenkan dan diinkubasi 37 o C, 5 menit 1. Folin ciocalteu 0,5 ml 0,5 ml 0,5 ml Dihomogenkan dan diinkubasi 37 o C, 30 menit Diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometri λ= 660 nm Dihitung aktivitasnya xxvi
log sel Kadar asam laktat (%) Lampiran 6. Kadar Asam Laktat Rata-Rata Yoghurt Berbagai Konsentrasi Starter yang Disimpan Selama 30 hari 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 A0 A1 A2 A3 1,00 0,00 0 5 10 15 20 25 30 Lama Penyimpanan (hari) Lampiran 7. Rata-Rata Total Bakteri Asam Laktat Yoghurt Berbagai Konsentrasi Starter yang Disimpan Selama 30 hari 10,00 9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 A0 A1 A2 A3 0,00 0 5 10 15 20 25 30 lama penyimpanan (Hari) xxvii
Log sel Lampiran 8. Rata-Rata Total Bakteri Psikrotrofik Yoghurt Berbagai Konsentrasi Starter yang Disimpan Selama 30 Hari 9,00 8,00 7,00 6,00 5,00 4,00 3,00 A0 A1 A2 A3 2,00 1,00 0,00 0 5 10 15 20 25 30 lama penyimpanan (Hari) Keterangan: A 0 : 3 % Starter S. thermophillus : 3 % L. Bulgaricus : 0 % B. bifidum (1:1:0) A 1 : 3 % Starter S. thermophillus : 3 % L. Bulgaricus : 1,5 % B. bifidum (1:1:0,5) A 2 : 3 % StarterS. thermophillus : 3 % L. Bulgaricus : 3 % B. bifidum (1:1:1) A 3: 3 % Starter S. thermophillus : 3 % L. Bulgaricus : 4,5 % B. bifidum (1:1:1,5) xxviii
Lampiran 9. Gambar Hasil Pembuatan Inokulum dan starter S. thermophillus, L. bulgaricus dan B. bifidum Inokulum Starter Yoghurt B. bifidum hari ke-0 Yoghurt B. bifidum hari ke-30 xxix
Lampiran 10. Gambar Hasil Pengukuran Aktivitas Protease, Kadar Asam Laktat Yoghurt dan Perhitungan Total BAL dan Bakteri Psikrotrofik Hasil Pengukuran Kadar Asam Laktat Yoghurt Hasil Uji Aktivitas Protease Bakteri Psikrotrofik pada Yoghurt Bakteri Asam Laktat Yoghurt pada Medium MRSA Bakteri Psikrotrofik pada Medium King s B xxx
Absorbansi Lampiran 11. Kurva Standar Uji Aktivitas Protease Data Hasil Absorbansi Pengukuran Aktivitas Protease Ulangan Konsentasi (Mm) 1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 abs 0.1455 0.244 0.3635 0.504 0.5885 0.76 0.8665 0.9635 1 1 1 KURVA STANDAR TIROSIN 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 y = 1,2354x + 0,001 R² = 0,9976 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 Konsentrasi (mm) Data Hasil Rata-Rata Uji Aktivitas Protease Bakteri Psikrotrofik pada Yoghurt selama Hari Aktivitas Protease (U/ml) A0 A1 A2 A3 0 0.00 0.00 0.19 0.24 5 7.02 6.23 4.48 4.07 10 7.18 5.80 3.91 2.10 15 4.64 4.99 1.13 0.08 20 3.13 2.70 0.00 0.00 25 2.98 0.00 0.00 0.00 30 0.00 0.00 0.00 0.00 A 0 : 3% Starter S. thermophillus : 3% L. bulgaricus : 0% B. bifidum (1:1:0) A 1 : 3% Starter S. thermophillus : 3% L. bulgaricus : 1,5% B. bifidum (1:1:0,5) A 2 : 3% Starter S. thermophillus : 3% L. bulgaricus : 3% B. bifidum (1:1:1) A 3 : 3% Starter S. thermophillus : 3% L. bulgaricus : 4,5% B. bifidum (1:1:1,5) xxxi