METODOLOGI Waktu dan Tempat Pelaksanaan Penelitian Bahan dan Alat

Transkripsi

1 29 METODOLOGI Waktu dan Tempat Pelaksanaan Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan April 2011 hingga Maret Penelitian dilakukan di Laboratorium Departemen Ilmu dan Teknologi Pangan Fakultas Teknologi Pertanian IPB, Laboratorium Mikrobiologi SEAFAST Center IPB, serta Laboratorium Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Pascapanen Pertanian Bogor. Bahan dan Alat Bahan baku yang digunakan adalah pisang varietas uli yang diperoleh dari pedagang pisang di Kabupaten Bogor. Derajat kematangan pisang adalah tua, masih mentah (belum masak) dan kulit berwarna hijau. Perkiraan umur pisang adalah 90 hari setelah tanaman pisang berbunga. Bahan-bahan lain yang digunakan adalah kultur bakteri asam laktat L. plantarum BSL (dahulu L. plantarum sa28k) yang diperoleh dari koleksi pribadi peneliti di Laboratorium Mikrobiologi Pangan Ilmu dan Teknologi Pangan IPB, L. acidophilus dan B.bifidum yang diperoleh dari Koleksi Food Nutrition Collection Center (FNCC) UGM, bahan baku untuk yoghurt seperti susu skim, gula pasir, dan kultur untuk membuat yoghurt yaitu L. bulgaricus dan S. thermophilus. Bahan kimia dan enzim yang digunakan yaitu etanol, alkohol 96% dan 70%, buffer fosfat, buffer sodium asetat (0.1 M ph 5.2), pankreatin SIGMA P-7545, amiloglukosidase SIGMA, HCl 25%, NaOH 25%, etanol 95%, NaOH 0,1 N, asam asetat, Iod, dietil eter, dinitrosalisilat, Na-K tartarat, Na 2 CO 3, dan bahan-bahan kimia lain untuk analisis. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf, pendingin, oven kabinet, alat penggiling tepung (disc mill), refrigerator, inkubator suhu 37 C, waterbath, spektrofotometer, jar anoksomat, ph-meter, serta peralatan gelas laboratorium seperti neraca analitik, cawan petri, tabung reaksi, vorteks, erlenmeyer flasks, pipet mohr, pipet volumetrik, pipet mikro, bulb, labu takar, dan media agar untuk pertumbuhan dan analisis hasil bakteri yaitu MRSA, MRSB, dan PCA.

2 30 Tahapan Penelitian Penelitian dilakukan dalam lima tahap yaitu 1) fermentasi irisan pisang uli dengan perlakuan fermentasi terkendali menggunakan inokulum L. plantarum BSL pada konsentrasi 10 4 dan 10 6 CFU/ml dan waktu fermentasi 0, 6, 12, dan 24 jam. 2) Pembuatan tepung pisang uli modifikasi (TPUM) dengan kondisi fermentasi seperti pada tahap 1 kemudian sampel dipanaskan (121 C, 15 menit) dan didinginkan pada suhu 4-6 C selama 24 jam. Sampel kemudian dikeringkan dan dihaluskan sampai menjadi TPUM 100 mesh. Fermentasi spontan dilakukan sebagai kontrol. 3) Isolasi RS3 dari TPUM dengan perlakuan fermentasi terkendali yang menghasilkan kadar RS3 tertinggi, 4) Evaluasi sifat prebiotik RS3 tepung pisang uli modifikasi terhadap viabilitas tiga jenis BAL probiotik b(b. bifidum, L. acidophilus dan L. plantarum BSL), dan viabilitas starter yoghurt (L. bulgaricus dan S. thermophilus), serta 5) Aplikasi dan formulasi tepung pisang pada pembuatan yoghurt sinbiotik serta analisis sifat kimia (ph, TAT), total BAL dan evaluasi sensori. Tahap 1 Fermentasi Irisan Pisang Uli Fermentasi Terkendali Pembuatan tepung pisang uli modifikasi mengikuti prosedur Jenie et al (2010) seperti terlihat pada Gambar 3. Irisan pisang uli direndam dalam aquades steril (perbandingan pisang uli : akuades steril = 3 : 4) kemudian difermentasi secara terkendali menggunakan inokulum L. plantarum BSL pada konsentrasi 10 4 CFU/ml dan 10 6 /ml selama 0; 6; 12; dan 24 jam. Pada setiap interval waktu fermentasi diukur ph, jumlah BAL, dan jumlah bakteri mesofilik dari cairan irisan pisang fermentasi. Setelah difermentasi, sampel lalu diberi perlakuan pemanasan bertekanan pada suhu 121 C selama 15 menit, lalu didinginkan (retrogradasi) pada suhu 4 C selama 24 jam. Selanjutnya irisan dikeringkan menggunakan oven (50 C) selama 30 jam sampai kadar air 12%. Fermentasi Spontan Irisan pisang uli direndam dalam aquades steril (perbandingan pisang uli : akuades steril = 3 : 4) kemudian difermentasi (spontan) selama 24 jam. Pengukuran ph, total bakteri mesofilik dan total BAL dilakukan pada jam ke-0 dan jam ke-24 fermentasi.

3 31 Tahap 2 Pembuatan Tepung Pisang Uli Modifikasi (TPUM) Setelah difermentasi, irisan pisang uli kemudian dipanaskan (121 C, 15 menit) dan didinginkan pada suhu 4-6 C selama 24 jam. Sampel kemudian dikeringkan dan dihaluskan sampai menjadi TPUM 100 mesh. Fermentasi spontan dilakukan sebagai kontrol. Irisan pisang uli (±6 mm) Fermentasi 1. Terkendali : Irisan pisang direndam dalam akuades steril dengan perbandingan irisan pisang : akuades (3 : 4) - Konsentrasi L.plantarum BSL : 10 4 CFU/ml dan 10 6 CFU/ml - Waktu fermentasi: 0, 6, 12, 24 jam 2. Spontan (kontrol): Irisan pisang direndam dalam akuades steril dengan perbandingan irisan pisang : akuades (3 : 4) Penirisan Pemanasan bertekanan (autoklaf) 121 C 15 menit Pendinginan ± 4 C, 24 jam Pengeringan oven 50 C 30 jam sampai kadar air maks. 12% Penepungan sampai ukuran 100 mesh Tepung pisang Uli modifikasi (TPUM) Analisis kadar RS3 (Englyst et al 1992) Gambar 3 Pembuatan TPUM (Jenie et al 2009)

4 32 Tahap 3 Isolasi RS3 dari TPUM dengan perlakuan fermentasi terkendali yang menghasilkan kadar RS3 tertinggi TPUM yang dihasilkan dianalisis kadar RS3-nya dengan metode Englyst et al (1992) dan ditentukan satu perlakuan fermentasi terkendali yang menghasilkan kadar RS3 tertinggi. TPUM dengan kadar RS3 tertinggi yang dihasilkan dari kondisi optimum selanjutnya diisolasi RS3-nya dengan metode modifikasi Englyst et al (1992). RS3 yang diperoleh kemudian diuji sifat prebiotiknya dengan menguji viabilitas tiga jenis BAL probiotik dan dua jenis starter yoghurt pada media yang mengandung RS3 sebanyak 2.5%, seperti yang dijelaskan pada Tahap 4. Tahap 4 Evaluasi sifat prebiotik RS3 tepung pisang uli modifikasi terhadap viabilitas tiga jenis BAL probiotik dan starter yoghurt Persiapan Kultur Bakteri Asam Laktat (Jenie et al 2009) Kultur B. bifidum, L. acidophilus, dan L. plantarum BSL serta kultur yoghurt (L. bulgaricus dan S. thermophilus) diambil dari agar miring dan disegarkan ke dalam 10 ml MRSB steril. MRSB lalu dimasukkan ke dalam inkubator suhu 37 C selama 24 jam. Setelah 24 jam, sebanyak 1 ml kultur disegarkan lagi ke dalam 9 ml MRSB steril. MRSB diinkubasi kembali selama 24 jam pada suhu 37 C. Sebanyak 1 ml kultur umur 24 jam dari masing-masing bakteri dipipet dan dimasukkan dalam 9 ml larutan pengencer buffer fosfat ph 7.2 dan divorteks untuk pengenceran Pengenceran dilakukan sampai 10-6 dan 10-8 dengan cara yang sama. Pemupukan dilakukan secara duplo pada pengenceran menggunakan MRSA dalam cawan petri. Cawan petri diinkubasi pada suhu 37 C dalam posisi terbalik. Perhitungan koloni dilakukan setelah 48 jam berdasarkan metode BAM (2001) dalam satuan CFU/ml. Uji Viabilitas BAL Probiotik dan Kultur Starter Yoghurt pada RS3 (Jenie et al 2006) Kultur awal dari tiga strain BAL yang sudah ditentukan: L. acidophilus, L. plantarum BSL dan B. bifidum serta kultur yoghurt (L. bulgaricus dan S. thermophilus) berumur 24 jam diencerkan hingga jumlah bakteri awal adalah 10-6

5 33 CFU/ml, lalu diambil sebanyak 5% (v/v) dan dimasukkan ke dalam enam jenis media cair steril untuk pengujian aktivitas prebiotik. Media tersebut adalah m- MRSB (MRSB tanpa glukosa), m-mrsb+2.5% FOS, m-mrsb+2.5% RS3 TPUM fermentasi terkendali, m-mrsb+2.5% RS3 TPUM fermentasi spontan, akuades steril + 2.5% RS3 TPUM fermentasi terkendali, dan akuades steril + 2.5% RS3 TPUM fermentasi spontan. Diagram alir pengujian sifat prebiotik dari RS3 tepung pisang uli modifikasi yang dihasilkan disajikan pada Gambar 4. 3 jenis kultur probiotik: 1. L.plantarum BSL 2. L.acidophilus 3. B. bifidum kultur starter yoghurt yang terdiri dari: 1. L. bulgaricus 2. S. thermophilus (umur 24 jam, pada konsentrasi 10 6 CFU/ml) Diambil kultur sebanyak 5% (v/v) dari bobot media dan ditumbuhkan selama 24 jam pada enam jenis media pertumbuhan: 1. m-mrsb (MRSB tanpa glukosa), kontrol 2. m-mrsb + 2.5% FOS 3. m-rmsb + 2.5% RS3 TPUM fermentasi terkendali 4. m-mrsb + 2.5% RS3 TPUM fermentasi spontan 5. Akuades steril + 2.5% RS3 TPUM fermentasi terkendali 6. Akuades steril + 2.5% RS3 TPUM fermentasi spontan Pemupukan ke media MRSA (umur inkubasi 0 dan 24 jam dari media pertumbuhan) Inkubasi selama 48 jam Perhitungan jumlah koloni (BAM 2001) Gambar 4 Diagram alir uji sifat prebiotik RS3 TPUM Sebanyak 1 ml kultur BAL dipipet dan dimasukkan ke dalam 9 ml larutan pengencer buffer fosfat dan divorteks untuk pengenceran Pemupukan dilakukan secara duplo pada pengenceran menggunakan MRSA

6 34 (metode agar tuang) dalam cawan petri. Cawan petri diinkubasi pada suhu 37 C dalam posisi terbalik. Perhitungan koloni dilakukan setelah 48 jam berdasarkan metode BAM (2001) dalam satuan cfu/ml. Tahap 5 Aplikasi dan formulasi tepung pisang pada pembuatan yoghurt sinbiotik serta analisis sifat kimia (ph, TAT), total BAL dan evaluasi sensori Isolat probiotik terpilih lalu diaplikasikan pada pembuatan yoghurt sinbiotik. Tepung pisang modifikasi digunakan sebagai bahan pensubstitusi susu skim dalam pembuatan yoghurt TPUM (Saputra 2011). Probiotik terpilih lalu diaplikasikan pada pembuatan yoghurt, bersama-sama dengan kultur untuk membuat yoghurt yaitu Lactobacillus bulgaricus dan S. thermophilus pada perbandingan 1:1. Yoghurt dibuat dengan cara sebagai berikut: Disiapkan susu skim merk Sunlack yang telah disubstitusi dengan 70% tepung pisang uli modifikasi (TPUM), 5% glukosa dan dilarutkan dengan 100 ml akuades steril. Kemudian susu dipanaskan dengan api kecil hingga mencapai suhu C tapi tidak sampai mendidih selama lebih kurang 30 menit. Setelah mencapai suhu yang diinginkan, susu didiamkan dan didinginkan hingga mencapai C. Setelah tercapai suhu tersebut, starter yoghurt dimasukan ke dalam susu sebanyak 2% dari volume akhir susu sambil diaduk untuk mencampurkannya. Pada suhu ini aktivitas bakteri akan tinggi dan bisa menghasilkan yoghurt yang baik serta menghasilkan asam yang cepat. Diharapkan ph yang dihasilkan dari proses ini adalah 4,4-4,5. Campuran susu dan kultur/bakteri yang diinkubasi disimpan dalam kulkas dan dibiarkan selama 24 jam. Tujuannya agar tercapai pembentukan teksturnya. Perlakuan penambahan strain probiotik terpilih dilakukan pada setelah pemeraman 24 jam di lemari pendingin, dengan memberikan perlakuan pasteurisasi terlebih dahulu. Prosedur pembuatan yoghurt disajikan pada Gambar 5. Yoghurt (sinbiotik) yang dihasilkan dianalisis total BAL, ph, total asam tertitrasi (TAT)-nya dan dilakukan juga evaluasi sensori pada panelis semi terlatih. Analisis ini dilakukan pada minggu ke-0 dan minggu ke-4 penyimpanan.

7 g TPUM formula terpilih, 3.6 g susu skim, 5 g gula pasir lalu ditepatkan sampai 100 ml dengan akuades steril Pasteurisasi suhu 90 C ± 30 menit Didinginkan pada suhu kamar hingga suhu C Inokulasi kultur starter yoghurt L.bulgaricus dan S. thermophilus dengan perbandingan 1:1 (masing-masing sebanyak 15 ml) Diinkubasi pada suhu 37 C selama 12 jam Yoghurt Tanpa pasteurisasi (kontrol) Pasteurisasi (90 C, 30 menit) Penambahan kultur probiotik (kontrol) Yoghurt TPUM sinbiotik Analisis ph, TAT, total BAL, dan evaluasi sensori (0 dan 4 minggu) Gambar 5 Diagram alir proses pembuatan yoghurt (modifikasi metode Tamime & Robinson 2002)

8 36 Metode-metode Kadar Air, Metode Oven (AOAC 1999) Cawan kosong dikeringkan dalam oven selama 15 menit, lalu didinginkan dalam desikator, dan ditimbang. Sebanyak 4-5 gram sampel ditimbang dalam cawan yang telah diketahui bobot kosongnya, lalu dikeringkan dalam oven pengering suhu 105 C selama 6 jam. Cawan dan isinya didinginkan dalam desikator, lalu ditimbang. Pengeringan dilakukan kembali hingga diperoleh berat konstan. Kadar air dihitung berdasarkan kehilangan berat yaitu selisih berat awal sampel sebelum dikeringkan dengan berat akhir setelah dikeringkan. Hasil analisis dinyatakan dalam berat kering. Kadar air (% bk) = W 3 x 100%, W 2 Kadar air (% bb) = W 3 x 100% W 1 Keterangan : W 1 = bobot sampel sebelum dikeringkan (g) W 2 = bobot sampel setelah dikeringan (g) W 3 = W 1 W 2 Pengukuran ph (AOAC 1999) Sebelum digunakan, ph-meter dikalibrasi terlebih dahulu dengan menggunakan buffer fosfat ph 4 dan ph 7. Ukur ph sampel sampai terbaca nilainya pada layar monitor ph-meter. Total Bakteri Mesofilik (BAM 2001) Bakteri mesofilik dihitung dengan metode agar tuang menggunakan plate count agar (Oxoid). Sampel sebanyak 1 ml diambil dan diencerkan dengan 9 ml larutan buffer fosfat ph 7,2 dan dilakukan pengenceran sampai Sebanyak 1 ml hasil pengenceran 10-6, 10-7, dan 10-8 lalu dipipet dan dilakukan pemupukan (plating) dengan cara metode tuang (pour plate) pada media PCA. Inkubasi dilakukan pada suhu ±30 C selama 2-3 hari serta dihitung jumlah koloni yang tumbuh.

9 37 Total Bakteri Asam Laktat (AOAC 1999) Sampel sebanyak 1 ml diambil dan diencerkan dengan 9 ml buffer fosfat ph 7.2 dan dilakukan pengenceran sampai Sebanyak 1 ml hasil pengenceran 10-6, 10-7, dan 10-8 diambil dan dilakukan pemupukan (plating) dengan cara metode tuang (pour plate) pada mdia MRSA (Oxoid). Inkubasi dilakukan secara anaerob pada suhu 37 C selama 48 jam serta dihitung jumlah koloni yang tumbuh pada media tersebut. Khusus untuk penghitungan koloni B. bifium, setelah pemupukan dilakukan pengkondisian lingkungan bebas O 2 terlebih dahulu dengan memasukkan cawan ke dalam Jar Anoksomat dalam posisi terbalik. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 C selama 48 jam dan dilakukan penghitungan koloni. Perhitungan Total Koloni (BAM 2001) Merujuk pada penentuan Aerobic Plate Count (BAM 2001), perhitungan koloni dilakukan setelah waktu inkubasi dalam satuan CFU/ml. N = c (n1 x1) + (n2 x 0.1) + (n3 x 0.01) x d Total Asam Laktat Tertitrasi (AOAC 1999) N = Jumlah koloni mikroba (CFU/ml) c = Jumlah koloni dari semua pengenceran n1 = Jumlah cawan pada pengenceran pertama n2 = Jumlah cawan pada pengenceran kedua n3 =Jumlah cawan pada pengenceran d ketiga = pengenceran terendah yang jumlah koloni bakterinya masih dapat dihitung (25-250) Bahan ditimbang sebanyak 5 gram, ditambahkan aquades sebanyak 100 ml sampai batas tera kemudian dihomogenkan. Sampel diambil 25 ml dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Campuran ini ditambahkan indikator PP untuk uji total asam sebanyak 2 hingga 3 tetes. Sampel kemudian dititrasi dengan larutan NaOH 0,1 N hingga terjadi perubahan warna menjadi merah muda. NaOH distandarisasi terlebih dahulu menggunakan asam oksalat. ml NaOH x N NaOH x BM x FP Berat Bahan x 1000 % Total Asam = x100 % Keterangan: BM asam laktat = 90.08

10 38 Persiapan Sampel TPUM Bebas Lemak dan Gula Sederhana Sebanyak tiga gram TPUM dicuci dengan menggunakan etanol 80% sebanyak ±30 ml secara maserasi untuk menghilangkan gula-gula sederhana pada suhu kamar selama 15 menit. Suspensi disaring dengan kertas saring dan residu dicuci dengan akuades sampai volume filtrat mencapai 250 ml. Residu kertas saring dicuci 5 kali dengan 10 ml eter untuk menghilangkan lemak. Selanjutnya sampel dibiarkan untuk menguapkan eter dari residu dan dicuci lagi dengan 150 ml alkohol 10% untuk membebaskan lebih lanjut karbohidrat yang terlarut. Residu pada kertas saring kemudian dikeringkan dengan menggunakan sinar matahari selama 3-4 jam. TPUM bebas lemak dan gula sederhana ini selanjutnya digunakan dalam analisis kadar total pati dan kadar RS3. Kadar Total Pati (AOAC 1999) Analisis kadar pati dilakukan dengan metode hidrolisis langsung oleh asam (Direct Acid Hyrolysis). Sebanyak 0.5 g sampel TPUM bebas lemak dan gula-gula sederhana ditimbang dan dimasukkan ke dalam Erlenmeyer. Ke dalamnya lalu ditambahkan 25 ml akuades dan 5 ml HCl 25%. Erlenmeyer ditutup dengan pendingin balik dan dipanaskan di atas penangas air yang mendidih selama 2.5 jam. Setelah dingin larutan yang terbentuk dinetralkan dengan NaOH 25%, disaring, ditepatkan pada ph 7, dan ditepatkan volumenya hingga 100 ml. Penentuan kadar pati dinyatakan sebagai glukosa pada filtrat. Total glukosa dianalisis dengan menggunakan metode DNS. Sampel kemudian diambil sebanyak 1 ml dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian ditambahkan 2 ml pereaksi DNS. Setelah itu dipanaskan dalam waterbath suhu 100 C selama 10 menit lalu didinginkan pada suhu ruang. Sampel kemudian diencerkan dengan penambahan 10 ml akuades dan absorbansi diukur pada panjang gelombang 550 nm. Akuades digunakan sebagai blanko. Kurva standar dibuat menggunakan larutan glukosa standar dengan larutan glukosa 5000 ppm sebagai larutan induk. Larutan kerja yang digunakan sebagai standar adalah 500 ppm, 1000 ppm, 1500 ppm, 2000 ppm, 2500 ppm, 3000 ppm, 3500 ppm, 4000 ppm, 4500 ppm, dan 5000 ppm. Berat pati diperoleh dengan mengalikan berat glukosa dengan faktor koreksi 0.9.

11 39 Kadar glukosa dihitung dgn rumus sebagai berikut: A I FP % Pati = x x100x0. 9 S W Dimana: A = Absorbansi sampel I = intersep kurva S = Slope/kemiringan kurva FP = Faktor pengenceran W = Berat sampel (g) Kadar RS3 (metode Englyst et al 1992) Tepung pisang modifikasi yang telah bebas lemak dan gula sederhana (1 gram) dalam 20 ml buffer sodium asetat (0.1 M, ph 5.2) dipanaskan dalam waterbath selama 30 menit. Suspensi pati didinginkan pada suhu 37 C, dicampur dengan larutan enzim (5 ml) yang terdiri dari ekstrak pankreatin dan amiloglukosidase (AMG), dan diinkubasi dalam waterbath pada suhu 37 C. Ekstrak pankreatin diperoleh dari 3 g pankreatin disuspensi dalam 20 ml air deionisasi, distirrer selama 10 menit pada suhu ruang, dan disentrifus pada 1500 g selama 10 menit. Larutan enzim dipersiapkan dengan mencampurkan 13.5 ml supernatan ekstrak penkreatin, 210 U AMG, dan 1 ml air deionisasi. Pati yang cepat dicerna (RDS) dinyatakan sebagai total pati yang dicerna selama 20 menit pertama, dan pati yang lambat dicerna (SDS) dinyatakan sebagai total pati yang dicerna antara 20 dan 120 menit. Sebanyak 1 ml sampel diambil lalu ditambahkan 2 ml pereaksi DNS. Setelah itu dipanaskan dalam penangas air dengan suhu air 100 C selama 10 menit lalu didinginkan pada suhu ruang. Sampel kemudian diencerkan dengan penambahan 10 ml akuades dan diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm. Akuades digunakan sebagai blanko. Kurva standar dibuat menggunakan larutan glukosa standar, yaitu 5000 ppm sebagai larutan induk. Larutan kerja yang digunakan sebagai standar adalah 500 ppm, 1000 ppm, 1500 ppm, 2000 ppm, 2500 ppm, 3000 ppm, 3500 ppm, 4000 ppm, 4500 ppm, dan 5000 ppm. Persen pati diperoleh dengan mengkalikan persen glukosa dengan faktor koreksi 0.9. Kadar RS3 (RS) dihitung berdasarkan persamaan :

12 40 ( Totalpati RDS SDS ) % RS3 = x100 Totalpati Keterangan : RDS = Rapid Digestible Starch SDS = Slowly Digestible Starch Isolasi RS3 (metode modifikasi Englyst et al 1992) Isolasi RS3 dilakukan dengan menggunakan metode Englyst et al (1992) yang dikombinasi dengan metode Gravimetri (AOAC 1999). TPUM bebas lemak dan gula-gula sederhana sebanyak 5 g ditempatkan dalam tabung sentrifus. Sampel dicuci dengan menggunakan 40 ml etanol 80% selanjutnya disentrifus pada 554 x g selama 10 menit dan diulang tiga kali. Endapan yang merupakan pati ditambah 100 ml buffer sodium asetat (0.1 M ph 5.2) selanjutnya ditambah 25 ml larutan enzim yang mengandung ekstrak pankreatin dan amiloglukosidase. Sampel diinkubasi dalam inkubator bergoyang pada suhu 37 C selama 120 menit, kemudian disentrifus untuk mendapatkan endapan yang merupakan RS3. Endapan ini dikeringkan sampai diperoleh RS3 kering. Larutan enzim disiapkan menurut metode Schmiedl et al (2000) dengan cara mensuspensikan 12.0 g pankreatin (Sigma, Cat. No.P7545) ke dalam 80 ml air deionisasi, selanjutnya distirer selama 10 menit pada suhu ruang dan disentrifus pada 1500 x g selama 10 menit. Sebanyak 54 ml supernatan pankreatin ditambah amiloglukosidase 210U (Sigma, Cat. No.A7095) dan 6 ml air deionisasi sampai diperoleh 60 ml larutan enzim dan diulang sampai diperoleh larutan enzim yang cukup. Analisis Statistik Semua perlakuan dilakukan sebanyak dua kali ulangan. Rata-rata data hasil penelitian diolah secara statistik dengan menggunakan analisis sidik ragam (ANOVA), yang dilanjutkan dengan uji Duncan pada taraf signifikansi 5% apabila hasil yang diperoleh berbeda nyata antar sampel dengan menggunakan Software SPSS 16.0 Production Facility. Rancangan yang digunakan adalah rancangan acak lengkap 2 ulangan. Model linear rancangan acak lengkap yang digunakan adalah sebagai berikut:

13 41 Yij = µ + αi + έij dimana Yij = Pengamatan ke-j, perlakuan ke-i µ = Rataan untuk semua µi αi = Pengaruh faktor ke-i έij = Galat (error)