76 Lampiran Prosedur uji aktivitas protease (Walter 984, modifikasi) Pereaksi Blanko (ml) Standard (ml) Contoh ml) Penyangga TrisHCl (.2 M) ph 7. Substrat Kasein % Enzim ekstrak kasar Akuades steril Tirosin standar (mm).2.2.2 Diinkubasi pada suhu ruang selama menit 2 2.2.2 Asam trikloroasetat (%) 2 Akuades steril.2 Ekstrak kasar enzim Dinkubasi pada suhu C selama menit selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 86 xgselama menit Filtrat Na 2 CO 3 (. M) Folin Ciocalteau (:2)... Dikocok kuat dan didiamkan selama menit, absorbansi diukur pada λ = 78 nm A contoh A blanko Unit Aktivitas (UA) = x P x /T A standar A blanko Keterangan : UA A contoh A standar A blanko P T = Unit aktivitas (jumlah enzim yang dapat menghasilkan satu mikromol produk tirosin permenit, pada kondisi uji) = nilai absorbansi contoh = nilai absorbansi standar = nilai absorbansi blanko = faktor pengenceran = waktu inkubasi
77 Lampiran 2 Prosedur uji aktivitas amilase (Bernfeld 99) Pereaksi Blanko (ml) Standar (ml) Contoh (ml) Substrat (pati terlarut %) Enzim DNS Aquades Dikocok dan diinkubasi menit pada suhu ruang DNS Enzim Dikocok dan dipanaskan pada C selama menit, kemudian didinginkan dalam air selama 2 menit, diukur absobansi pada λ = nm UA = Konsentrasi maltosa sampel x FP BM maltosa x Vx T Keterangan : UA = unit aktivitas enzim FP = faktor pengenceran BM = berat molekul ( BM maltosa =36.32 Da) V = volume sampel enzim T = waktu inkubasi
78 Kurva Standar Maltosa Konsentrasi Maltosa (ppm) 2 3 4 Absorban ratarata (l= nm).47.7.64.7.794.8 Absorban terkoreksi (l= nm).98.8.227.322.377 Persamaan regresi linear Y =.74X.9,4,4,3,3,2,2,,,, y =,74x,9 R² =,99 2 3 4
79 Kurva standar protein Kosentrasi BSA Absorban ratarata (mg ml ) (λ=9 nm).24.2.32.4.36.6.4.8.46..3 Absorban terkoreksi (λ= 9 nm).8.2.8.22.29,3 Absorbansi (λ = nm),3,2,2,,, y = 2.736x +.69 R 2 =.98,,, Konsentrasi BSA (mg ml )
8 Lampiran 3 Pertumbuhan sepuluh Bacillus terseleksi pada media pakan udang (SF).2 % Kode isolat Jumlah sel (CFU ml )* jam 24 jam 48 jam L3 9. x 3. x 2.3 x L 2.3 x 4.8 x 2.7 x KAt. 6.2 x 4. x.6 x KPs 7..2b 8. x 2. x 4.9 x KAs 7..2 2.6 x 2. x 3. x DP.. 4.2 x. x DP..2.9 x 9.9 x DA 2.2. 3.4 x 8.3 x DA.2.3.4 x 9.6 x * Jumlah ratarata dari 2 ulangan 6 3 2 3 2 2 3 2 2.9 x.2 x 3.3 x 3 6. x Lampiran 4 Aktivitas protease Bacillus sp. L dan DA.2.3 Kode L DA.2.3 Waktu (jam) 24 Aktivitas Aktivitas Kadar Protein (U ml ) (mg ml Spesifik ) ( U mg ).22 ±.2. ±. 2.3 ±.32.6 ±.93.4 ±. 36.72 ±. L DA.2.3 48.4±.3 2. ±.37.6 ±..4 ±. 22.9 ±.9 4.9 3 ± 9.9 L DA.2.3 72.74 ±..72 ±..6 ±..7 ±..46 ±.3 26.32 ±. L DA.2.3 96.3±..7 ±.2. ±..6 ±. 2.3 ±. 3.6 ± 2.6
8 Lampiran Aktivitas amilase Bacillus sp. L dan DA.2.3 Kode L DA.2.3 Waktu (jam) 24 Aktivitas Aktivitas Kadar Protein (U ml ) (mg ml Spesifik ) ( U mg ).4 ±.7. ±. 9. ±.38 2.6 ±.4.4 ±. 47.27 ±. L DA.2.3 48.38 ±.. ±..6 ±..4 ±. 6.29 ±.27 3.7 ±.32 L DA.2.3 72. ±..9 ±.7.6 ±..7 ±..79 ±.9 8.47 ±.4 L DA.2.3 96.2 ±.2. ±..6 ±. 3.4 ±.64
82 Lampiran 6 Pengaruh waktu produksi protease, amilase dan pertumbuhan sel Bacillus sp. DA.2.3 Waktu (jam) 2 Aktivitas Aktivitas Amilase Spesifik (U ml ) Potease (U mg ).2 ±.3 2.6 ± 2.79 Aktivitas Protease (U ml ).2 ±. Aktvitas Spesifik Protease (U mg ).2 ±. Jumlah sel (log CFU ml ) 8.38 ±.2 24.22 ±.8 22. ±.74.2 ±.3.8 ±. 9.34 ±.4 36.9 ±.24 6.7 ± 3.73. ±.3. ±.3 2.7 ±.3 48.77 ±. 6.7 ± 3.. ±..7 ±. 3. ±.27 6.6 ±.23 7.38 ± 3.84.8 ±.4.8 ±.4 3.8 ±.33 72.8 ±.7.8 ±.77.4 ±.2.37 ±.2 3.73 ±.2 84.78 ±. 4. ±.48.6 ±..6 ±..4 ±.36 96.44 ±.7 7.2 ±.3.4 ±.6.42 ±.6.83 ±.39 Lampiran 7 Aktivitas protease Bacillus sp. DA.2.3 pada rentangan ph ph Aktivitas Kadar Protein Aktivitas Spesifik Aktivitas Relatif (U ml ) (mg ml ) (U mg) (%) 6 7 8 9.22 ±..76 ± 2. ±.8. ±..6 ±..7 ±..6 ±..7 ±. 3.3 ±.62. ±.4 33..3 ± 4.26 7. ±.33.66 ±. 33.3 ±.8 ± 2.7 ±.2 Lampiran 8 Aktivitas amilase Bacillus sp. DA.2.3 pada rentangan ph ph 6 7 8 9 Aktivitas (U ml ) 2.3 ±.7.8 ±..6 ±..6 ±.29 Kadar Protein Aktivitas Spesif Aktivitas Relatif (mg ml ) (U mg ) (%).6 ±. 4.9 ± 7.8 ±.7 ±. 6. ±.83 4.49 ± 3.9.6 ±. 8.44 ±.7 47.73 ± 9.2. 7±. 9.87 ± 6.9 22. ±.39 Lampiran 9 Aktivitas protease Bacillus sp. DA.2.3 pada rentangan salinitas
83 Salinitas Aktivitas Kadar Protein Aktivitas Spesifik Aktivitas Relatif (U ml ) (mg ml) (U mg ) (%). 2. 3..74 ±.4.62 ±..4 ±.. ±.2.6 ±. 3.29 ±.94.7 ±. 9.6 ±.42.6 ±. 7.92 ±.84.7 ±. 8.8 ±.88 ± 73.8 ± 8.3 6.32 ±.8 66. ±.96 Lampiran Aktivitas amilase Bacillus sp. DA.2.3 pada rentangan salinitas Salinitas (%) Aktivitas Kadar Protein Aktivitas Spesifik Aktivitas Relatif (U ml ) (mg ml ) (U mg ) (%). 2. 3..77 ±.3.6 ±.2.3 ±.3.7 ±..6 ±. 3.72 ±.29.7 ±. 24.2 ±.84.6 ±. 2.2 ± 2.62.7 ±. 2.2 ±.82 6.69 ±.7 ± 82.83 ± 7.94.9 ±.3 Lampiran Stabilitas protease Bacillus sp. DA.2.3 pada ph 8, salinitas (kondisi optimum reaksi enzim) Waktu nkubasi (jam) Aktivitas Protease Aktivitas Relatif (U ml ) (%).2 ±. ±.6 ±. 33.3 ± 8.9 2.47 ±.4 384.8 ± 43.8 3.3 ±. 24.7 ±. 4.28 ±.4 227. ± 28.69.23 ±. 87.7 ± 3.62 6.9 ±.2.7 ± 4.89 Lampiran 2 Stabilitas protease Bacillus sp. DA.2.3 pada kondisi umum tambak udang (ph 8, salinitas 2.%) Waktu Inkubasi (jam) 2 3 4 6 Aktivitas Relatif Aktivitas Protease (U ml ) (%).7 ±. ±.6 ±.2 8.29 ± 9.3.8 ±. 82.22 ±.78.46 ±. 6.28 ±.44.32 ±.2 7.2 ± 2..27 ±.2 47. ± 3.69.7 ±.3 38. ± 3.8 Lampiran 3 Stabilitas amilase Bacillus sp. DA.2.3 pada kondisi
84 ph 6, salinitas.% (optimum) Waktu Inkubasi (jam) 2 3 4 6 Aktivitas Relatif Aktivitas (U ml ) (%). ±.2. ±.37 ±. 24.44 ± 8.7.2 ±. 3.67 ±.8.2 ±. 9.92 ±.96.3 ±.2 93.69 ± 7.92.83 ±.6 7.9 ± 3.8.77 ±. 69.8 ± 7. Lampiran 4 Stabilitas amilase Bacillus sp. DA.2.3 pada kondisi umum tambak (ph 8, salinitas 2.%) Waktu nkubasi (jam) Aktivitas Protease Aktivitas Relatif (U ml ) (%).26 ±. ±..78 ±..28 ± 36. 2.4 ±. 2.94 ±.7 3.28 ±..94 ± 3.66 4.3 ±. 9.84 ± 9.2.3 ±. 2.69 ± 9.23 6.22 ±.2 23. ± 3.8 Lampiran Komposisi larutan untuk SDSPAGE Pembuatan Larutan. Larutan A : larutan Akrilamid ml 3% (w/v) akrilamid,.8% (w/v) bisakliramid a. 29.29 gram akrilamid b..89 gram bisakrilamid Kedua bahan diatas ditambah dengan air destilata sampai ml diaduk sampai larut sempurna. Larutan ini dapat disimpan dalam refrigerator selama beberapa bulan. 2. Larutan B : (bufer gel pemisah 4x) ml a. 2 M Tris HCL (ph 88) 7 ml b. % SDS 4 ml (.4%) c. H 2 O 2 ml Stabil disimpan beberapa bulan dalam refrigerator 3. Larutan C a..m TrisHCl (ph 6.8) ml b. % SDS 4 ml (.4%) c. H 2 O 4. ml Stabil disimpan beberapa bulan dalam refrigerator
8 4. Ammonium Persulfat %, ml a.. g ammonium persulfat b. H 2 O ml Stabil disimpan beberapa bulan dalam tabung tertutupdalam refrigerator. Bufer eleksoforesis, L a. 3 g Tris 2 mm b. 4.4 g glisin 2 mm c. SDS gr.% d. Tambahkan H 2 O menjadi L ph sekitar 8.3, stabil disimpan pada suhu ruang 6. Bufer sampel x, ml a. M Tris HCl.6 ml (ph 6.8) 6 mm b. Gliserol % ml c. SDS % 2 ml 2% d. 2 merkaptoetanol.ml e. Bromophenol blue %, ml f. H 2 O.9 ml Stabil disimpan beberapa minggu dalam refrigerator atau beberapa bulan pada 2 C Penghitungan X % gel pemisah Larutan A X/3 ml Larutan B 2. ml H 2 O 7.. X/3) ml % Ammonium persulfat µl TEMED µl ( µl jika X<8) Total volume ml Persiapan gel pemisah (8%) 2.7 ml larutan A 2. ml larutan B 4.8 ml H 2 O µl % Ammonium persulfat ml TEMED Persiapan gel penahan H 2 O 2.3 ml Larutan A.67 ml Larutan C ml Lampiran 6 TSS dari kultur Bacillus sp. DA.2.3 pada media pakan udang (SF)
86.2% A. Bacillus sp. DA.2.3 Waktu N Berat akhir (gr) Berat Awal (gr) Volume (ml) RerataTSS Penurunan TSS ± SE ( hari) ( Spl + K) (K) ( Spl) (mg L ) (%).3. 2.4.2 74 ±.3. 2.4. 366 22 ± 89 2.4.2 2 2.2. 2 889 49±4 3.6.4 2 2.4.2 2 868 ±76 4.3. 2 2.4.3 2 842 2±49 Keterangan: N = ulangan Spl = sampel TSS = total suspended solid K = kertas saring SE = standard error B. Bacillus sp. SP Waktu N Berat akhir (gr) Berat Awal (gr) Volume RerataTSS Penurunan TSS ±SE ( hari) (Spl + K) (K) Spl (ml) (mg L ) (%).3. 2.3. 743 ±73.4. 2.4. 2 739 ±39 2.4. 2 2.3. 2 37 2±46 3.4.2 2..4 986 4±98 4..3 2..3 2 836 ±32
87 A. Kontrol (tanpa bakteri) Waktu N Berat akhir (gr) Berat awal (gr) Volume RerataTSS Penurunan TSS±SE ( hari) (Spl + K) (K) Spl (ml) (mg L ) (%).3. 2.3. 7 ±43.4. 2 2.4. 2 7 ±67 2.7.4 2 2..2 2 393 2±92 3.6.3 2 2.3. 2 366 22±46 4.6.3 2 2.4.2 2 36 2± Lampiran 7 Sekuen 6s rrna Bacillus sp. DA.2.3 > Bacillus sp. DA.2.3 AAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATA ACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATT GAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTG AGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCAC ACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCG CAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCG TAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACG GT ACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGG TGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTC TGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAG TGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAG GAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGC GTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCT AAGTGTTAGAGGGTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGG GGAGTACGGCCCCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGT GGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTC TGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGG TTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTT GATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGG AGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGT GCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAA ACCGTTCTTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTA GTAATCGCGGA
88 Lampiran 8 Hasil analisis Blast sekuen gen penyandi 6S rrna Bacillus sp. DA.2.3 Nomor akses Spesies Bacillus homolog % Permintaan terpenuhi % kesamaan maksimum GU 2426. GU 242. GU37. EU33328. EU3332. Gen 6S rrna Bacillus cereus strain IMAU84 Gen 6S rrna Bacillus cereus strain IMAU83 Gen 6S rrna Bacillus sp. PS(29) Gen 6S rrna Bacillus cereus strain DBT3ST4 Gen 6S rrna Bacillus sp. Pc6 99 99 99 99 99