BAB III METODE PENELITIAN Metode penelitian yang dilakukan adalah penelitian deskriptif. 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian Penyiapan sampel dilakukan di Laboratorium Kimia Farmasi Kualitatif Fakultas Farmasi USU dan pengukuran kadar dilakukan di POM Majelis Ulama Indonesia (MUI) dan dilakukan dari bulan Maret-April 2011. 3.2 Bahan-Bahan Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini berkualitas pro analisa keluaran E. Merck antara lain larutan standar Pb 1000 mcg/ml, larutan standar Cd 1000 mcg/ml, asam nitrat 65% b/v dan aquabidest. 3.3 Alat-Alat Spektrofotometri Serapan Atom (AA-6300), lampu katoda timbal dan kadmium 10 ma (GBC D2), neraca listrik (AND GF-200), hot plate (Lab. Compagnion), kertas saring whatman no. 42, alat-alat gelas (pyrex) dan blender. 3.4 Rancangan Penelitian 3.4.1 Pengambilan Sampel Sampel diambil secara sampling purposif yang dikenal juga sebagai sampling pertimbangan dimana pengambilan sampel dilakukan berdasarkan pertimbangan bahwa populasi sampel adalah homogen (Sudjana, 2001). Sampel yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan dan saus nya. Pengambilan sampel dilakukan di beberapa tempat yaitu di supermarket Carefour, supermarket Medan Plaza dan supermarket Medan Mall.
3.4.2 Proses Destruksi Basah Sampel dihaluskan untuk setiap perlakuan, ditimbang masing-masing sebanyak 25 g dalam erlenmeyer. Sampel yang telah diketahui beratnya selanjutnya lalu ditambahkan HNO 3 65% b/v sebanyak 25 ml dan diamkan selama 24 jam. Setelah 24 jam, panaskan diatas hot plate pada suhu ±110 o C hingga terbentuk larutan sampel berwarna kuning jernih. Hasil dekstruksi yang diperoleh dimasukkan kedalam labu tentukur 25 ml. Dicukupkan volumenya sampai garis tanda dengan akuabides, dan dihomogenkan. Kemudian disaring dengan kertas saring Whatman No 42, dan dibuang ±10 % filtrat pertama dan filtrat selanjutnya ditampung ke dalam botol (Haswell,1991). Kemudian dilakukan uji kuantitatif. 3.4.3 Pemeriksaan Kuantitatif 3.4.3.1 Pembuatan Larutan Standar Timbal Larutan standart Timbal (Pb) 1000 µg/ml dipipet sebanyak 10 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, kemudian ditambahkan 10 ml HNO3 5N, ditepatkan sampai garis tanda dengan akuabides (konsentrasi 100 µg/ml). Larutan standart Timbal (Pb) 100 mcg/ml dipipet sebanyak 10 ml, dimasukkan dalam labu tentukur 100 ml, kemudian ditambahkan 10 ml HNO3 5N, ditepatkan sampai garis tanda dengan akuabidest (konsentrasi 10 µg/ml). 3.4.3.2 Pembuatan Larutan Standar Cadmium Larutan standart Kadmium (Cd) 1000 µg/ml dipipet sebanyak 10 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, kemudian ditambahkan 10 ml HNO3 5N,ditepatkan sampai garis tanda dengan akuabides (konsentrasi 100 µg/ml). Larutan standart Kadmium (Cd) 100 µg/ml dipipet sebanyak 10 ml, dimasukkan
dalam labu tentukur 100 ml, kemudian ditambahkan 10 ml HNO3 5N, ditepatkan sampai garis tanda dengan akuabidest (konsentrasi 10 µg/ml). 3.4.3.3 Pembuatan Kurva Kalibrasi Timbal Larutan baku timbal (10 µg/ml) dipipet masing-masing sebanyak 1,00 ml; 1,50 ml; 4,00 ml; 6,00 ml; 8,00 ml lalu dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, kemudian ditambahkan 10 ml larutan HNO 3 5 N dan ditepatkan sampai garis tanda dengan akuabidest (larutan kerja ini mengandung 0,1 µg/ml; 0,15 µg/ml; 0,4 µg/ml; 0,6 µg/ml; dan 0,8 µg/ml) dan diukur pada panjang gelombang 283.3 nm. 3.4.3.4 Pembuatan Kurva Kalibrasi Kadmium Larutan baku Kadmium (Cd) 10 µg/ml dipipet masing-masing sebanyak 1,00 ml; 2,00 ml; 3,00 ml; 4,00 ml; 5,00 ml lalu dimasukkan kedalam labu tentukur 100 ml, ditambahkan 10 ml HNO3 5N kemudian ditepatkan sampai garis tanda dengan akuabidest (larutan kerja ini mengandung 0,1 µg/ml; 0,2 µg/ml; 0,3 µg/ml; 0,4 µg/ml; dan 0,5 µg/ml) dan diukur pada panjang gelombang 228,8 nm. 3.4.4 Penentuan Kadar Timbal dan Kadmium rumus : Penentuan kadar Pb dan Cd dalam larutan sampel dapat ditentukan dengan CxVxFp Kadar Logam (µg/g) = W Keterangan : C = Konsentrasi (µg/ml) V = Volume larutan sampel (ml) Fp = Faktor Pengenceran W = Berat Sampel (g)
3.4.5 Validasi Metode Analisis 3.4.5.1 Penentuan Limit of Detection (LOD) dan Limit of Quantitation (LOQ) Batas deteksi atau Limit of Detection (LOD) adalah jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon yang signifikan. Batas kuantitasi atau Limit of Quantitation (LOQ) merupakan kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama. Batas deteksi dan batas kuantitasi dapat dihitung berdasarkan dengan rumus sebagai berikut : SY/X = ( Y Yi) n 2 2 LOD = 3 x SY / slope X LOQ = 10 x SY / slope X Keterangan : LOD = Limit of Detection (µg/ml) LOQ = Limit of Quantitation (µg/ml) SY/X = Simpangan Baku Residual (Harmita,2004) 3.4.5.2 Uji Akurasi dengan Persen Perolehan Kembali (%Recovery) Uji perolehan kembali atau recovery dilakukan dengan metode adisi karena matriks sampel tidak diketahui sehingga tidak memungkinkan untuk membuat sampel plasebo. Metode ini dilakukan dengan cara menambahkan sejumlah larutan standar dengan konsentrasi tertentu pada sampel yang diperiksa, lalu dianalisis. Persen perolehan kembali ditentukan dengan menentukan berapa
persen analit yang ditambahkan tadi dapat diperoleh kembali (Harmita, 2004). Larutan baku yang ditambahkan yaitu, 10 ml larutan baku Pb dengan konsentrasi 0,4 µg/ml dan 5 ml larutan baku Cd dengan konsentrasi 0,2 µg/ml kedalam sampel. Masing-masing dilakukan sebanyak 6 kali replikasi kemudian dianalisis dengan perlakuan yang sama seperti pada awal penetapan kadar sampel. Persen perolehan kembali (% recovery) dapat dihitung dengan rumus dibawah ini: Dimana: % Recovery = C*A (CF-CA) x 100% CF = Konsentrasi total sampel setelah penambahan baku (µg/ml) CA = Konsentrasi sampel sebelum penambahan baku (µg/ml) C*A = Konsentrasi analit yang ditambahkan (µg/ml) 3.4.5.3 Uji Presisi Presisi atau keseksamaan merupakan ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual ketika suatu metode dilakukan secara berulang untuk sampel yang homogen. Percobaan keseksamaan dilakukan terhadap paling sedikit 6 replikan sampel. Presisi diukur sebagai standar deviasi (SD) dan standar deviasi relatif (RSD). Nilai standar deviasi relatif yang memenuhi persyaratan menunjukkan adanya keseksamaan metode yang dilakukan. Menurut Rochman (2007), rumus untuk menghitung Standar deviasi relative (RSD) adalah: SD RSD = 100% X
Keterangan : X SD RSD = Kadar rata-rata sampel = Standar Deviasi = Relative Standard Deviatio 3.4.6 Analisis Data Secara Statistik Untuk menghitung standar deviasi (SD) digunakan rumus: SD = (x-x )2 n-1 Distribusi ti hitung dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut : t = x -x SD n Dasar penolakan data jika t hitung t tabel. 3.4.7 Menentukan Rentang Kadar Timbal dan Kadmium Rentang kadar sebenarnya yang diperoleh dari hasil pengukuran masingmasing 6 larutan sampel, ditentukan rata-ratanya secara statistik dengan taraf kepercayaan 95% dengan α= 0,05 dengan rumus sebagai berikut: µ = X ± s n (Wibisono, 2005) t(1 2α, df )
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Pemeriksaan Kuantitatif 4.1.1 Kurva Kalibrasi Timbal dan Cadmium Kurva kalibrasi logam timbal diperoleh dengan cara mengukur absorbansi dari larutan standar logam timbal. Logam timbal diukur pada panjang gelombang 283,3 nm. Berdasarkan pengukuran kurva kalibrasi tersebut, maka diperoleh persamaan garis regresi untuk timbal yaitu: Y = 0,01247x + 0,000001 dengan koefisien korelasi (r = 0,9999) Data hasil pengukuran absorbansi larutan standar timbal serta contoh perhitungan persamaan garis regresi dapat dilihat pada Lampiran 1 hal. 33. 0,012 0,01 Kurva Kalibrasi Pb Absorbansi 0,008 0,006 0,004 0,002 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Konsentrasi (µg/ml) Gambar 2. Kurva kalibrasi Pb Kurva kalibrasi logam kadmium diperoleh dengan cara mengukur absorbansi dari larutan standar logam kadmium. Logam kadmium diukur pada panjang gelombang 228,8 nm. Berdasarkan pengukuran kurva kalibrasi tersebut,
maka diperoleh persamaan garis regresi untuk timbal yaitu: Y = 0,0491x + 0,0002143 dengan koefisien korelasi (r = 0,9997) Data hasil pengukuran absorbansi larutan standar kadmium serta contoh perhitungan persamaan garis regresi dapat dilihat pada Lampiran 2 hal. 35. 0,03 0,025 Kurva Kalibrasi Cd Absorbansi 0,02 0,015 0,01 0,005 0 0 0,2 0,4 0,6 Konsentrasi (µg/ml) Gambar 3. Kurva kalibrasi Cd Harga koefisien korelasi (r) yang mendekati 1 dari masing masing kurva kalibrasi Pb dan Cd menunjukkan adanya korelasi antara konsentrasi dengan absorbansi. 4.1.2 Kadar Timbal dan Cadmium Dalam Sampel Penetapan kadar Pb dan Cd dilakukan secara spektrofotometri serapan atom, dimana sampel terlebih dahulu dilarutkan dalam pelarut yang sesuai. Untuk Pb dan Cd 25 g sampel dilarutkan dalam HNO 3 65% (b/v) dalam labu tentukur 25 ml. Dan diukur pada spektrofotometer serapan atom masing masing pada panjang gelombang yang memberikan absorbansi maksimum. Kadar Pb dan Cd diperoleh dari persamaan garis regresi larutan standarnya (dapat dilihat pada tabel 2 dan tabel 3).
Tabel 2. Data kadar Pb (µg/g) pada sampel No Sampel Berat Sampel (g) Kadar (µg/g) Rentang Kadar (µg/g) 25,005 0,1041 25,002 0,1202 1 Sampel Botan (SB) 25,003 0,0961 0,1042 ± 0,01041 25,007 0,0881 25,005 0,1122 25,003 0,1042 25,002 0,1763 25,003 0,1924 2 Sampel Finna (SF) 25,007 0,1843 0,1783 ± 0,01219 25,002 0,1603 25,005 0,1843 25,002 0,1683 25,005 0,2565 25,003 0,2886 3 Sampel Vinisi (SV) 25,002 0,2485 0,2605 ± 0,03039 25,003 0,3126 25,008 0,2484 25,005 0,2966 Keterangan : Hasil yang diperoleh merupakan rata-rata dari 6 kali ulangan Hasil diatas menunjukkan bahwa sampel ikan kaleng mengandung logam toksik Pb.
Tabel 3. Data kadar Cd (µg/g) pada sampel No Sampel Berat Sampel (g) Kadar (µg/g) Rentang Kadar (µg/g) 25,005 0,0485 25,002 0,0546 1 Sampel Botan (SB) 25,003 0,0506 0.0506 ± 0,00046 25,007 0,0465 25,005 0,0567 25,003 0,0485 25,002 0,1442 25,003 0,1401 2 Sampel Finna (SF) 25,007 0,1503 0.1437 ± 0,00309 25,002 0,1421 25,005 0,1462 25,002 0,1421 25,005 0,1014 25,003 0,0994 3 Sampel Vinisi (SV) 25,002 0,0974 0,1004 ± 0,00138 25,003 0,0994 25,008 0,1096 25,005 0,1014 Keterangan : Hasil yang diperoleh merupakan rata-rata dari 6 kali ulangan Hasil diatas menunjukkan bahwa sampel ikan kaleng mengandung logam toksik Cd.
4.2 Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Untuk melihat kadar terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan dan kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi kriteria cermat dan seksama, maka dilakukan perhitungan batas deteksi dan batas kuantitasi (Ermer, J dan Miller,2005). Hasil pengukuran batas deteksi dan batas kuantitasi pada logam Pb dan Cd dapat dilihat pada lampiran 3 dan 4. Hasil pengujian sampel untuk pemeriksaan Pb diperoleh konsentrasi ratarata SB, SF, dan SV adalah 0,1042 µg/ml; 0,1777 µg/ml; 0,2752 µg /ml (lampiran 13), dimana LOD 0,0182 µg/ml dan LOQ 0,0606 µg/ml (lampiran 7). Pemeriksaan Cd diperoleh konsentrasi rata-rata SB, SF dan SV adalah 0,0509 µg /ml; 0,1442 µg/ml; 0,1014 µg/ml (lampiran 14), dimana LOD 0,0139 µg /ml dan LOQ 0,0464 µg/ml (lampiran 8). Hasil yang diperoleh pada pengukuran sampel berada diatas batas deteksi dan batas kuantitasi. Sehingga penetapan kadar Pb dan Cd memenuhi persyaratan (data selengkapnya dapat dilihat pada lampiran 3 dan 4). 4.3 Uji Validasi Validasi metode menurut USP 30 tahun 2007 dilakukan untuk menjamin bahwa metode analisis yang digunakan akurat, spesifik, reproduksibel dan tahan pada kisaran analit yang akan dianalisis. Adapun uji validasi yang digunakan yaitu persen perolehan kembali (% recovery) dengan membuat konsentrasi analit dengan penambahan baku 10 ml (0,4 µg/ml) untuk Pb dan dengan penambahan baku 5 ml (0,2 µg/ml) untuk Cd.
Tabel 4. Tabel Uji Perolehan Kembali Logam Pb dan Cd No Logam yang dianalisis Kadar standar yang ditambahkan Kadar Total (µg/g) Kadar awal (µg/g) % Recovery 0,1599 0,4088 0,2565 95,24% 0,1599 0,4409 0,2886 95,24% 0,1599 0,4009 0,2485 95,31% 1 Pb 0,1599 0,4650 0,3126 95,30% 0,1599 0,4008 0,2484 95,31% 0,1599 0,4489 0,2966 95,25% KT = 0,4276 KA= 0,2752 95,27% 0,0399 0,1382 0,1014 92,23% 0,0399 0,1361 0,0994 91,97% 0,0399 0,1341 0,0974 91,97% 2 Cd 0,0399 0,1361 0,0994 91,97% 0,0399 0,1463 0,1095 92,23% 0,0399 0,1382 0,1014 92,20% KT = 0,1382 KA= 0,1014 91,90% Hasil yang didapat dari uji perolehan kembali untuk Pb 95,27%, dan Cd 91,90%. Persen perolehan kembali ini dapat diterima karena memenuhi syarat akurasi dimana rentang rata-rata hasil perolehan kembali adalah antara 80-120% (Ermer, J dan Miller,2005 ). 4.4 Uji Presisi Uji presisi atau uji keseksamaan dilakukan terhadap sampel SB,SF dan SV dengan perulangan sebanyak 6 kali. Diperoleh nilai simpangan Baku dan % Relatif Standar Deviasi dapat dilihat pada tabel dibawah ini
Tabel 5. Hasil Uji Presisi No. Logam 1. Pb 2. Cd Kadar rata-rata (µg/g) SD RSD 0,4276 0,0276 6,4546 % 0.1382 0,0051 3,6903 % Menurut Harmita (2004) kriteria seksama diberikan jika memberikan nilai standar deviasi relatif untuk analit dengan kadar satu per seribu RSD nya adalah tidak lebih dari 5% dan untuk analit dengan kadar satu per sejuta (ppm) RSDnya adalah tidak lebih dari 16%.Dari hasil yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa metode yang dilakukan mempunyai akurasi yang baik. (data selengkapnya dapat dilihat pada lampiran 19, dan 22).
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan 1. Sampel ikan kaleng mengandung logam berat timbal (Pb) dan kadmium(cd). 2. Hasil penetapan kadar dengan menggunakan spektrofotometer serapan atom menunjukkan bahwa kadar timbal pada sampel SB adalah 0,1042 µg/g, sampel SF adalah 0,1777 µg/g, dan sampel SV adalah 0,2752 µg/g Kadar timbal dalam sampel tidak melebihi ambang batas yang telah ditentukan yaitu sebesar 0,3 mg/kg. Kadar kadmium pada sampel SB adalah 0,0509 µg/g, sampel SF adalah 0,1442 µg/g, dan sampel SV adalah 0,1014 µg/g. Kadar Cd pada sampel SB tidak melebihi ambang batas sedangkan dalam sampel SF dan SV kadar melebihi ambang batas maksimum kadmium yaitu sebesar 0,1 mg/kg. 5.2 Saran Disarankan kepada peneliti selanjutnya agar melanjutkan penelitian ini dengan variasi sampel makanan kaleng jenis lain yang sering dikonsumsi oleh masyarakat.