POTENSI SENYAWA 2-HIDROKSINIKOTINIL SERIN METIL OKTANOIL ESTER DAN 2-HIDROKSINIKOTINIL OKTILAMIDA SEBAGAI ANTIKANKER HARIYANTI

PTESI SEYAWA 2-HIDRKSIIKTIIL SERI METIL KTAIL ESTER DA 2-HIDRKSIIKTIIL KTILAMIDA SEBAGAI ATIKAKER HARIYATI SEKLAH PASCASARJAA ISTITUT PERTAIA BGR BGR 2010

PERYATAA MEGEAI TESIS DA SUMBER IFRMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Potensi senyawa 2-Hidroksinikotinil Serin Metil ktanoil Ester dan 2-Hidroksinikotinil ktilamida sebagai Antikanker adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, 2 Juni 2010 Hariyanti IM G451070061

ABSTRACT HARIYATI. Potency of the novel compounds of 2-hydroxynicotinyl serine methyl octanoyl ester and 2-hydroxynicotinyl octylamide for anticancer. Under the supervision of SUMIAR S. ACHMADI and MUHAMMAD HAAFI. The novel compounds of 2-hydroxynicotinyl serine methyl octanoyl ester (SME) and 2-hydroxynicotinyl octylamide (A) were synthesized by modifying of the UK-3A compound known biologically active to inhibit bacterial and cancer cells growth. Based on e-docking value of -11.12 kcal/mol (log P 1.49) for SME and e-docking -10.46 kcal/mol (log P 2.50) for A, synthesis of these two compounds were carried out in two-step reaction for the first compound and one step reaction for the second compound. The synthesis of SME started by amidation reaction between L-serine methyl ester and 2-hydroxynicotinic acid yielded 87.8% of 2-hydroxynicotinyl serine methyl ester, which was further esterified with octanoic acid yielded 74.5% of SME. verall yield of SME was 65.4%. A was synthesized by amidation reaction between 2-hydroxynocotinic acid and octylamin yielded 76.1% of the product. The compound were confirmed with Fourier transformed infrared spectrometry, liquid chromatography mass spectroscopy, and nuclear magnetic resonance spectrometry. In vitro test to murine leukemia P-388 cells and breast cancer T47D demonstrated that the inhibition to growth of cancer cells with IC 50 for SME,and A were 10.0; 3.19, and 32.0; 4.67 µg/ml, respectively. The IC 50 values indicated that the synthesis products were sufficiently potential to be anticancer for murine leukemia P-388 cells and breast cancer T47D. Keywods: anticancer, UK-3A analog, SME, A, murine leukemia P-388, breast cancer T47D

RIGKASA HARIYATI. Potensi senyawa 2-Hidroksinikotinil Serin Metil ktanoil Ester dan 2-Hidroksinikotinil ktilamida sebagai Antikanker. Dibimbing oleh SUMIAR S. ACHMADI dan MUHAMMAD HAAFI. Senyawa UK-3A telah berhasil diisolasi dari miselium Streptomyces sp. 517-02 dan diketahui mempunyai aktivitas sebagai antibiotik, antifungal, dan antikanker. Senyawa UK-3A mempunyai aktivitas dalam menghambat pertumbuhan sel kanker, salah satunya adalah sel kanker leukemia murin P-388 dengan nilai IC 50 38 μg/ml. Struktur senyawa UK-3A telah dimodifikasi dan menghasilkan beberapa senyawa analog baru. Analog senyawa UK-3A tersebut belum mempunyai aktivitas dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukemia murin P-388 yang optimum. Sampai tahun 2009, penelitian senyawa analog UK-3A tercatat aktivitas dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukemia murin P-388 yang paling baik didapatkan pada senyawa analog UK-3A, yaitu senyawa 3-hidroksilpikolinil serin metil oktanoil ester (PSME) dengan aktivitas dalam menghambat pertumbuhan sel kanker tersebut sebesar IC 50 15,4 μg/ml dan senyawa 3-hidroksipikolinil oktilamida (PA) dengan aktivitas dalam menghambat pertumbuhan sel kanker tersebut sebesar IC 50 13,2 μg/ml. Dari hasil penelitian tersebut perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk mendapatkan aktivitas antikanker yang optimum IC 50 < 10 μg/ml dengan meragamkan struktur PSME dan PA. Pada penelitian ini dilakukan modifikasi struktur PSME dan PA dengan menggantikan substituen pikolinil dengan substituen nikotinil sehingga akan terjadi perbedaan posisi gugus aktif hidroksil dan diuji aktivitas keduanya dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukemia murin P-388 dan sel kanker payudara T47D. Untuk mengevaluasi kesesuaian senyawa yang disintesis (ligan) dengan reseptor (protein Bcl-xL), dilakukan proses docking dengan menggunakan program ArgusLab versi 4,0. Penelitian tesis ini bertujuan memperoleh senyawa analog UK-3A baru, yaitu senyawa 2-hidroksinikotinil serin metil oktanoil ester (SME), dan 2- hidroksinikotinil oktilamida (A) dan mengukur aktivitas antikanker senyawa hasil sintesis secara in vitro terhadap sel kanker leukemia murin P-388 dan sel kanker payudara T47D. Penelitian ini dilaksanakan dalam 5 tahap: (a) penentuan nilai e-docking dan log P SME dan A, (b) sintesis SME dan A, (c) identifikasi hasil sintesis dengan spektrofotometri inframerah tertransformasi Fourier, kromatografi cair spektroskopi massa, dan resonansi magnetik inti, (d) uji letalitas larva udang, dan (e) uji sitotoksisitas terhadap sel kanker leukemia murin P-388 dan sel kanker payudara T47D. Hasil e-docking dan log P SME dan A berturut-turut adalah -11,12 kcal/mol; log P 1,49 dan -10,46 kcal/mol; log P 2,50. Kedua senyawa tersebut disintesis melalui dua tahap untuk SME dan satu tahap untuk A. Sintesis dimulai melalui reaksi amidasi antara L-serin metil ester hidroklorida dengan asam hidroksinikotinat dan didapatkan senyawa 2-hidroksinikotinil serin metil ester dengan

rendemen sebesar 87,8%, yang selanjutnya diesterifikasi dengan asam oktanoat dan didapatkan senyawa SME dengan rendemen sebesar 74,5%. Rendemen keseluruhan sintesis SME adalah 65,4%. Senyawa A didapatkan melalui reaksi amidasi antara asam-2-hidroksinikotinat dengan oktil amin dan didapatkan produk dengan rendemen sebesar 76,1%. Senyawa hasil sintesis dikonfirmasi menggunakan spektrofotometri inframerah tertransformasi Fourier, kromatografi cair spektroskopi massa, dan resonansi magnetik inti. Hasil identifikasi SME dan A sesuai dengan kedua struktur senyawa tersebut, salah satunya adalah hasil uji cair spektroskopi massa didapatkan kesesuaian bobot molekul SME dan A, yaitu 366,12 dan 250,30 g/mol. Uji toksisitas SME dan A dengan metode BSLT hanya dapat dilakukan untuk A saja karena adanya pengaruh rendahnya kelarutan SME pada air laut meskipun telah dilakukan penambahan DMS. A mempunyai nilai toksisitas 116,9 ppm. Uji toksisitas merupakan uji pendahuluan untuk mendapatkan senyawa bersifat antikanker. Uji aktivitas selanjutnya adalah uji sitotoksisitas SME dan A secara in vitro terhadap sel kanker leukemia murin P-388 dan payudara T47D dan hasilnya memperlihatkan penghambatan pada pertumbuhan sel kanker dengan nilai IC 50 SME, dan A berturut-turut sebesar 10,0; 3,19, and 32,0; 4,67 µg/ml. ilai IC 50 menunjukkan bahwa kedua senyawa hasil sintesis berpotensi sebagai antikanker terhadap sel kanker leukemia murin P-388 dan payudara T47D. Kata kunci: antikanker, analog UK-3A, SME, A, leukemia murin P-388, kanker payudara T47D

PTESI SEYAWA 2-HIDRKSIIKTIIL SERI METIL KTAIL ESTER DA 2-HIDRKSIIKTIIL KTILAMIDA SEBAGAI ATIKAKER HARIYATI Tesis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Kimia SEKLAH PASCASARJAA ISTITUT PERTAIA BGR BGR 2010

Judul Penelitian ama IM : Potensi senyawa 2-Hidroksinikotinil Serin Metil ktanoil Ester dan 2-Hidroksinikotinil ktilamida sebagai Antikanker : Hariyanti : G451070061 Disetujui Komisi Pembimbing Prof. Dr. Suminar S Achmadi Ketua Dr. Muhammad Hanafi Anggota Diketahui Ketua Program Studi Kimia Dekan Sekolah Pascasarjana Prof. Dr. Ir. Latifah K Darusman, MS. Prof. Dr. Ir. Khairil A.otodiputro, MS. Tanggal Lulus: Tanggal Ujian: 29 Juni 2010

@ Hak Cipta milik IPB, tahun 2010 Hak Cipta dilindungi Undang-undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau tunjauan suatu masalah b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB 2. Dilarang keras mengumumkan atau memperbanyak sebaigian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-ya sehingga tesis ini dapat diselesaikan. Tesis ini berjudul Potensi senyawa 2-hidroksinikotinil serin meti oktanoil ester dan 2-hidroksinikotinil oktilamida sebagai antikanker sebagai salah satu syarat yang harus dipenuhi untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Kimia, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Penelitian ini dilaksanakan berlangsung selama 10 bulan, mulai bulan Maret 2009 sampai Februari 2010 bertempat di Pusat Penelitian Kimia Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia dan Jurusan Kimia FMIPA Institut Teknologi Bandung. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr. Suminar S Achmadi dan Dr. Muhammad Hanafi atas semua bimbingan, saran, dan arahannya. Ucapan terima kasih kepada Laboratorium Kimia LIPI, Pusat Penelitian Ilmu dan Teknologi (Puspiptek) yang telah mensponsori penelitian ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada suami tercinta, kedua orang tua serta seluruh keluarga, atas doa, dukungan, dan kasih sayangnya. Semoga tesis ini bermanfaat. Bogor, 2 Juni 2010 Hariyanti viii

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 11 September 1977 dari ayah Ahmad Sa ari dan ibu Murtasiah. Penulis merupakan putri keenam dari tujuh bersaudara. Tahun 1995 penulis lulus dari SMU egeri 1 Serang dan pada tahun yang sama lulus seleksi sebagai mahasiswa Universitas Indonesia melalui jalur Ujian Masuk Perguruan Tinggi egeri. Penulis memilih Program Sarjana Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Jurusan Farmasi. Penulis lulus pendidikan sarjana pada tahun 2000 dan lulus Pendidikan Profesi Apoteker pada tahun 2001. Pada tahun yang sama penulis diterima bekerja sebagai staf pengajar di Jurusan Farmasi Universitas Muhammadiyah Prof. Dr. Hamka. Pada tahun 2002 penulis menikah dengan urman Irawan, S.E., Ak. dan telah dikaruniai satu orang putri bernama Rizki Qanita Irawan, dan satu orang putra bernama Ahmad Fadhillah Yasin Irawan. Tahun 2007 penulis diterima sebagai mahasiswa Program Studi Kimia, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. ix

DAFTAR ISI Halaman ABSTRACT... iii ABSTRAK... iv DAFTAR GAMBAR... xi DAFTAR TABEL... xi DAFTAR LAMPIRA... xii PEDAHULUA 1 Latar belakang... 1 Tujuan Penelitian... 2 Pendekatan Sintesis... 3 TIJAUA PUSTAKA... 5 Hubungan Struktur dan Aktivitas UK-3A... 5 Sintesis Senyawa Analog UK-3A... 7 Perkembangan Sintesis Senyawa Analog UK-3A...11 Sel kanker leukemia murin P-388...14 Sel kanker Payudara T47-D... 14 Uji Toksisitas Letalitas Larva Udang... 15 Uji Sitotoksik Antikanker... 16 BAHA DA METDE... 17 Alat dan Bahan..17 Prosedur... 17 HASIL DA PEMBAHASA...21 ilai e-docking dan Log P Senyawa Analog UK-3A.. 21 Sintesis SME... 23 Sintesis SME... 28 Sintesis A... 33 Letalitas Larva Udang... 38 Sitotoksisitas SME dan A... 38 KESIMPULA DA SARA... 40 DAFTAR PUSTAKA... 41 LAMPIRA... 45 x

DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Retrosintesis senyawa 2-hidroksinikotinil serin metil oktanoil ester... 3 2. Sintesis senyawa 2-hidroksinikotinil serin metil oktanoil ester... 4 3. Retrosintesis senyawa 2-hidroksinikotinil oktilamida... 4 4. Sintesis senyawa 2-hidroksinikotinil oktilamida... 4 5. Struktur senyawa antimisin A 3, senyawa UK 2A dan UK 3A... 6 6. Reaksi sintesis senyawa analog UK-3A... 8 7. Mekanisme reaksi dengan aktivator DCC... 10 8. Mekanisme reaksi pembentukan ester dengan katalis DMAP... 10 9. Reaksi sintesis 3-hidroksipikolinil metil fenil propionil serin ester... 11 10. Struktur inti senyawa analog UK-3A... 12 11. Hasil e-docking senyawa SME menggunakan program ArgusLab Versi 4,0.....21 12. Hasil e-docking senyawa A menggunakan program ArgusLab versi 4,0 22 13. Perkiraan mekanisme reaksi sintesis SME.23 14. Struktur senyawa 2-hidroksinikotinil serin metil ester (SME)...25 15. Perkiraan mekanisme reaksi sintesis SME.. 28 16. Struktur SME....... 30 17. Perkiraan mekanisme reaksi sintesis A....32 18. Struktur senyawa 2-hidroksinikotinil oktilamida (A).....34 DAFTAR TABEL Halaman 1. Aktivitas sitotoksik senyawa UK-3A, UK-2A, dan Antimisin A 3... 12 2. ilai log P, e-docking, dan ujiaktivitas antikanker terhadap sel kanker leukemia murin P388.... 13 xi

3. ilai Log P dan e-docking senyawa target sintesis dan senyawa induk UK3A..14 4. Data pergeseran kimia (δ, ppm) spektrum 1 H-MR (500 MHz) dan 13 C- MR (125 MHz) untuk senyawa SME (CD 3 D)...25 5. Data pergeseran kimia (δ, ppm) spektrum 1 H-MR (500 MHz) dan 13 C- MR (125 MHz) untuk senyawa SME (CD 3 Cl)... 30 6. Data pergeseran kimia (δ, ppm) spektrum 1 H-MR (500 MHz) dan 13 C- MR (125 MHz) untuk senyawa A (CD 3 Cl)... 34 7. Hasil uji sitotoksisitas (IC 50 ) senyawa analog UK-3A terhadap sel kanker leukemia murin P-388 dan sel kanker payudara T47D... 37 DAFTAR LAMPIRA Halaman 1. Hasil analisis Kromatografi Lapis Tipis (KLT)... 45 2. Kromatogram dan spektrum LC-MS senyawa SME, SME, dan A... 47 3. Spektrum FT-IR senyawa serin metil ester hidroklorida, SME, SME, dan A... 50 3. Spektrum 1 H-MR senyawa SME, SME, dan A... 52 5. Spektrum 13 C-MR senyawa SME, SME, dan A... 54 6. Hasil Uji Letalitas Larva Udang... 56 6. Sitotoksisitas secara in vitro...57 xii

1 PEDAHULUA Latar Belakang Banyak upaya telah dilakukan untuk mengatasi penyakit kanker, salah satu di antaranya adalah mencari sumber obat baru. Salah satu upaya penemuan obat baru yang lebih disukai dan banyak dilakukan dalam dunia penelitian adalah pengembangan senyawa aktif atau obat melalui modifikasi struktur senyawa yang telah diketahui aktivitasnya dalam menghambat pertumbuhan sel kanker, untuk mendapatkan senyawa baru dengan mempunyai aktivitas lebih tinggi. Modifikasi molekul mempunyai beberapa keuntungan sebagai berikut: senyawa homolog atau analog kemungkinan besar mempunyai sifat farmakologis yang sama dengan senyawa induk, kemungkinan produk yang dihasilkan mempunyai aktivitas farmakologis yang lebih besar, data yang diperoleh dapat menjelaskan hubungan struktur dan aktivitas, metode sintesis dan uji hayati yang digunakan sama sehingga menghemat waktu dan biaya, dan produksi obat baru menjadi lebih murah. Modifikasi struktur atau membuat senyawa analog yang lebih sederhana banyak dilakukan karena selain lebih cepat, juga lebih murah (Siswandono & Soekarjo 2000). Senyawa UK-3A telah berhasil diisolasi dari miselium Streptomyces sp. 517-02 dan diketahui mempunyai aktivitas sebagai antibiotik, antifungal, dan antikanker. Senyawa UK-3A mempunyai aktivitas dalam menghambat pertumbuhan sel kanker, salah satunya adalah sel kanker leukemia murin P-388 dengan nilai IC 50 38 μg/ml. Pada penelitian sebelumnya telah ditunjukkan bahwa gugus hidroksil (-H), gugus amida (-CH) dan gugus dilakton merupakan gugus yang menunjukkan aktivitas menghambat pertumbuhan bakteri dan sel kanker (Hanafi 1995). Hal ini mendorong perlunya penelitian untuk mensintesis senyawa analog UK-3A yang memiliki aktivitas tinggi sebagai antikanker dengan cara memodifikasi gugus aktif pada senyawa induk UK-3A. Struktur senyawa UK-3A telah dimodifikasi dan menghasilkan beberapa senyawa analog baru. Analog senyawa UK-3A tersebut belum mempunyai aktivitas

2 dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukemia murin P-388 yang optimum. Sampai tahun 2009, penelitian senyawa analog UK-3A tercatat aktivitas dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukemia murin P-388 yang paling baik didapatkan pada senyawa analog UK-3A, yaitu senyawa 3-hidroksilpikolinil serin metil oktanoil ester (PSME) dengan aktivitas dalam menghambat pertumbuhan sel kanker tersebut sebesar IC 50 15,4 μg/ml (Anita et al. 2007) dan senyawa 3- hidroksipikolinil oktilamida (PA) dengan aktivitas dalam menghambat pertumbuhan sel kanker tersebut sebesar IC 50 13,2 μg/ml (Hanafi 2008). Pada penelitian ini dicoba dilakukan modifikasi struktur PSME dan PA dengan menggantikan substituen pikolinil dengan substituen nikotinil sehingga akan terjadi perbedaan posisi gugus aktif hidroksil dan diuji aktivitas keduanya dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukemia murin P-388 dan sel kanker payudara T47D. Untuk mengevaluasi kesesuaian senyawa yang disintesis (ligan) dengan reseptor (protein Bcl-xL), dilakukan proses docking dengan menggunakan program ArgusLab versi 4,0. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan memperoleh senyawa analog UK-3A baru, yaitu senyawa 2-hidroksinikotinil serin metil oktanoil ester (SME), dan 2- hidroksinikotinil oktilamida (A) dan mengukur aktivitas antikanker senyawa hasil sintesis secara in vitro terhadap sel kanker leukemia murin P-388 dan sel kanker payudara T47D.

3 Pendekatan Sintesis Sintesis senyawa 2-hidroksinikotinil serin metil oktanoil ester (SME) dilakukan dengan pendekatan retrosintesis (Gambar 1) dan jalur sintesis (Gambar 2). Gambar 1 Retrosintesis senyawa 2-hidroksinikotinil serin metil oktanoil ester

4 Gambar 2 Sintesis senyawa 2-hidroksinikotinil serin metil oktanoil ester Sintesis senyawa 2-hidroksinikotinil oktil amida (A) dilakukan dengan pendekatan retrosintesis (Gambar 3) dan jalur sintesis (Gambar 4). Gambar 3 Retrosintesis senyawa 2-hidroksinikotinil oktilamida (A) Gambar 4 Sintesis senyawa 2-hidroskinikotinil oktilamida (A)

5 TIJAUA PUSTAKA Hubungan Struktur dan Aktivitas UK-3A Senyawa UK-3A termasuk ke dalam golongan senyawa antibiotik yang diisolasi dari miselium Streptomyces sp. 517-02 oleh Ueki et al. (1997a). Senyawa ini diisolasi dalam bentuk kristal tidak berwarna dengan konfigurasi absolut (+)-(2R, 3R, 4S, 7S, 8R). Struktur senyawa UK-3A ini memiliki kemiripan dengan senyawa antimisin A 3. Antimisin A 3 yang diisolasi dari miselium Streptomyces sp. K01-0031 (Shiomi et al. 2005) memiliki aktivitas sebagai antibiotik dan digunakan sebagai insektisida. Senyawa UK-3A juga memiliki kesamaan struktur dengan senyawa UK- 2A, yaitu memiliki gugus hidroksil, amida, dan dilakton cincin beranggota 9, tetapi senyawa UK-3A tidak memiliki gugus metoksi pada cincin piridin. Berdasarkan penelitian terhadap senyawa UK-3A, diketahui bahwa tidak adanya gugus metoksi pada cincin piridin dapat meningkatkan aktivitasnya sebagai antikanker. UK-3A mempunyai sruktur yang hampir sama dengan struktur UK-2A (Gambar 5). Struktur UK-2A dan UK-3A hanya berbeda pada gugus metoksi yang terikat pada cincin pikolinat sehingga UK-3A dielusidasi sebagai demetoksi UK-2A (Shimano et al. 1998). Struktur senyawa UK-3A juga mempunyai kemiripan dengan struktur senyawa antibiotik yang sudah ditemukan sebelumnya, yaitu antimisin A yang diisolasi dari Streptomyces sp. K01-0031 (Shiomi et al. 2005). Antimisin A 3 diketahui sebagai antibiotik dan juga mempunyai aktivitas yang tinggi dalam menghambat pertumbuhan sel kanker. Antimisin A 3 dapat menginduksi apoptosis sel leukemia HL-60. Bc12 terdapat dalam 90% sel kanker usus, 80% B-sel limfomas, dan 70% sel kanker payudara (Liu et al. 2003). 3

6 Gambar 5 Struktur senyawa antimisin A 3 dan senyawa UK 2A dan UK 3A (Ueki 1997a) Sintesis senyawa analog UK-3A dilakukan dengan mempelajari korelasi antara struktur dan aktivitas hayatinya, yang dapat diperoleh dari data metilasi dan hidrolisis senyawa UK-2A yang mempunyai struktur dan aktivitas hampir sama dengan senyawa UK-3A. Kajian hubungan struktur dan aktivitas hayati senyawa UK- 2A, UK-3A, dan turunannya bertujuan mendapatkan informasi mengenai gugusgugus yang berperan dalam aktivitas hayati. Dari hasil yang diperoleh diharapkan dapat disintesis senyawa analog yang lebih sederhana dan mempunyai aktivitas tinggi (Hanafi et al. 1999). Metilasi senyawa UK-2A dengan diazometana akan menghasilkan senyawa UK-2(Me) dan UK-2(Me) yang mengakibatkan hilangnya aktivitas hayati. Hal ini menunjukkan bahwa gugus hidroksil pada cincin piridin dan H (amida) merupakan gugus yang aktif. Senyawa UK-3A tidak mempunyai gugus metoksi, tetapi tidak mengakibatkan hilangnya aktivitas antibakteri, bahkan meningkatkan kemampuan menghambat pertumbuhan sel kanker. Hidrolisis senyawa UK-2A menggunakan HCl kering dan metanol menghasilkan senyawa yang tidak menunjukkan aktivitas hayati.

7 Hal ini membuktikan bahwa dilakton cincin beranggota-9 merupakan gugus aktif yang bersifat lipofilik (Hanafi et al. 1996). Struktur senyawa UK-3A memiliki gugus hidroksil (-H), dan amida (- CH) yang merupakan gugus aktif yang mempunyai aktivitas yang cukup tinggi sebagai antibakteri dan antikanker. Aktivitas yang tinggi juga ditunjukkan oleh gugus dilakton atau ester yang merupakan gugus yang bersifat lipofilik (Hanafi et al. 1996). Berdasarkan hal tersebut, khususnya hubungan antara struktur kimia dan aktivitas hayati, maka dirancang strategi untuk mensintesis senyawa-senyawa analog UK-3A dengan cara meragamkan posisi dan jenis gugus -H pada cincin aromatik dan gugus dilakton pada senyawa UK-3A, dengan harapan akan diperoleh senyawa baru dengan bahan dasar yang cukup murah, tetapi memiliki aktivitas yang lebih tinggi dan tidak menimbulkan efek samping (Hanafi & Thelma 1998). Sintesis Senyawa Analog UK-3A Telah dilaporkan bahwa senyawa UK-3A mempunyai aktivitas sebagai antimikrob, antifungal, dan sitotoksik terhadap beberapa sel kanker, seperti aktivitas yang ditunjukkan oleh senyawa antimisin A 3 (Shimano et al. 1998). Aktivitas sitotoksik yang ditunjukkan oleh senyawa UK-3A dengan IC 50 sebesar 38 merupakan senyawa yang kurang aktif (IC 50 > 10 µg/ml) sehingga perlu dilakukan sintesis senyawa analog UK-3A yang diharapkan memiliki aktivitas yang lebih baik (Pan et al. 2009). Sintesis senyawa UK-3A dilakukan dengan memodifikasi atau memanipulasi struktur molekul senyawa UK-3A. Modifikasi struktur molekul ini bertujuan mendapatkan senyawa baru yang mempunyai aktivitas lebih tinggi, masa kerja lebih panjang, tingkat kenyamanan lebih besar, efek samping rendah, selektif, dan lebih stabil (Siswandono & Soekardjo 2000). Topliss (Patrick 2005) mengembangkan petunjuk nonmatematis, nonstatistik, dan nonkomputer, yaitu dengan menggunakan prinsip pendekatan hubungan struktur dalam modifikasi struktur induk suatu molekul yang sudah diketahui aktivitasnya. Hal ini dilakukan sebagai upaya untuk mengoptimumkan aktivitas zat dengan efisien.

8 Modifikasi molekul menurut pendekatan Topliss adalah dengan memasukkan gugusgugus yang bersifat lipofilik, elektronik, dan sterik tertentu pada posisi yang tertentu pada suatu molekul induk, dengan ramalan akan menghasilkan senyawa yang memberikan aktivitas yang lebih tinggi, sama, atau lebih rendah dibanding aktivitas senyawa induk, kemudian dicari jalur sintesis yang paling menguntungkan. Sintesis senyawa analog UK-3A dicoba dilakukan dengan mengubah gugus dilakton rantai tertutup menjadi rantai terbuka dengan gugus yang mengandung rantai yang memiliki panjang yang berbeda-beda. Ragam tersebut diharapkan akan memberikan informasi mengenai gugus yang berperan dalam meningkatkan aktivitas senyawa analog UK-3A. Perbedaan sifat lipofilik senyawa diharapkan dapat berpengaruh pada aktivitas hayatinya (Hanafi et al. 1999). Pembukaan cincin dilakton diharapkan dapat mempertinggi aktivitas senyawa ini. Reaksi pembukaan cincin pada UK-2A telah menghasilkan senyawa dengan aktivitas yang cukup tinggi (Usuki et al. 2006). Tahapan reaksi sintesis senyawa analog UK-3A dapat dilihat pada Gambar 6. H 2 H H RH / p-tsh benzena, 110 o C, 24 jam H 2 H R H DMAP DCC/py,55 o C, 24 jam H H H H R PSME RCH DMAP DCC / py, 55 o C, 24 jam H R 2 PSMPE R 1 = -CH 3 R 2 = C 4 H 9 C- PSMBE, R 1 = -CH 3 R 2 = C 3 H 9 C- H R 1 3-hidroksipoklinil-serin-metil-butananoil-ester (PSMBE) dan 3-hidroksipoklinil-serin-metil-pentananoil-ester (PSMPE) Gambar 6 Reaksi sintesis senyawa analog UK-3A (Marlupi 2007)

9 Reaksi yang terjadi dalam sintesis senyawa analog UK-3A adalah reaksi esterifikasi dan amidasi. Metode umum untuk sintesis ester adalah dengan mereaksikan alkohol dengan suatu asam karboksilat. Reaksi ini merupakan reaksi reversibel dan berlangsung lambat. Agar reaksi berjalan satu arah dan lebih cepat digunakan katalis asam. Agar menjadi sempurna, reaksi dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu dengan menggunakan alkohol berlebih dan cara yang kedua dengan memisahkan air yang terbentuk agar tidak terjadi reaksi sebaliknya. Katalis yang biasa digunakan dalam reaksi esterifikasi adalah asam sulfonat dan asam klorida. Selain itu juga dapat digunakan asam p-toluena sulfonat (p-tsh), karbonil diimidazol (CDI), disikloheksilkarbodiimida (DCC), dan dimetil amino piridin (DMAP) (Carey & Sundberg 2007). H CH + R'H R-CR' + H 2 Disikloheksilkarbodiimida (DCC) adalah suatu aktivator dalam reaksi pembentukan ester yang dapat mengubah asam karboksilat menjadi senyawa pengalkilasi yang reaktif. Bagian terpenting dari DCC adalah gugus imida yang memiliki atom karbon pusat yang kekurangan elektron setelah bereaksi dengan proton dari asam karboksilat sehingga dapat diserang oleh suatu agen nukleofilik dan membentuk spesies asilisourea. Gugus asilisourea ini sangat reaktif karena ikatan antara asil dengan oksigen dapat mengubah ikatan rangkap karbon dan nitrogen dari isourea menjadi suatu gugus karbonil yang lebih stabil. leh karena itu pada akhir reaksi akan terbentuk ester dan DCU (disikloheksilurea) sebagai hasil samping penggunaan DCC (March 1992). Mekanisme reaksi dengan aktivator DCC dapat dilihat pada Gambar 7.

10 R C H + C C 6 H 11 R C - + H C + C 6 H 11 C 6 H 11 C 6 H 11 Disikloheksilkarbodiimida (DCC) R C C 6 H 11 + R'H CHC 6 H 11 H + R C R' ester + C6 H 11 H C H C 6 H 11 Disikloheksilurea (DCU) Gambar 7 Mekanisme reaksi dengan aktivator DCC (March 1992) DMAP (4-,-dimetilaminopiridin) merupakan suatu katalis nukleofil yang memiliki efek yang cukup kuat. Gugus dimetilamino berfungsi sebagai suatu substituen donor elektron yang meningkatkan sifat basa dari nitrogen piridin (Carey & Sundberg 2007). Katalis DMAP dapat dikombinasikan dengan aktivator DCC menghasilkan metode yang berguna untuk meragamkan asam karboksilat agar dapat bereaksi dengan alkohol untuk menghasilkan ester. Mekanisme reaksi pembentukan ester yang dikatalis DMAP dapat dilihat pada Gambar 8. H 3 C.. CH 3 H 3 C + CH 3 R C H 3 C + CH 3 H 3 C + CH 3.... - R C.. - R C C - H 3 C + CH 3 - CR H 3 C CH 3 RCR' R H 3 C.. + CH 3 C R ion -asilpiridinium H R' R C - R'.. 4-,-dimetilaminopiridin (DMAP) Gambar 8 Mekanisme reaksi pembentukan ester dengan katalis DMAP (Carey & Sundberg 2007)

11 Perkembangan Sintesis Senyawa Analog UK-3A Modifikasi struktur yang telah banyak digunakan dalam sintesis senyawa analog UK-3A dan UK-2A adalah dengan mengubah gugus dilakton cincin beranggota-9 menjadi rantai terbuka dan meragamkan panjang rantai alifatik. Perbedaan gugus aktif akan mempengaruhi aktivitas yang ada pada suatu senyawa. Hal ini telah diteliti, yaitu dengan mempelajari perbedaan aktivitas pada senyawa UK-2A dan UK-3A (Ueki et al. 1997b). Sintesis senyawa analog UK-3A, yaitu senyawa 3-hidroksipikolinil metil fenilpropionil serin ester, telah dilakukan pada tahun 1995. Sintesis ini dilakukan dengan mereaksikan 3-hidroksipikolinil serin ester dengan asam propionat. Hasil uji aktivitas senyawa 3-hidroksipikolinil metil fenilpropionil serin ester terhadap sel kanker menunjukkan adanya kemampuan menghambat pertumbuhan sel kanker pada konsentrasi 43-90 µg/ml (Hanafi 1995). Mekanisme reaksi sintesisnya dapat dilihat pada Gambar 9. H H Me H PHCH 2 CH 2 CH DCC/DMAP, CH 2 Cl H H Me 3-hidroksipikolinil-metil-serin-ester 3-hidroksipikolinil-metil-fenilpropionil-serin-ester Gambar 9 Reaksi sintesis 3-hidroksipikolinil metil fenil propionil serin ester (Hanafi 1995) Agar pembentukan senyawa analog UK-3A menghasilkan rendemen yang tinggi, maka dilakukan optimasi. ptimasi dilakukan dengan cara meragamkan penggunaan katalis dan aktivator. Selain itu juga dilakukan ragam kondisi reaksi, yaitu suhu dan waktu reaksi (Hanafi et al. 1997b). Aktivitas sitotoksik senyawa UK-3A juga telah diuji terhadap beberapa sel kanker, di antaranya oleh Ueki et al. (1997). Hasil uji sitotoksisitas senyawa UK-3A pada penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 1.

12 Tabel 1 Aktivitas sitotoksik senyawa UK-3A, UK-2A, dan antimisin A 3 dinyatakan dalam IC 50 (µg/ml) (Ueki et al. 1997a) Senyawa IC 50 Sel Uji (µg/ml) P-388 B-16 KB CL201 3T3 UK-3A 38 18 20 45 100 UK-2A 100 100 17 35 100 Antimisin A 3 0,015 0,02 0,063 0,018 15 IC 50 = Inhibition Concentration Pada tahun 2008 mulai dilakukan sintesis analog UK-3A dengan menghilangkan satu gugus lakton pada senyawa 3-hidroksipikolinil oktilamida (PA), kemudian dilihat pengaruhnya pada nilai e-docking dan diuji aktivitasnya dalam menghambat pertumbuhan sel kanker (Hanafi 2008). Beberapa senyawa analog UK-3A yang berhasil disintesis mempunyai struktur inti pada Gambar 10. Perbedaan nilai log P dan nilai e-docking serta diuji aktivitasnya dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukimia murin P-388 dirangkum pada Tabel 2. H H R 1 R 2 H H C 8 H 17 A B Gambar 10 Struktur inti senyawa analog UK-3A

13 Tabel 2 ilai log P, nilai e-docking, dan uji aktivitas antikanker terhadap sel kanker leukemia murin P388 ama senyawa analog 3-hidroksipikolinil serin metil pentanoil ester (PSMPE) (Marlupi 2007) 3-hidroksipikolinil serin metil oktanoil ester (PSME) (Anita 2008) 3-hidroksipikolinil serin oktil heksanoil ester (PSHE) (Zainuddin 2008) 3-hidroksipikolinil serin oktil oktanoil ester (PSE) (Darmawan 2008) 3-hidroksi-pikoliniloktilamid (PA) (Hanafi 2008) Struktur inti Struktur Gugus R R 1 2 ilai Log P ilai e- docking IC 50 P388 (µg/ml) A -CH3 C4H 9 C- 0,37-9,70 39 A -CH3 C7H 15 C- 1,56-11,93 15,4 A -C 8 H 17 C5H 11 C- 3,56-12,45 35 A -C 8 H 17 C7H 15 C- 4,35-13,50 50 B - - 0,82-10,16 13,2 Senyawa analog UK-3A yang disintesis pada penelitian ini adalah senyawa 2- hidroksinikotinil serin metil oktanoil ester (SME) yang akan dilakukan melalui dua tahapan reaksi dan senyawa 2-hidroksinikotinil oktil amida (A) yang dilakukan melalui satu tahapan reaksi. Sintesis senyawa SME dan A dipilih untuk melihat perbedaan posisi gugus hidroksil pada cincin aromatik (cincin nikotinat) terhadap aktivitasnya dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukimia murin P-388 dan juga dilakukan uji aktivitas terhadap sel kanker payudara T47D. Penyakit kanker terjadi karena sel normal yang telah kehilangan sifat apoptosis, yaitu kemampuan untuk membunuh sel itu sendiri, sehingga sel terus bertambah. Hal ini terjadi karena adanya overekspresi pada enzim Bcl-xL yang merupakan enzim antiapoptosis. leh karena itu, salah satu mekanisme yang diharapkan pada senyawa obat antikanker adalah kemampuannya menghambat kerja enzim Bcl-xL tersebut (Enyedy et al. 2001). Pada penelitian ini juga ditentukan nilai e-docking yang

14 dilakukan secara in silico pada protein Bcl-xL yang merupakan enzim antiapoptosis.yang spesifik untuk kanker payudara (Espana et al. 2005). ilai log P juga ditentukan untuk melihat pengaruh perbedaan nilai lipofilisitas/hidrofobisitas senyawa hasil sintesis pada uji aktivitas antikanker. Hasil nilai log P dan nilai e- docking dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3 ilai Log P dan e-docking senyawa target sintesis dan senyawa induk UK-3A ama senyawa analog Log P e-docking (kkal/mol) 2-hidroksinikotinil serin metil oktanoil ester (SME) 1,49-11,45 2-hidroksinikotinil oktil amin (A) 2,50-10,46 UK-3A 1,61-11,65 Antimisin A3 1,30-10,34 Artonin E -10,26 E-docking adalah percobaan dengan menggunakan program komputer tertentu dan dalam penelitian ini digunakan program ArgusLab versi 4,0 yang menghasilkan energi bebas ikatan ( G bind ) dalam satuan kkal/mol. ilai log P didapatkan dengan program Hyperchem pro 6,0. Sel Kanker Leukimia Murin P-388 Leukimia murin P-388 merupakan salah satu jenis sel kanker leukemia yang sering digunakan dalam uji sitotoksisitas untuk mengetahui aktivitas suatu senyawa dalam menghambat pertumbuhan sel kanker. Sel kanker ini dikembangbiakkan dari sel tikus yang dikenai agen leukemia. Jenis sel leukimia lain yang sering digunakan adalah sel leukemia L1210 yang antara lain telah digunakan dalam uji sitotoksisitas kalanon menghasilkan nilai IC 50 sebesar 59,4 μg/ml (Chasani 2002). Sel Kanker Payudara T47D Kanker payudara sering ditemukan di seluruh dunia dengan insiden relatif tinggi, yaitu 20 % dari seluruh keganasan. Menurut WH 8-9% wanita mengalami kanker payudara. Hal ini menjadikan kanker payudara sebagai jenis kanker yang paling banyak ditemui pada wanita. Setiap tahun lebih dari 250.000 kasus baru

15 kanker payudara terdiagnosis di Eropa dan kurang lebih 175.000 di Amerika Serikat (Jemal 2003). Kanker payudara memperlihatkan proliferasi keganasan sel epitel yang membatasi duktus atau lobus payudara. Kanker membutuhkan waktu 7 tahun untuk tumbuh dari satu sel menjadi massa yang cukup besar untuk dapat dipalpasi (kira-kira berdiameter 1 cm). Pada ukuran itu, sekitar 25% kanker payudara sudah mengalami metastasis (Price 2005). Sel T47D merupakan sel kanker yang mengekspresikan reseptor estrogen atau yang biasa disebut ER positif serta mengekspresikan p53 yang telah termutasi. Pada sel ini p53 mengalami missense mutation pada residu 194 (dalam zinc-binding 11 domain L2) sehingga p53 kehilangan fungsinya. Jika P53 tidak dapat memberi respons pada DA, maka P53 akan mengurangi atau menghilangkan kemampuan dalam meregulasi siklus sel dan memacu apoptosis (Schafer et al. 2000). Sel T47D merupakan continuous cell line yang diisolasi dari jaringan tumor duktal payudara seorang wanita berusia 54 tahun. Continuous cell line sering dipakai dalam penelitian kanker secara in vitro karena mudah penanganannya, memiliki kemampuan replikasi yang tidak terbatas, homogenitas yang tinggi, serta mudah diganti dengan stok beku jika terjadi kontaminasi (Burdall et al. 2003). Uji Toksisitas Letalitas Larva Udang Pada umumnya zat aktif pada konsentrasi yang tinggi bersifat toksik, oleh karena itu Meyer (1982) melakukan pendekatan untuk uji toksisitas dengan menggunakan hewan sederhana dan memilih Artemia salina (nauplius) sebagai hewan uji. Metode ini sering digunakan untuk penapisan awal terhadap senyawa aktif yang memiliki khasiat sebagai antitumor di dalam ekstrak tanaman karena mudah, cepat, murah, dan dapat dipercaya. Selain itu uji toksisitas menggunakan larva udang ini dapat juga digunakan pada analisis toksisitas pestisida, polutan, dan senyawa yang diduga memiliki efek sitotoksik. Besarnya aktivitas toksisitas terhadap larva udang laut dinyatakan dengan LC 50 (median lethal concentration), yaitu konsentrasi

16 senyawa uji (ppm) yang dapat menyebabkan kematian 50% organisme uji di bawah kondisi yang sesuai (McLaughlin et al. 1998). Uji Sitotoksik Antikanker Suatu zat dikatakan bersifat sitotoksik apabila zat tersebut memiliki efek toksisitas atau beracun terhadap sel yang dapat menyebabkan kematian sel. batobatan kemoterapi seringkali bersifat toksik terhadap sel kanker yang tumbuh dengan cepat. Uji sitotoksisitas merupakan uji yang digunakan untuk mengevaluasi keamanan suatu senyawa yang akan digunakan sebagai bahan obat, kosmetik, zat tambahan makanan, dan pestisida dengan menggunakan kultur sel secara in vitro. Salah satu syarat uji sitotoksisitas adalah sistem uji tersebut harus menghasilkan kurva dosis respons yang reprodusibel dan dapat menggambarkan efek senyawa uji yang sama bila diberikan secara in vivo. Sistem uji sitotoksisitas ini merupakan uji kuantitatif dan kualitatif dengan cara menetapkan kematian sel (Freshney 1996). Secara in vitro, uji sitotoksisitas dilakukan untuk menentukan potensi sitotoksik senyawa-senyawa seperti produk-produk farmasi, kosmetik, dan obat-obat antikanker. Pengembangan metode in vitro sebagai alternatif pengganti pengujian menggunakan hewan uji mempunyai relevansi yang cukup baik yang bertujuan mendeteksi potensi ketoksikan suatu obat pada manusia. Toksisitas merupakan kejadian kompleks secara in vivo, di tempat terjadinya kerusakan sel akibat penggunaan obat antikanker yang bersifat sitotoksik atau karena efek-efek fisiologi seperti efek inflamasi, neurotoksisitas, dan juga efek-efek sistemik. Uji in vitro harus dapat menggambarkan efek senyawa uji yang sama bila diberikan secara in vivo. Respons sel terhadap agen-agen sitotoksik dipengaruhi oleh kerapatan sel (Freshney 1996).

17 BAHA DA METDE Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain spektrofotometer inframerah (FT-IR) Perkin Elmer, FT-MR JEL 500 MHz, spektrometri massa (LC-MS), dan seperangkat alat refluks. Bahan yang digunakan antara lain asam 2-hidroksinikotinat, asam p-toluena sulfonat (p-tsh), L-serin metil ester, asam oktanoat, oktilamina, DCC, DMAP, larva Artemia salina, sel kanker P-388, sel kanker T47D, media EAGLE, serum fetal bovine. Prosedur Sintesis SME Senyawa SME disintesis dengan menyediakan labu bulat dua leher, kemudian diisi dengan 2-hidroksinikotinat 8 mmol, aktivator DCC 4,4 mol, dan katalis DMAP 0,8 mmol. Ke dalam labu ditambahkan L-serin metil ester 4 mmol. Campuran divakum selama 1 jam, selanjutnya ditambah 10 ml pelarut kloroform melalui septum, kemudian reaksi dilakukan pada suhu 55 C selama 24 jam (Hanafi et al. 1997b). Selama reaksi berlangsung, larutan diperiksa secara kualitatif menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan fase gerak n- diklorometana:metanol 10% untuk memantau hasil senyawa yang terbentuk. Ke dalam hasil reaksi ditambahkan senyawa magnesium sulfat anhidrat untuk menghilangkan air sebagai reaksi samping, kemudian disaring dan sisa pelarut CHCl 3 diuapkan. Produk dimurnikan dengan kromatografi kolom dengan fase diam silika gel dan fase gerak n-diklorometana : metanol 10%. Senyawa hasil 2-hidroksinikotinil serin metil ester (SME) yang terbentuk diidentifikasi dengan KLT, spektrofotometer FT-IR, LC-MS, 1 H-MR, dan 13 C-MR. Sintesis SME Senyawa SME disintesis dengan cara mereaksikan 2-hidroksinikotinil metil ester 0,4 mmol dengan asam oktanoat 2 mmol menggunakan aktivator DCC 2

18 mmol dan katalis DMAP 0,05 mmol dalam pelarut CHCl 3 pada suhu ruang selama 4 jam. Rendemen sintesis dihitung berdasarkan nisbah terhadap hasil teoretis. Sintesis A Senyawa A disintesis dengan menyediakan labu bulat dua leher, kemudian dengan asam-2-hidroksinikotinat 4 mmol, aktivator DCC 4,4 mmol, dan katalis DMAP 0,4 mol. Ke dalam labu ditambahkan oktilamina 4,2 mmol. Campuran divakum selama 1 jam, selanjutnya ditambah 10 ml pelarut kloroform melalui septum, kemudian reaksi dilakukan pada suhu 55 C selama 24 jam (Hanafi et al. 1997b). Selama reaksi berlangsung, larutan diperiksa secara kualitatif menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan fase gerak n-diklorometana:metanol 10% untuk mendeteksi hasil senyawa yang terbentuk. Magnesium sulfat anhidrat ditambahkan untuk menghilangkan air sebagai reaksi samping, kemudian disaring dan sisa pelarut CHCl 3 diuapkan. Pemurnian dilakukan dengan kromatografi kolom dengan fase diam silika gel dan fase gerak n- diklorometana:metanol 10%. Senyawa hasil 2-hidroksinikotinil oktilamin yang terbentuk diidentifikasi dengan KLT, spektrofotometer FT-IR, LC-MS, 1 H-MR dan 13 C-MR. Rendemen sintesis dihitung berdasarkan nisbah terhadap hasil teoretis. Identifikasi Spektrum FT-IR dari senyawa hasil reaksi diukur dalam bentuk pelet KBr dengan menggunakan spektrofotometer Perkin Elmer. Spektrum MR diukur menggunakan instrumen JEL 500 MHz. ilai geseran kimia (δ) sinyal diukur dalam satuan ppm. Pengukuran pada 1 H-MR menggunakan pelarut CDCl 3, CD 3 D, dan sebagai standar internal digunakan tetrametilsilana (TMS) pada δ 0,0. Kromatografi lapis tipis (KLT) dilakukan menggunakan pelat silika gel Merck GF254 dengan tebal 0,25 mm. Identifikasi spot KLT menggunakan lampu UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm. Kromatografi kolom dilakukan menggunakan silika gel Merck dengan ukuran 70-230 mesh.

19 Uji Toksisitas Letalitas Larva Udang (BSLT) Telur udang dimasukkan ke dalam kotak yang berisi air laut dan ditutupi dengan sebagian foil aluminium (agar tidak tembus cahaya) lalu dibiarkan selama 24 jam sehingga semua telur menetas menjadi larva. Kemudian larva yang telah berumur 1 hari diambil sebanyak 10 15 ekor dan ditempatkan di dalam vial pengujian yang telah diisi dengan 100 µl air laut. Selanjutnya ditambahkan 100 µl larutan sampel dan dibiarkan selama 24 jam pada tempat yang cukup cahaya dan udara. Jumlah larva yang mati diamati setelah 24 jam dan pengujian sampel dilakukan triplo (secara bersamaan). Blanko untuk uji BSLT ini juga dilakukan dengan cara yang sama dengan tetapi tanpa tambahan sampel. Data dari hasil pengujian dianalisis dengan menghitung jumlah larva yang mati dan yang masih hidup. Persentase kematian dihitung dengan rumus Abbot sebagai berikut: A - B Kematian = 100% C keterangan: A = Jumlah larva yang mati pada kelompok percobaan B = Jumlah larva yang mati pada kelompok blanko C = Jumlah larva awal Data yang diperoleh menggunakan analisis regresi linear dengan cara membuat grafik hubungan antara persentase kematian dan konsentrasi sampel. ilai LC 50 ditentukan dengan cara mengalurkan data pada grafik (Chozin et al. 1997). Uji Aktivitas Antikanker secara in vitro terhadap Sel Kanker Leukemia Murin P-388 dan Sel Kanker Payudara T47D Aktivitas senyawa analog UK-3A diuji terhadap dua senyawa hasil sintesis, yaitu SME dan A. Kedua senyawa diuji sebagai antikanker secara in vitro terhadap

20 sel kanker leukemia murin P-388 dan sel kanker payudara T47D. Aktivitas sitotoksik ini diuji dengan metode MTT (3-(4,5-dimetiltiazo-2-il-)2,5-difeniltetrazolium bromida. Metode ini diawali dengan inokulasi sel dengan jumlah 3 x 10 3 sel/ml dalam media RPMI 1640 yang dilengkapi fetal bovine serum (FBS), pada 96 lubang microplate. Setelah inokulasi ditambahkan sampel SME atau A masingmasing dengan ragam konsentrasi 0,1; 0,3; 1; 3; 10; 30; dan 100 µg/ml. Sebagai kontrol positif digunakan senyawa antikanker artonin E untuk sel kanker leukemia murin P-388 dan cisplatin untuk sel kanker payudara T47D dengan ragam konsentrasi yang sama. Setelah 48 jam dari penambahan sampel ditambahkan pereaksi MTT dan sel diinokulasi kembali. Setelah 4 jam ditambahkan larutan penghenti untuk menghentikan reaksi MTT. Prinsip pengujian didasarkan pada pengukuran intensitas warna yang terjadi sebagai hasil metabolisme pada sel hidup. Garam MTT (3-(4,5- dimetiltiazo-2-il-)2,5-difeniltetrazolium bromida) yang ditambahkan pada media, akan direduksi oleh mitokondrial dehidrogenase menjadi formazan (zat warna ungu). Jumlah sel hidup dan sel mati dihitung berdasarkan pengukuran rapatan optis (D) menggunakan microplate reader pada panjang gelombang 550 nm dan 600 nm. Besarnya intensitas larutan sebanding dengan jumlah sel hidup. Dari pengukuran diperoleh nilai serapan rata-rata untuk tiap lubang dari tiga kali ulangan. ilai A kemudian dimasukkan dalam grafik untuk memperoleh nilai IC 50 (Freshney 1996).

21 HASIL DA PEMBAHASA ilai e-docking dan Log P Senyawa Analog UK-3A E-docking program ArgusLab 4,0 digunakan untuk melihat kesesuaian antara senyawa aktif (ligan) dengan reseptor (protein/ligan) secara in silico kemudian diperkirakan afinitas ikatan antara ligan dan reseptor sehingga diperoleh nilai energi bebas minimum ( G⁰ bind ) dalam satuan kkal/mol. Pada pelaksanaan docking, ligan dioptimasi bentuk dan orientasi struktur paling stabil untuk dapat berikatan dengan tapak aktif dari reseptor (dalam hal ini protein Bcl-xL) tertentu yang menjadi target sampai mendapatkan energi bebas minimum ( G⁰ bind ) yang sesuai (da & Takahashi 2009). Tidak adanya ketentuan yang jelas mengenai batas optimum batas atas maupun batas bawah dari nilai e-docking yang diperoleh menunjukkan bahwa ligan tersebut cocok atau sesuai dengan tapak aktif protein yang dijadikan target. amun dari acuan yang diperoleh, ada kecenderungan bahwa semakin kecil nilai e-docking semakin cocok ikatan antara ligan dan protein target (Thomas 2003). Dari hasil docking senyawa SME diperoleh nilai -11,12 kkal/mol dan dari senyawa A nilai -10,46 kkal/mol. Hasil e- docking senyawa SME dan A dapat dilihat berturut-turut pada Gambar 11 dan 12. Protein SME Gambar 11 Hasil e-docking SME menggunakan program ArgusLab versi 4,0

22 Protein A Gambar 12 Hasil e-docking A menggunakan program ArgusLab versi 4,0 Log P (lipofilisitas/hidrofobisitas) merupakan koefisien partisi senyawa yang diukur berdasarkan nisbah kelarutan zat pada pelarut n-oktanol dan air. Log P merupakan suatu parameter krusial yang menentukan kemampuan senyawa (obat) menembus membran sel dan berinteraksi dengan target. Hal ini juga sesuai dengan salah satu faktor pada lima aturan Lipinski yang juga mensyaratkan nilai log P < 5 karena berhubungan dengan kemampuan senyawa untuk melarut dan menembus membran sel. Perubahan struktur pada senyawa akan memberikan pengaruh yang signifikan pada nilai log P dan juga pada aktivitas hayatinya (Patrick 2005; Mishra et a.l 2009). ilai log P senyawa SME dan A adalah 1,49 dan 2,50. Korelasi hubungan antara struktur dan aktivitas serta nilai yang diperoleh dari hasil komputasi e-docking akan dapat dilihat setelah hasil uji bioaktivitas kedua senyawa SME dan A tersebut selesai dilakukan. Sintesis SME SME disintesis dengan mereaksikan asam 2-hidroksinikotinat dengan L- serin metil ester hidroklorida dengan bantuan disikloheksilkarbodiimida (DCC) dan dimetil amino piridin (DMAP) sebagai katalis (aktivator) dalam kloroform

23 pada suhu 55 C selama 24 jam. Senyawa asam-2-hidroksinikotinat diaktivasi menggunakan DCC dan dibantu dengan katalis DMAP untuk mempermudah reaksi dengan L-serin metil ester hidroklorida (SME) yang mengandung gugus amina sehingga membentuk gugus amida. Reaksi sintesis SME mengikuti perkiraan mekanisme reaksi pada Gambar 13. H H C 6 H 11 C DCC H.... C 6 H 11 H C C 6 H 11 - C H C 6 H 11 C 6 H 11 Asam-2-hidroksinikolinat C 6 H 11 + + H - DMAP C 6 H 11 C - H HCl: H H H C 6 H 11 C 6 H 11 H C H C6 H 11 DCU +.. H CH 3 o L-serin metil ester hidroklorida H H H _ H CH 3.. DMAP H H CH 3 2-hidroksinikotinil serin metil ester (SME) Gambar 13 Perkiraan mekanisme reaksi sintesis SME Hasil reaksi sintesis SME yang diperoleh berupa larutan tidak berwarna bercampur dengan padatan putih disikloheksilurea (DCU). DCU merupakan hasil samping dari penggunaan aktivator DCC. Pemisahan hasil reaksi dari DCU dipisahkan dengan penyaringan dan pemurnian secara kromatografi. Filtrat yang dihasilkan kemudian dibebaskan dari pelarut menggunakan evaporator putar.

24 Analisis pendahuluan terhadap produk reaksi yang terbentuk dilakukan menggunakan KLT analitik dengan fase diam silika gel dan fase gerak n- diklorometana : metanol 10%. Spot yang terbentuk diamati di bawah lampu UV. Analisis KLT menghasilkan 3 spot dari hasil reaksi sintesis tahap pertama, yaitu spot senyawa awal asam 2-hidroksinikotinat dengan Rf = 0,19, spot produk 2- hidroksinikotinil serin metil ester yang merupakan spot dominan dengan Rf = 0,42, dan spot produk samping dengan Rf = 0,51. Spot produk reaksi yang dominan merupakan spot berwarna ungu dan memiliki nilai Rf yang lebih tinggi dari spot standar asam 2-hidroksinikotinat karena bersifat lebih nonpolar. Produk samping reaksi dapat terbentuk karena adanya reaksi samping yang tidak spesifik sehingga terjadi reaksi pada gugus aktif yang tidak diinginkan (Anita et al.2008). Hasil analisis KLT SME dapat dilihat pada Lampiran 1a. Senyawa hasil samping dipisahkan dari produk SME dengan kolom kromatografi yang menggunakan fase diam silika gel dan fasa gerak n- diklorometana:metanol secara bergradien. Fraksi-fraksi dengan spot yang memiliki nilai Rf 0,42 digabungkan, kemudian pelarut diuapkan. Senyawa yang dihasilkan berupa kristal jarum berwarna putih. Rendemen hasil sintesis SME yang diperoleh sebesar 87,8 %. Produk reaksi tersebut dapat dikatakan murni berdasarkan spot tunggal hasil KLT dan jarak titik leleh yang sempit, yaitu 73-74 C. Hasil pengukuran menggunakan LC-MS (liquid chromatography mass spectroscopy) (Lampiran 2a) terhadap senyawa SME menghasilkan 2 puncak dengan 1 puncak dominan yang muncul pada waktu retensi 1,61 menit (T1,6) dengan luas area 6053,5. Hal ini dibuktikan dari nilai bobot molekul (m/z) sebesar 240,23 g/mol (M + H = 241,23 g/mol) yang merupakan bobot molekul senyawa SME. Puncak kedua muncul pada waktu retensi 1,12 (T1,1) dengan area sebesar 291,06 yang merupakan hasil samping reaksi yang masih mengotori produk. Senyawa pengotor ini adalah DCU sesuai dengan bobot molekulnya 224,39. ilai bobot molekul SME hasil pengukuran sesuai dengan bobot molekul SME penelitian sebelumya (Shimano et al. 1998). Spektrum FT-IR senyawa L-serin metil ester hidroklorida sebagai material awal menujukkan pita-pita serapan antara lain pada bilangan gelombang ν = 3350

25 cm -1 yang merupakan serapan lebar dari vibrasi ulur H, bilangan gelombang ν = 1743 cm -1 yang merupakan vibrasi ulur gugus karbonil (C=) ester, dan ν = 1448 cm -1 merupakan vibrasi tekuk C- (Lampiran 3a). Spektrum FT-IR untuk senyawa hasil sintesis SME menunjukkan pita serapan baru pada ν = 1680 cm -1 yang merupakan vibrasi ulur karbonil (C=) dari amida, serapan tunggal pada ν = 3381 cm -1 yang merupakan vibrasi ulur H dari amida sekunder (Pavia et al. 2001). Hasil analisis juga menunjukkan masih adanya vibrasi ulur karbonil (C=) ester pada ν = 1746 cm -1, dan serapan pada ν = 3481 cm -1 yang menunjukkan vibrasi ulur H (Lampiran 3b). Hasil analisis FT- IR ini menunjukkan senyawa SME telah terbentuk karena adanya serapanserapan baru yang menunjukkan adanya gugus amida yang tidak terdapat pada spektrum FT-IR senyawa L-serin metil ester hidroklorida sebagai material awal. Spektrum hasil analisis senyawa SME menggunakan spektrometer 1 H- MR (Lampiran 4a) dan 13 C-MR (Lampiran 5a) dapat ditunjukkan dalam Tabel 4 dan menggunakan panduan Gambar 14. 6 5 4 2 3 H Gambar 14 Struktur senyawa 2-hidroksinikotinil serin metil ester (SME) H 2' 1' 3' H 1"' Tabel 4 Geseran kimia (δ, ppm) spektrum 1 H-MR (500 MHz) dan 13 C-MR (125 MHz) untuk senyawa SME (CD 3 D) Geseran Kimia (δ, J dalam Hz) C/H 1 H-MR 13 C-MR 1 3,78 (s, 3H) 53,16 1-173,00 2 4,70 (m, 1H, J = 3,7; 7,3) 56,51 3 4,01 (dd, 1H, J = 3,7; 11) 63,08 3,90 (dd, 1H, J = 3,7; 11) CH 10,62 (d, 1H, J = 7,3) 166,06 2-166,15 3-121,53 4 8,49 (dd, 1H J = 2,5; 7,4) 140,68 5 6,59 (t, 1H, J = 7,4) 108,28 6 7,71 (dd, 1H J = 2,5; 6,1) 146,35