BAHAN DAN METODE PENELITIAN. Waktu dan Lokasi Penelitian

Transkripsi

1 BAHAN DAN METODE PENELITIAN Waktu dan Lokasi Penelitian Penelitian dilaksanakan pada bulan September 2001 sampai dengan September Pengamatan dan pengukuran morfologi (morfometri), pengamatan aktivitas harian dan gambaran darah empat subspesies beo dilakukan di Laboratorium Penangkaran Satwaliar, Fakultas Kehutanan IPB. Pemotretan eritrosit burung beo dilakukan di Lab. Histologi, Fakultas Kedokteran Hewan IPB sedangkan analisis biologi molekuler dilaksanakan di Laboratorium Genetik LIPI Cibinong dan di Laboratorium Biologi Molekuler Pusat Studi Ilmu Hayati dan Bioteknologi IPB. Bahan dan Alat Untuk sampel morfometri dan pemeriksaan gambaran darah burung digunakan sampel burung beo medan (n = 2), beo kalimantan (n = 3), beo nias (n = 8), beo flores (n=2), beo yang tidak diketahui asal usulnya (unknown) (n = 4), kode UK1, UK2, UK3, dan UK4, berasal dari pasar burung. Pada sampel tersebut dilakukan pengamatan dan pengukuran morfologi atau morfometri serta pengambilan darah dari vena ulnaris sebanyak 0,5 ml dengan menggunakan spuit yang telah diisi antikoagulan (EDTA 10%). Pengiriman sampel ke laboratorium dilakukan pada suhu dingin (± 4 o C). Pemeriksaan eritrosit dilakukan dengan menggunakan hemositometer Neubaeur dan diperiksa di bawah mikroskop cahaya dengan pembesaran 40x dan 100x, kemudian dilakukan pengambilan gambar menggunakan kamera Nikon. Pengamatan aktivitas harian burung beo dilakukan pada empat ekor burung beo yang masing-masing berasal dari Medan, Kalimantan, Nias dan Flores. Sampel burung beo yang digunakan untuk analisis DNA berasal dari habitat aslinya yaitu dari Medan (n = 2, yaitu M1 dan M2), Kalimantan (n = 3, yaitu K1, K2, K3), P. Nias (n = 4, yaitu N1, N2, N3, N4) dan Flores

2 33 (n = 2, yaitu F1 dan F2) dan beo yang tidak diketahui asal usulnya (n = 4, yaitu UK1, UK2, UK3, dan UK4). Sebagai pembanding digunakan sampel dari Thailand yaitu beo populasi thailand utara (kode akses AF411342) dan beo populasi thailand selatan (kode akses AF465252) dari Genbank, runutan nukleotida ayam leghorn (Desjardins & Morais 1990), burung Pica pica pica (Magpies, Famili Corvidae, Kryukov et al. 2004, kode akses AY701166), Pica pica jankowskii (Magpies, Famili Corvidae, Kryukov et al. 2004, kode akses AY701167), Cyanopica cyanus interposita (Famili Corvidae, Kryukov et al. 2004, kode akses AY701152). Sampel yang diambil adalah beo yang berusia dewasa, dan mewakili empat subspesies beo (G.r.religiosa, G.religiosa spp. dari Kalimantan, G.r.robusta dan G.r.mertensi). Metode Penelitian Pengukuran Karakter Morfologi Analisis morfometri dilakukan pada sampel beo yang tidak diketahui jenis kelaminnya, berusia dewasa dan berasal dari habitat alaminya yaitu dari Medan (n=2), Kalimantan (n=3), P.Nias (n=8) dan Flores (n=2)) serta yang tidak diketahui asal-usulnya (n=4). Analisis morfometri dilakukan dengan mengukur karakter morfologi secara kuantitatif dengan menggunakan kaliper, yang mempunyai ketelitian 0,001. Hasil pengukuran dibulatkan menjadi dua angka di belakang koma. Pengukuran dilakukan tiga kali ulangan dan diambil rata-ratanya. Pengukuran dibantu oleh dua orang untuk memegang burung beo. Sifat morfologi secara kuantitatif (morfometri) yang diukur adalah bobot badan, panjang tubuh, panjang sayap, lebar sayap, panjang paruh atas, panjang paruh bawah, tinggi paruh, panjang dan lebar cuping kuduk (kiri dan kanan), panjang tarsus, panjang ekor, jumlah bulu sayap primer, jumlah bulu sayap sekunder dan jumlah bulu ekor. Bobot badan ditimbang dengan menggunakan timbangan digital (Hitachi) dengan tingkat ketelitian 0,001 dan hasilnya dibulatkan menjadi dua angka di belakang koma.

3 34 Sedangkan secara kualitatif yang diamati adalah bentuk kepala, pola bulu kepala, warna bulu punggung, warna bulu ekor, warna paruh, bentuk paruh, warna tarsus, warna mata, bentuk cuping kuduk dan bentuk spot putih di sayap yang dikembangkan dan dilakukan pemotretan dengan menggunakan kamera Casio Lsd Digital Camera QV 3000 Ex 3.3 mega pixel. Pengamatan Aktivitas Harian Beo di Penangkaran Burung beo yang berasal dari Medan, Kalimantan, Nias dan Flores masing-masing satu ekor diamati aktivitas hariannya mulai dari jam 6.00 WIB sampai WIB, selama dua hari berturut-turut secara bersamaan. Metode pencatatan yang digunakan adalah metode One zero sampling, yaitu dengan cara mencatat semua perilaku yang terjadi (setiap interval waktu lima menit) pada individu burung beo yang diamati. Jika suatu perilaku terjadi dalam interval waktu itu, maka perilaku tersebut diberi nilai 1 dan jika tidak terjadi diberi nilai 0. Setiap pengamatan diulang sebanyak dua kali, dan dibantu oleh empat orang asisten. Aktivitas harian yang diamati adalah bersuara, memelihara diri (Epilemetic behaviour yang berupa mandi, menyelisik bulu, menggeliat dan membersihkan paruh) menjelajah (Investigate/Exploratory behaviour yang berupa mematuk-matuk, terbang dan meloncat), aktivitas makan/minum (Ingestive behaviour), aktivitas membuang kotoran (Eliminative behaviour), dan aktivitas lain berupa diam dan melihat ke kiri dan ke kanan. Pengamatan dilakukan oleh empat orang untuk setiap kandang (satu ekor beo penelitian). Untuk melihat ada tidaknya perbedaan perilaku dilakukan pengambilan film pada beo sampel M1, K3, N3, F1 dan F2 dengan menggunakan Handycam Sony (DCR-TRV 15E). Kondisi kandang penangkaran berukuran lebar 1,50 m, panjang 2,50 m dan tinggi 3,00 m. Setiap kandang ditempatkan dua ekor burung beo. Pakan yang diberikan berupa buah pisang ( 150 g/ekor/hari) dan voer (100 gr/ekor/hari, merk Beauty (buatan Taiwan) yang mengandung vitamin A, C, D3, E, B1, B2, B6, B12, K3, Asam folat, Biotin, asam pantotenat

4 35 yang bersumber dari jagung, kacang kedelai, tepung ikan, minyak ikan, telur) dan diberi minum sekali sehari yang telah diberi vitamin (masingmasing 200 ml/ekor) pada pukul wib. Pengambilan data dilakukan secara langsung. Burung beo yang diamati sudah mengalami adaptasi selama lebih dari lima tahun. Analisis Gambaran Darah Pengukuran kadar hemoglobin dilakukan dengan metode Sahli, sedangkan nilai hematokrit menggunakan metode mikrohematokrit dan hasilnya dinyatakan dalam persen. Pengukuran kadar hemoglobin dan nilai hematokrit dilakukan sebanyak tiga kali ulangan. Penghitungan eritrosit dan leukosit dilakukan dengan menggunakan hemositometer Neubauer dan larutan Rees & Ecker sebagai larutan pengencernya. Penghitungan diferensisasi leukosit dilakukan pada preparat ulas darah yang diwarnai dengan Giemsa, dengan menggunakan mikroskop pembesaran 40x dan 100x (Nikon). Leukosit yang dihitung adalah granulosit (eosinofil, basofil dan heterofil) dan agranulosit (limfosit dan monosit). Penghitungan dilakukan tiga kali ulangan. Dilakukan pemotretan pada preparat ulas darah dengan menggunakan kamera Nikon. Pada masing-masing sampel preparat ulas darah dilakukan pengukuran panjang dan lebar dari 10 eritrosit, serta panjang dan lebar inti eritrosit, dengan menggunakan skala (10 µ) kemudian dihitung rata-rata dan standar deviasinya. Analisis Daerah D-loop DNA mitokondrion Isolasi dan Purifikasi DNA DNA diekstraksi dari darah yang diambil dari vena ulnaris. Sekitar 0,5 ml darah diisap ke dalam siring (sebelumnya telah diisi dengan larutan EDTA 10% sebagai antikoagulan) (Arctander 1988). Isolasi DNA mengikuti Duryadi (1993). DNA total diekstraksi dari sampel darah dengan cara membuat suspensi antara darah ( μl)

5 36 dengan larutan penyangga penglisis (0,32M sukrosa, 1% (v/v) Triton X- 100, 5 mm MgCl 2 dan 10 mm Tris-HCl, ph 7,4) sebanyak volume sampel. Setelah itu organel sel dalam larutan diendapkan dengan sentrifuse 6500 rpm selama 1 menit, lalu supernatan dibuang. Endapan yang terbentuk (eritrosit dan leukosit) ditambah dengan 1X volume larutan penyangga pembilas (75 mm NaCl, 50 mm EDTA, Tris-HCl, ph 8), dikocok dengan menggunakan tangan sebentar (±20 detik) kemudian dikocok dengan menggunakan vortex sampai endapan larut, lalu ditambah dengan larutan penyangga digesti (STES, 0,5 mg/ml Proteinase K) sebanyak 500 μl, dan digoyang dengan tangan. Kemudian diinkubasi dengan menggunakan penangas air pada suhu 55 C selama ± 16 jam. Purifikasi DNA total mengikuti Sambrook et al. (1989) dimodifikasi Duryadi (1993). Ekstraksi dilakukan sebanyak dua kali. Ekstraksi pertama dilakukan dengan menambahkan fenol dan ekstraksi kedua dengan kloroform isoamil alkohol (24:1,CIAA). Sampel dari penangas air ditambah fenol 500 μl, digoyang dengan tangan sampai larutan tercampur merata selama 20 menit, kemudian disentrifuse pada rpm selama 3 menit. Supernatan (fase atas) dipindahkan ke dalam tabung ependorf yang baru. Lalu ditambah kloroform isoamil alkohol (24:1, CIAA, 500 μl), dan digoyang dengan tangan sampai tercampur merata. Kemudian disentrifuse pada rpm selama 3 menit. Supernatan dipindahkan ke ependorf baru dan ditambahkan etanol absolut sebanyak dua kali volume sampel, dikocok sampai terbentuk endapan putih (DNA). Selanjutnya untuk mengendapkan DNA, larutan disentrifuse pada rpm selama 5 menit (jika tidak terbentuk endapan putih, maka langkah selanjutnya tidak diteruskan). Etanol absolut dibuang, endapan putih DNA dalam tabung dicuci dengan menggunakan etanol 70% 1x volume dan disentrifuse pada rpm selama 3 menit. Alkohol dibuang dan material putih (DNA) dikeringkan di suhu kamar. DNA dilarutkan dalam larutan TE (10 mm Tris-HCl, 1mM EDTA, ph 8) sebanyak 100 μl dan disentrifus rpm selama 1 menit. Selanjutnya DNA tersebut diinkubasi pada 37 o C selama 15 menit dan kemudian disimpan di dalam

6 37 freezer suhu 20 o C. DNA dilihat kualitasnya dengan dimigrasikan pada gel agarosa 1,2% dengan menggunakan buffer 1xTBE (89 mm Tris, 89mM asam borat dan 2mM EDTA, ph8) dalam alat Submarine Electrophoresis (Hoefer, USA). Pengamatan dilakukan dengan bantuan sinar UV (λ = nm) setelah gel diwarnai dengan Ethidium Bromide (0,5 μg/ml). Amplifikasi Fragmen DNA Menggunakan Metode PCR DNA yang telah diekstraksi digunakan sebagai DNA cetakan untuk proses amplifikasi. Primer yang digunakan untuk mengamplifikasi sebagian daerah D-loop adalah primer F NDGE 5 -CCA TAA CCA ACA ACC TGT CAAT-3 dan Primer R (H417) 5 -AGT AGC TCG GTT CTC GTG AG-3 (Kudan S 20 Juli 2004, komunikasi pribadi). Amplifikasi fragmen DNA di daerah D-loop mitokondrion dilakukan dengan membuat 50μl campuran larutan yang terdiri dari Buffer (5 μl), MgCl 2 (3μl), dntps (10mM/μl, 1 μl), primer F ( pm/μl, 1 μl), primer R ( pm/μl, 1 μl), Taq polymerase (1,25U, 0,25 μl, Bio lab), d.i.w. 36,75 μl dan DNA 2 μl ( ng). Pencampuran dilakukan secara berurutan, kemudian disentrifuse sebentar (± 20 detik). Amplifikasi DNA pada penelitian ini menggunakan mesin GeneAmp R PCR system 2400 (Perkin Elmer). Kondisi PCR yang digunakan untuk amplifikasi sebagian daerah D-loop mtdna beo adalah sebagai berikut: tahap pertama pra- PCR (denaturasi awal) pada suhu 94 o C selama 3 menit, kemudian tahap kedua sebanyak 35 siklus dimulai dari denaturasi pada suhu 94 o C selama 30 detik, selanjutnya pada suhu 54 o C selama 1 menit untuk penempelan primer (annealing), kemudian 72 o C selama 45 detik untuk untuk perpanjangan (elongation) dan diakhiri dengan extention pada suhu 72 o C selama 5 menit. Produk PCR dideteksi dengan cara dimigrasikan pada gel agarose 1,2% dengan menggunakan Buffer 1xTBE dalam alat Submarine Electrophoresis (Hoefer, USA). Pengamatan dilakukan dengan bantuan sinar UV (λ = nm) setelah gel diwarnai dengan ethidium bromide.

7 38 Sebagai penunjuk berat molekul digunakan penanda DNA berukuran 100 pb (DNA ladder Promega Cat # G2101). Perunutan Nukleotida Daerah Kontrol D-loop Mitokondrion Produk PCR hasil amplifikasi dimurnikan dengan menggunakan DNA purification kit (Qiagen), selanjutnya konsentrasi DNA diukur dengan menggunakan Spektrofotometer (Bio-Spectro Shimazu), setelah itu dilakukan cycle sequencing dengan melakukan reaksi PCR dengan menggunakan primer R H417 dengan reagent khusus untuk DNA sequencing ( DIG Dye dari ABI). Kemudian hasil cycle sequencing dipurifikasi dan didenaturasi (95 C, 4 menit). Setelah itu dilakukan perunutan DNA dengan menggunakan alat perunut otomatis ABI Prism versi 3100-Avant Genetic Analyzer (USA). Analisis Data Hasil pengukuran morfologi (morfometri), pengamatan aktivitas harian dan hasil penghitungan gambaran darah beo dianalisis dengan bantuan software SPSS yang berdasarkan Analisis Komponen Utama (Principal Component Analysis). Hasil yang diperoleh ditampilkan dalam bentuk tabel dan gambar dendrogram. Data hasil pengamatan perilaku harian burung beo diolah dengan menggunakan software SPSS, ditampilkan dalam bentuk diagram pie, dendrogram dan dianalisis secara deskriptif. Untuk mengetahui alokasi waktu selama satu jam pengamatan untuk setiap perilaku burung beo yang terjadi, digunakan rumus : Alokasi waktu (menit/jam)= a x 60 menit b Keterangan : a = frekuensi kejadian suatu perilaku selama satu jam pengamatan b = frekuensi kejadian seluruh perilaku yang teramati dalam satu jam pengamatan

8 39 Hipotesis : H 0 : tidak ada perbedaan perilaku antara burung beo......dengan burung beo... H 1 : ada perbedaan perilaku antara burung beo......dengan burung beo... k Hipotesis diuji dengan menggunakan Uji X 2 = (o i - e i ) 2 i=1 e i Keterangan : o i = nilai pengamatan perilaku burung beo e i = nilai harapan perilaku burung beo e i = total kolom x total baris total pengamatan Kriteria uji : Jika X 2 hitung > X 2 tabel, maka terima H 1 Jika X 2 hitung < X 2 tabel, maka terima H 0 Pada taraf nyata dengan derajat bebas (v) = (b-1) (k-1), dimana b dan k masing-masing menyatakan baris dan kolom. Untuk analisis data hasil perunutan nukleotida sebagian daerah D- loop mtdna diedit dengan bantuan software BioEdit, dan dilakukan pensejajaran berganda dengan bantuan Clustal W (Thomson et al. 1994). Sebagai pembanding digunakan fragmen DNA D-loop sampel beo dari Thailand Selatan (kode akses AF465252) dan Thailand Utara (kode akses AF411342) dan runutan nukleotida ayam leghorn (Desjardins & Morais 1990), Pica pica pica (Magpies, Famili Corvidae, Kryukov et al. 2004, kode akses AY701166), Pica pica jankowskii (Magpies, Famili Corvidae,

9 40 Kryukov et al. 2004, kode akses AY701167), Cyanopica cyanus interposita (Famili Corvidae, Kryukov et al. 2004, kode akses AY701152). Analisis filogenetik dilakukan dengan bantuan software MEGA versi 3 (Kumar et al. 2001) dengan metode Neighbor Joining (1000 kali pengulangan)..