DETEKSI GEN hpt DAN bar UNTUK UJI KESTABILAN GEN TRANSPOSON Ac/Ds PADA PADI MUTAN IR64 CLARA SHINTA AYU FITRIYANTI

Transkripsi

1 DETEKSI GEN hpt DAN bar UNTUK UJI KESTABILAN GEN TRANSPOSON Ac/Ds PADA PADI MUTAN IR64 CLARA SHINTA AYU FITRIYANTI DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014

2

3 PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA* Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Deteksi Gen hpt dan bar untuk Uji Kestabilan Gen Transposon Ac/Ds pada Padi Mutan IR64 adalah benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Penelitian ini didanai oleh BB-Biogen atas nama Dr. Tri Joko Santoso, S.P, M.Si. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir skripsi ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Februari 2014 Clara Shinta Ayu Fitriyanti NIM G

4 ABSTRAK CLARA SHINTA AYU FITRIYANTI. Deteksi Gen hpt dan bar untuk Uji Kestabilan Gen Transposon Ac/Ds pada Padi Mutan IR64. Dibimbing oleh POPI ASRI KURNIATIN dan BUDI SANTOSA. Sistem transposon Ac/Ds dapat digunakan untuk memperoleh genotipe mutan yang bervariasi pada genom padi dan untuk mengetahui fungsi gen-gen tersebut khususnya pada padi kultivar IR64. Namun untuk memperoleh tanaman mutan yang diinginkan, diperlukan transposon yang stabil sehingga tidak terjadi perpindahan ke kromosom lain. Penelitian ini bertujuan mendapatkan tanaman padi IR64 transgenik generasi T1 yang mengandung transposon Ds stabil. Penelitian ini telah menganalisis 26 sampel DNA genom generasi pertama (T0) dengan polymerase chain reaction (PCR) menggunakan primer bar dan hpt serta analisis hibridisasi Southern. Sebanyak 26 sampel DNA genom generasi kedua (T1) dianalisis dengan PCR. Hasil analisis PCR menunjukkan keberadaan transposon Ac/Ds pada seluruh sampel generasi pertama. Hasil analisis hibridisasi Southern menunjukkan 14 dari 26 sampel DNA tanaman T0 mengandung satu salinan T-DNA transposon. Sebanyak 14 tanaman generasi T1 mengandung transposon Ds yang stabil berdasarkan hasil analisis PCR. Penelitian ini berhasil membuktikan gen transposon Ds bersifat stabil karena dapat diwariskan pada generasi berikutnya. Kata kunci: IR64, Transposon Ac/Ds, analisis kestabilan ABSTRACT CLARA SHINTA AYU FITRIYANTI. hpt dan bar Gene Detection for Stability Test of Transposon Ac/Ds Gen in IR64 Mutant Rice. Supervised by POPI ASRI KURNIATIN and BUDI SANTOSA. Ac/Ds transposon system can be used to gain variety of mutant rice genotype and for identifying the function of mutant gen especially IR64 rice. However to obtain mutant plant that we want, stable transposon is required in order to avoid transposon movement to other chromosoms. This research has analyzed 26 samples of genom DNA of first generation (T0) plants with polymerase chain reaction (PCR) using bar and hpt primer also Southern hybridization analyzing. There is 26 genom DNA samples of second generation (T1) plants analyzed with PCR. PCR analyzation showed that transposon Ac/Ds is occur in all samples. Southern hybridization showed that 14 of 26 T0 plants contain single copy of T-DNA. Fourteen T1 generation plants contain stable Ds transposon based on the results of PCR analysis. This research proved that Ds transposon is stable because it was inherited on the next generation. Keywords: IR64, Ac/Ds transposon, stability analysis

5 DETEKSI GEN hpt DAN bar UNTUK UJI KESTABILAN GEN TRANSPOSON Ac/Ds PADA PADI MUTAN IR64 CLARA SHINTA AYU FITRIYANTI Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2014

6

7 Judul Skripsi : Deteksi Gen hpt dan bar untuk Uji Kestabilan Transposon Ac/Ds pada Padi Mutan IR64 Nama : Clara Shinta Ayu Ftiriyanti NIM : G Disetujui oleh Popi Asri Kurniatin, S.Si. Apt. M.Si. Pembimbing I Dr. Ir. Budi Santosa, MP Pembimbing II Diketahui oleh Dr Ir I Made Artika, MApp, Sc Ketua Departemen Tanggal Lulus:

8

9

10

11 PRAKATA Bismillahirrahmanirrahim Puji dan syukur kepada Allah SWT atas segala karunia-nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini, serta shalawat dan salam semoga tercurahkan pada Rasulullah SAW. Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada Popi Asri Kurniatin, S.Si Apt. M.Si. dan Dr. Ir. Budi Santosa, MP selaku ketua dan anggota pembimbing skripsi yang dilaksanakan di laboratorium Biologi Molekuler, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Cimanggu-Bogor. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada orang tua, adik, dan keluarga atas segala doa, kasih sayang, dan motivasinya. Ucapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada Dr Tri Joko Santoso SP. MSi, Mba Dewi, Ka Falin, Mba Mira, Vita, Tuhfah, Kiki, Siska, Sisca, Hilda, Sari serta rekan-rekan Biokimia 46 yang lain atas bimbingan, doa dan dukungannya sehingga penelitian ini dapat diselesaikan dengan baik Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penulisan ini. Oleh karena itu, penulis mengharapkan saran dan kritik yang membangun dan berguna dalam penulisan ini. Penulis juga berharap karya tulis ilmiah ini dapat bermanfaat bagi semua pihak Bogor, Februari 2014 Clara Shinta Ayu Fitriyanti

12 DAFTAR ISI ABSTRAK ii DAFTAR GAMBAR iii DAFTAR LAMPIRAN iii PENDAHULUAN 1 METODE 2 Bahan dan Alat 2 Prosedur Penelitian 3 HASIL 7 Konfirmasi Keberadaan Transposon Ac/Ds pada Tanaman Padi Generasi T0 7 Analisis Jumlah Salinan (copy number) T-DNA dengan Hibridisasi Southern 7 Uji Ketahanan Terhadap Herbisida Basta pada Tanaman Padi Generasi T1 9 Analisis Kestabilan Transposon Ds pada Tanaman Padi Generasi T1 9 PEMBAHASAN 11 Konfirmasi Keberadaan Transposon Ac/Ds pada Tanaman Padi Generasi T0 12 Analisis Jumlah Salinan (copy number) T-DNA dengan Hibridisasi Southern 13 Uji Ketahanan terhadap Herbisida Basta pada Tanaman Padi Generasi T1 13 Analisis Kestabilan Transposon Ds pada Tanaman Padi Generasi T1 14 SIMPULAN 15 DAFTAR PUSTAKA 15 Lampiran 17 RIWAYAT HIDUP 20

13 DAFTAR GAMBAR 1 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR dengan primer basta pada tanaman generasi T0 8 2 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR dengan primer hpt pada tanaman generasi T0 8 3 Hasil hibridisasi Southern pada tanaman padi IR64 generasi T0 8 4 Hasil pengolesan basta pada tanaman 9 5 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR dengan primer basta pada Tanaman padi T Elektroforegram hasil amplifikasi PCR dengan primer hpt pada tanaman generasi T Peta T-DNA genom yang digunakan pada transformasi transposon Ac/Ds 12 DAFTAR LAMPIRAN 1 Konsentrasi dan kemurnian DNA tanaman padi T Konsentrasi dan kemurnian DNA tanaman padi T Motif sekuen primer yang digunakan 19

14

15

16

17 PENDAHULUAN Beras adalah sumber bahan pangan fungsional, yaitu bahan makanan alami yang mengalami pengolahan dan mengandung satu atau lebih komponen pembentuk dengan fungsi-fungsi fisiologis tertentu dan bermanfaat bagi kesehatan (Sisharmini 2009). Beras mempunyai nilai ekonomi yang penting dan merupakan makanan pokok bagi sebagian besar belahan dunia terutama Asia. Tanaman padi (Oryza sativa L.) sebagai penghasil beras akan menjadi salah satu komoditas pangan utama dan sumber utama gizi maupun energi bagi lebih dari 90% penduduk Indonesia saat ini hingga beberapa tahun mendatang (BPS 2011). Berdasarkan hal tersebut maka kualitas dan produksi tanaman padi perlu ditingkatkan untuk memenuhi kebutuhan penduduk Indonesia. Eksplorasi kekayaan genom padi, melalui pencarian gen-gen dalam genom padi yang berperan dalam menentukan suatu fenotipe, diperlukan untuk memperoleh informasi mengenai fungsi gen-gen padi sehingga kualitasnya dapat ditingkatkan (Jeoung et al. 2002). Menurut Bouchez dan Hofte (1998) ada dua pendekatan yang dilakukan untuk menganalisis fungsi gen, yaitu forward genetics dan reverse genetics. Pendekatan forward genetics dilakukan dengan menganalisis fungsi gen dari tanaman mutan kemudian dilanjutkan ke sekuen gennya. pendekatan reverse genetics dilakukan dengan berpedoman dari informasi sekuen gen yang telah diketahui. Sistem mutagenesis dengan transposon Ac/Ds telah banyak diterapkan sebagai strategi reverse genetics analisis fungsi gen-gen suatu tanaman. Transposon adalah segmen DNA spesifik yang dapat bertransposisi dari satu lokasi ke lokasi lain di dalam genom sel dengan cara memotong segmen suatu DNA, kemudian meligasinya. Transposon Ac/Ds terdapat secara alami di dalam tanaman jagung yang menyebabkan penampakan warna yang beraneka ragam pada lapisan biji jagung. Transposon Ac/Ds pertama kali ditemukan oleh Barbara McClintock tahun 1948 (Griffth et al. 1999). Transposon Ac (activator) telah mengalami delesi pada bagian inverted repeat sehingga bersifat tidak mampu pindah (immobile), namun mampu menghasilkan enzim transposase (otonom) (Greco et al. 2003). Transposon Ds (dissociation) mengalami delesi pada bagian gen transposase sehingga tidak mampu menghasilkan enzim transposase (non-otonom) namun mampu pindah (mobile) (Brooker 2005). Transposon Ds akan berpindah posisi dalam genom pada tempat berbeda dan tersisip pada gen-gen fungsional. Sedangkan elemen Ac menyandikan suatu enzim yang mengaktifkan elemen Ds untuk bertransposisi. Transposon Ac yang bersifat immobile dan transposon Ds yang bersifat nonotonom telah berhasil dikembangkan dalam suatu T-DNA. Transposon Ds akan stabil dalam suatu genom jika tidak disertai dengan transposon Ac (Kolesnik et al. 2004). Penelitian ini menggunakan sampel tanaman padi kultivar IR64 yang telah disisipi T-DNA transposon Ac/Ds. Selama proses transformasi telah disisipkan gen-gen yang memiliki ketahanan terhadap antibiotik dan herbisida sebagai marka penyeleksi. Marka penyeleksi (selectable marker) atau gen penyeleksi merupakan gen yang berguna untuk menyeleksi atau membedakan sel, jaringan, organ atau tanaman yang tertransformasi dari yang tidak tertransformasi. Marka penyeleksi

18 2 yang digunakan pada penelitian ini yaitu gen hpt dan gen bar. Gen hpt merupakan marka penyeleksi yang mengidentifikasikan keberadaan transposon Ac sedangkan gen bar mengidentifikasikan keberadaan transposon Ds. Gen hpt diisolasi dari Escherichia coli. Gen hpt penyandi higromisin fosfotransferase merupakan gen yang memiliki ketahanan terhadap antibiotik. Enzim higromisin fosfotransferase yang dihasilkan gen hpt, dapat mendetoksifikasi aminosiklitol antibiotik higromisin B (Rodriguez & Nottenburg 2002). Gen bar (basta resistant) merupakan gen yang membawa ketahanan terhadap fosfinotrisin (PPT), bahan aktif herbisida bialaphos dan basta. Gen ini dapat diisolasi dari bakteri Streptomyces dan Alcaligenes. Gen bar memberi ketahanan terhadap senyawa antibiotik bialaphos yang terdapat pada herbisida nonselektif basta. Nama lain senyawa bialaphos ialah glufosinat atau fosfinothrisin (Webb dan Moris 1990). Sistem transposon Ac/Ds (activator/disociation) telah menunjukkan aktivitasnya dan potensial digunakan sebagai mutagen penyisipan yang efektif. Sistem ini juga merupakan metode alternatif yang lebih efisien untuk memperoleh tanaman padi mutan. Posisi mutasi yang berbeda-beda pada sejumlah besar tanaman padi dapat diperoleh melalui perpindahan (aktivitas) transposon Ds (Greco et al. 2001). Dengan demikian, identifikasi mutasi gen untuk mengetahui fungsi gen-gen padi kultivar IR64 yang belum diketahui dapat dilakukan tanpa melakukan transformasi secara berulang-ulang. Namun untuk memperoleh tanaman mutan yang diinginkan, diperlukan transposon yang stabil sehingga tidak terjadi perpindahan ke kromosom lain. Transposon Ds akan stabil dalam suatu genom jika tidak disertai dengan transposon Ac. Berdasarkan hal tersebut maka digunakan gen bar dan hpt sebagai marka penyeleksi untuk mengidentifikasi transposon Ac/Ds sehingga dapat dianalisis kestabilannya. Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan tanaman padi IR64 mutan generasi T0 yang mengandung transposon Ac/Ds dengan satu salinan (single copy) T-DNA melalui analisis hibridisasi southern dan mengetahui kestabilan transposon Ds pada tanaman padi T1 melalui PCR dengan menggunakan primer bar dan hpt. Penelitian ini diharapkan dapat menghasilkan gen-gen padi mutan IR64 hasil transformasi transposon Ac/Ds yang stabil dan membantu dalam menghasilkan perpustakaan mutan padi kultivar IR64 pembawa transposon Ac/Ds yang dapat digunakan sebagai sumber plasma nutfah dan dapat dilepas sebagai varietas unggul baru. METODE Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan pada isolasi DNA adalah 26 sampel daun padi mutan varietas IR64 generasi T0 dan 26 sampel padi generasi T1, nitrogen cair, bufer ekstraksi, isopropanol, bufer TE (Tris-EDTA), Na-asetat 3 M ph 5.2, etanol 70%, HCl 1N, HCl 0.1N, bufer CTAB (Cetyl Trimethylammonium Bromide), chisam. Bufer ekstraksi, Tris-HCl 1 M ph 8.0, Ethyline Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) 0.5 M ph 8.0, NaCl 5 M. Elektroforesis memerlukan bahan-bahan seperti bufer TE, loading buffer, agarosa, Ethidium bromide (EtBr)

19 3 1% (w/v), bufer TAE (Tris Acetat Acid-EDTA) 0.5X, marker 1 kb plus DNA ladder, 10x bufer, dntps, Taq DNA Polimerase, primer bar dan primer hpt. Bahan yang digunakan pada hibridisasi southern adalah DIG- 11-dUTP (Digoxigenin-11-dUTP), anti-digoxigenin, enzim restriksi DraI, kertas blotting, kertas Whatmann 3MM, membran nilon Hybond N+, Amersham Hyperfilm (GE Healthcare), substrat CDP-Star, larutan developer dan larutan fixer, Tween 20, plasmid (100 pg/ L), LiCl, heksanukleotida, klenow enzyme, reagen blocking, larutan depurinasi, larutan denaturasi, larutan netralisasi, larutan 20x SSC (Saline- Sodium Citrate), larutan washing 1, larutan washing 2, larutan bufer 1, larutan washing buffer, larutan bufer 2, larutan antibody, larutan bufer 3, larutan stripping buffer, dan larutan herbisida basta yang digunakan dalam uji basta. Peralatan yang digunakan dalam proses isolasi DNA pada penelitian ini adalah mortar, tabung sentrifuse, sentrifus Beckman Coulter Allegra TM 64R Centrifuge, penangas air, pipet mikro, pipet Mohr, bulp, sudip, tabung mikro. Analisis konsentrasi DNA menggunakan spektrofotometer nanodrop. PCR Biometra T-personal digunakan untuk amplifikasi DNA. Elektroforesis menggunakan peralatan parafilm, cetakan gel, sisir, power supply, dan alat untuk dokumentasi hasil pengamatan elektroforesis UV (UV Transilluminator 2201 Sigma). Peralatan gelas lain yang digunakan adalah gelas piala, labu erlenmeyer, cawan petri dan gelas ukur. Prosedur Penelitian Isolasi DNA Padi (Dellaporta et al. 1983) Sebanyak 2 gram daun tanaman padi IR64 transgenik generasi T0 dimasukkan ke dalam mortar dan disiram dengan nitrogen cair, kemudian digerus hingga menjadi serbuk. Serbuk tersebut kemudian dimasukkan ke dalam tabung berukuran 50 ml dan diberi label nama sampel. Selanjutnya ditambahkan 15 ml larutan 1 (100 ml bufer ekstraksi gram natrium bisulfit) dan 1 ml SDS 20%, dikocok hingga homogen, dan diinkubasi pada suhu 65 0 C selama 15 menit (setiap 5 menit dikocok). Setelah itu, ditambahkan 5 ml kalium asetat 5 M, lalu tabung dibolak-balik hingga homogen dan diinkubasi di dalam bak es selama 20 menit. Suspensi disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 20 menit. Kemudian supernatan (cairan) disaring menggunakan kertas saring dan dipindahkan ke dalam tabung 50 ml yang baru. Isopropanol dingin ditambahkan 10 ml ke dalam cairan dan diinkubasi di dalam freezer dengan suhu (-20 0 C) selama 30 menit. Kemudian sampel disentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm selama 20 menit lalu cairan di buang. Sampel disentrifugasi lagi pada kecepatan 4000 rpm selama 2 menit dan sisa dari cairan dibuang menggunakan pipet mikro sehingga cairan tidak ada sama sekali di dalam tabung tersebut. Tabung yang berisi pelet di keringkan di dalam oven dengan suhu 65 0 C selama 10 menit. Pelet dilarutkan ke dalam 700 akuades dan 5 RNAse lalu diinkubasi pada suhu 65 0 C selama 30 menit dengan di kocok setiap 10 menit. Suspensi tersebut dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml dan disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama 10 menit. Kemudian supernatan dipindahkan ke dalam tabung 1.5 ml yang baru. Sebanyak 75 µl natrium asetat 3 M dan 500 µl isopropanol dingin

20 4 ditambahkan dalam tabung tersebut dan dicampur serta diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Sampel disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama 5 menit dan supernatan dibuang. Pelet yang diperoleh dicuci dengan 500 µl etanol 70%. Campuran disentrifugasi kembali selama 2 menit pada kecepatan rpm dan cairan dibuang. Kemudian disentrifugasi kembali pada kecepatan selama 30 detik dan cairan dibuang dengan pipet. Pelet dikeringkan dalam oven selama 10 menit. Pelet yang telah kering dilarutkan dengan 50 µl larutan TE 0.1x. Analisis Kuantitatif DNA Genom dengan Nanodrop (Thermo Fisher Scientific 2009) Sebanyak 2 µl larutan TE dimasukkan ke dalam lubang ukur. Setelah itu, tutup nanodrop dan tekan tombol read blank pada komputer. Sisa buffer TE dibersihkan dengan kertas tissue. Sampel DNA dimasukkan sebanyak 2 µl ke dalam lubang ukur, kemudian pilih menu read sample. Hasil pengukuran berupa nilai kemurnian sampel akan muncul dalam satuan konsentrasi ng/ µl. Kemudian DNA dapat dilihat berdasarkan nilai Å260/Å280. Amplifikasi DNA dengan PCR (Trijatmiko et al. 2011) Amplifikasi dengan teknik PCR dilakukan dengan menggunakan dua pasang primer untuk gen ketahanan basta (bar) dan gen ketahanan higromisin (hpt). Sekuen primer yang digunakan dapat dilihat pada Lampiran 3. Total volume reaksi PCR adalah 20 µl yang terdiri 2 µl 10x bufer PCR, 1.2 µl MgCl2 25 mm, 0.4 µl dntp mix 10 mm, 1 µl primer forward 10 µm, 1 µl primer reverse 10 µm, 0.16 µl Taq DNA polimerase 5 U/µL, 5 µl DNA 10 ng/ µl, dan 9.24 µl ddh2o. Reaksi amplifikasi dilakukan dengan mesin PCR. Profil PCR yang digunakan adalah pre-denaturasi 94 0 C selama 5 menit, denaturasi 94 0 C selama 30 detik, penempelan primer 65 0 C selama 30 detik, dan pemanjangan primer 72 0 C selama 30 detik. Proses tersebut diulang sebanyak 30 siklus. Analisis Kualitas DNA dengan Elektroforesis Gel Agarosa (Sambrook & Russell 2001) Disiapkan terlebih dahulu 1% gel agarosa dengan pada cetakan. Sebanyak 1.2 gram agarosa dicampur dengan 120 ml 1x bufer TAE. Larutan tersebut dimasukkan ke dalam microwave selama 2 menit. Larutan yang sudah tercampur dimasukkan ke dalam cetakan agar yang sudah diberi cetakan sumur. Setelah gel agarosa padat, gel dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis yang berisi 1x bufer TAE. Sebanyak 10 µl produk PCR dicampur dengan 2 µl loading dye, kemudian dimasukkan ke dalam sumur gel. Disertakan 1 kb ladder sebagai marker untuk melihat ukuran DNA. Tahap selanjutnya sampel DNA dialiri arus dengan voltase 80 volt selama 35 menit. Gel agarosa direndam dalam larutan etidium bromida (20 mg/l) selama 10 menit, kemudian dengan air selama 10 menit. Gel Pita-pita DNA selanjutnya ditampilkan dengan chemidoc gel system. Hibridisasi Southern (Trijatmiko et al. 2011) DNA sampel padi transgenik generasi T0 dipotong menggunakan enzim restriksi DraI. Pemotongan dilakukan dengan total volume 150 pada masingmasing DNA. Sebanyak 33 µl akuades dan 15 µl larutan buffer 10x dimasukkan ke dalam tabung steril 1.5 ml, lalu ditambahkan enzim restriksi DraI (10 U/ µl)

21 2 µl. Selanjutnya 100 µl DNA hasil isolasi dimasukkan dalam tabung 1.5 ml dan diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 16 jam. Ditambahkan sebanyak 0.1 x volume natrium asetat (3M) dan 2.5 x volume etanol 96%. Kemudian tabung diinkubasi pada suhu C selama 2 jam. Tabung disentrifugasi pada kecepatan rpm selama 10 menit pada suhu 4 0 C. Cairan dibuang kemudian ditambahkan etanol 70% sebanyak 500 µl, lalu disentrifugasi kembali dengan kecepatan rpm selama 2 menit. Cairan kembali dibuang menggunakan pipet 20 µl dan dikeringkan selama 2 menit. Tahap selanjutnya, sebanyak 15 µl 0.1x TE dan 3 µl loading dye ditambahkan ke masing- masing tabung tersebut, kemudian tabung diinkubasi pada suhu 65 0 C selama 15 menit. Pelabelan marker 1 Kb dilakukan dengan menyiapkan 10x dntp mix di dalam tabung 0.5 ml (1 mm datp 2 µl, 1 mm dctp 2 µl, 1 mm dgtp 2 µl, 0.65 mm dttp 1.3 µl, dan 0.35 mm DIG-11-dUTP 7 µl). Tahap selanjutnya, sebanyak 3 µl 1 Kb, 2 µl 10x heksanukleotida, 2 µl 10x dntp mix, 1 µl klenow enzyme, dan 12 µl nucleid acid free water (NF) dimasukkan ke dalam tabung 1.5 ml. Setelah itu, tabung yang berisi campuran larutan tersebut dipanaskan pada suhu C selama 10 menit lalu dimasukkan ke dalam es selama 2 menit, kemudian diinkubasi pada suhu 37 0 C selama 3 jam. Ditambahkan 2 µl EDTA 0.2 mol/µl dan 2.5 µl LiCl 4 N serta 75 µl etanol absolut. Tahap berikutnya, tabung disimpan pada frezzer selama 1 jam dan disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama 5 menit. Cairan dibuang lalu pelet dicuci dengan etanol 70%. Tahap terakhir, etanol 70% dibuang dan pelet dikeringkan menggunakan oven dengan suhu 50 0 C atau dikering anginkan kemudian pelet dilarutkan pada bufer TE 1x sebanyak 50 µl. Proses transfer DNA tanaman padi transgenik yang dipotong dengan menggunakan enzim restriksi DraI ke membran Hybond -N+ diawali dengan dibuat gel agarosa dengan konsentrasi 0.7% dalam 1x buffer TAE (Tris Acetat acid-edta) dan didiamkan hingga padat. DNA yang telah di potong kemudian dimasukkan sebanyak 18 µl dan dimasukkan sebanyak 5 µl marker hpt yang telah dilabel oleh DIG ke dalam masing- masing sumur selama 16 jam (semalam) pada tegangan 20 volt. Di hari berikutnya, tegangan diubah menjadi 15 volts dan ditunggu hingga 5 jam. Gel kemudian direndam dalam larutan depurinasi selama 10 menit, kemudian dibilas dengan menggunakan akuades, diikuti dengan perendaman dalam larutan denturasi selama 2 x 15 menit, dan terakhir direndam dalam larutan netralisasi selama 2 x 15 menit. Kemudian gel direndam dengan larutan 20x SSC selama 10 menit. Semua proses tersebut dilakukan pada suhu ruang. Transfer DNA ke membran Hybond N+ dilakukan dengan proses kapiler menggunakan 20x bufer SSC selama 20 jam. Setelah DNA berpindah ke membran, DNA pada membran difiksasi menggunakan UV selama 5 menit pada 302 nm. Pelabelan pelacak gen dilakukan menggunakan teknik amplifikasi PCR. Reaksi PCR dengan total volume 50 µl menggunakan primer hpt forward dan reverse masing-masing 1 µl (5 mm), 5 µl 10x buffer PCR, 3 µl MgCl2 (25 mm), 0.5 µl datp (10 mm), 0.5 µl dgtp (10 mm), 0.5 µl dctp (10 mm), 0.44 µl dttp (10 mm), 0.4 µl enzim Taq DNA polimerase (5 U/ µl), dan 5 µl pelacak Hpt (100 pg/ µl). Profil suhu yang digunakan adalah predenaturasi 95 0 C selama 2 menit, dilanjutkan dengan 30 siklus denaturasi pada suhu 95 0 C selama 30 detik, penempelan primer pada suhu 60 0 C selama 30 detik, dan pemanjangan 5

22 6 pada suhu 72 0 C selama 40 detik. Tahapan akhir PCR dilakukan pemanjangan akhir pada suhu 72 0 C selama 7 menit. Untuk mengetahui keberhasilan pelabelan pelacak, sebanyak 5 µl produk PCR labeling dengan Dig-11-dUTP berdampingan dengan produk PCR tanpa DIG-11-dUTP dengan teknik elektroforesis pada gel agarosa 1% (w/v) dan hasilnya dianalisis dengan menggunakan program dokumentasi CEMIDOC. Membran yang mengandung DNA kemudian dihibridisasi dengan pelacak yang sudah terlabel. Proses ini dimulai dengan memanaskan larutan DIG Easy Hyb pada suhu 42 0 C. Membran direndam dengan larutan DIG Easy Hyb sebanyak 50 µl yang diletakkan dalam kotak plastik dan digoyang pada suhu 42 0 C selama 3 jam. Setelah itu larutan DIG Easy Hyb dimasukkan ke dalam tabung 50 ml dan ditambahkan dengan larutan pelacak yang telah dilabel, kemudian dimasukkan kembali ke dalam kotak plastik dan digoyang kembali selama 16 jam pada suhu 42 0 C. Membran kemudian dicuci dengan larutan Wash 1 pada suhu kamar selama 2 x 5 menit, diikuti dengan pencucian dengan larutan Wash 2 pada suhu 68 0 C selama 2 x 15 menit. Membran diseimbangkan dengan larutan washing buffer selama 2 menit, diikuti dengan inkubasi membran dalam larutan bufer 2 selama 2 jam. Membran diinkubasi selama 30 menit dalam 40 ml larutan Anti- Digoxigenin-Alkalin Fosfatase atau Antibody conjugate (Anti-DIG) (Roche). Membran dipindahkan ke dalam kotak plastik baru untuk menghilangkan kelebihan antibody conjugate, membran diinkubasi selama 2 x 15 menit dalam washing buffer. Membran direndam dengan larutan bufer 3 selama 3 menit. Untuk pendeteksian sinyal dilakukan penambahan substrat CDP-Star ke membran. Kemudian membran ditutup dengan plastik wrap dan diletakkan ke dalam kaset. Film X- Ray diletakkan di atas membran dan didiamkan hingga 6 jam. Proses selanjutnya film X-Ray direndam dengan larutan developer selama 45 detik, air 30 detik, dan larutan fixer selama 30 detik maka jejak dari cahaya yang dihasilkan bisa dilihat sebagai pita-pita pada film X-Ray. Aklimatisasi Aklimatisasi dilakukan secara bertahap, biji padi T1 dikecambahkan dalam cawan petri yang berisi air secukupnya selama kurang lebih satu minggu. Terdapat 3 tanaman padi T0 yang diteruskan menjadi generasi T1 dan biji padi yang digunakan berjumlah 50 biji untuk setiap tanaman. Biji padi yang telah tumbuh menjadi kecambah dipindahkan ke dalam bak plastik ukuran 44 cm x 34 cm x 15 cm yang berisi tanah sawah selama dua minggu. Biji padi yang bertahan hidup selama periode aklimatisasi selanjutnya dipindahkan ke dalam pot plastik dengan volume 10 l yang berisi tanah sawah. Pengujian Ketahanan Tanaman Padi Generasi T1 terhadap Basta Pengujian ketahanan tanaman terhadap basta dilakukan dengan cara mengolesi ujung daun tanaman padi dengan larutan herbisida basta dengan konsentrasi 200 mg/l. Setelah 3 hari setelah perlakuan kemudian dilakukan pengamatan terhadap daun padi. Tanaman dikatakan tahan jika daun tidak terbakar (warna daun tetap hijau) dan tidak tahan jika daun menjadi terbakar (warna daun coklat) pada area daun yang diolesi larutan basta.

23 7 Isolasi DNA Tanaman Padi Generasi T1 (Doyle & Doyle 1987) Daun padi yang telah dipotong-potong dimasukkan ke dalam tabung mikro berukuran 2 ml, ditempatkan pada wadah berisi liquid nitrogen (LN) kemudian digerus menggunakan sumpit, dan ditambahkan 800 µl bufer CTAB. Hasil gerusan diinkubasi di dalam penangas air pada suhu 65 C selama 15 menit, kocok (bolak-balik tabung) setiap 5 menit sekali. Pemurnian DNA dilakukan melalui penambahan natrium asetat 3M sebanyak 1/10 volume atau sekitar 100 µl dan 1000 µl kloroform isoamilalkohol ke dalam tabung, kemudian kocok hingga merata. Suspensi selanjutnya disentrifus dengan kecepatan rpm selama 5 menit. Supernatan dipindahkan ke tube baru. Pemekatan DNA dilakukan dengan penambahan 70 µl Na-asetat (1/10 volume) dan 600 µl isopropanol (2/3 volume) ke dalam supernatan dan dicampur perlahan. Sampel disentrifus pada kecepatan rpm selama 5 menit. Pelet dicuci dengan 200 µl etanol 70 %. Campuran disentrifus selama 5 menit dengan kecepatan rpm. Pelet selanjutnya dikeringkan dalam oven selama 10 menit. Pelet yang telah kering dilarutkan dalam 50 µl bufer TE yang mengandung ribonuklease dan diinkubasi pada 37 C selama 30 menit. HASIL Konfirmasi Keberadaan Transposon Ac/Ds pada Tanaman Padi Generasi T0 Sampel tanaman padi yang digunakan pada penelitian ini berjumlah 27. Sampel diisolasi menggunakan metode isolasi DNA skala besar yang mengacu pada Dellaporta et al. (1983). Masing-masing sampel DNA hasil isolasi diteteskan ke dalam mesin nanodrop untuk mengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA hasil isolasi. Kemurnian DNA padi yang diperoleh dari hasil isolasi menggunakan metode skala besar berkisar antara yang mengindikasikan masih terkandungnya protein dan RNA. Setelah isolasi DNA dilakukan amplifikasi dengan mesin PCR. Primer bar dan hpt digunakan untuk mengetahui keberadaan transposon Ac dan transposon Ds. Berdasarkan analisis elekroforegram dari hasil amplifikasi dengan primer bar (Gambar 1), diketahui bahwa seluruh sampel menghasilkan pita DNA yang mengindikasikan keberadaan gen bar. Hasil elektroforesis dari hasil amplifikasi hpt (Gambar 2) menunjukkan bahwa semua sampel menghasilkan pita DNA, hal ini yang menunjukkan bahwa seluruh sampel mengandung gen hpt. Analisis Jumlah Salinan (copy number) T-DNA dengan Hibridisasi Southern T-DNA sampel yang diharapkan untuk dilanjutkan pada tanaman generasi kedua (T1) adalah T-DNA yang stabil. T-DNA suatu tanaman yang stabil akan menghasilkan satu pita pada hasil hibridisasi Southern. Berdasarkan Gambar 3 diketahui bahwa sampel yang menghasilkan satu pita DNA adalah sampel 1.1, 1.2, 5.1, 5.2, 5.3, 4.5, 4.10, 4.11, 4.12, 4.13, 4.14, 4.15, 4.16 dan Sampel yang lain tidak menghasilkan pita DNA sama sekali. Tiga dari sampel positif kemudian ditanam kembali untuk diuji lebih lanjut. Tiga sampel tersebut adalah 5.3, 4.5 dan 4.12.

24 bp bp 500 bp bp bp 500 bp Gambar 1 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR dengan primer bar pada tanaman generasi T0. A: air, K: kontrol (IR64), P: plasmid B2, : sampel (elektroforegram kedua merupakan lanjutan dari elektroforegram pertama) bp bp 500 bp bp bp 500 bp Gambar 2 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR dengan primer hpt pada tanaman generasi T0. A: air, K: kontrol (IR64), P: plasmid, : sampel. Gambar 3 Hasil hibridisasi Southern pada tanaman padi IR64 generasi T0. K: kontrol (IR64), P: plasmid, : sampel (5.3, 4.5, 4.12 : 3 sampel yang dilanjutkan ke T1).

25 9 Uji Ketahanan Terhadap Herbisida Basta pada Tanaman Padi Generasi T1 Tiga dari sampel padi generasi T0 yang memiliki satu salinan T-DNA stabil dipilih untuk ditanam menjadi tanaman padi generasi kedua (T1). Tiga genotipe tersebut adalah 5.3, 4.5 dan Ketiga genotipe tersebut dipilih sebab menghasilkan biji padi yang cukup banyak. Berdasarkan hukum segregasi Mendel, generasi kedua akan memenuhi perbandingan 3:1 antara pembawa sifat dan yang bukan pembawa sifat (Brooker 2005). Hal tersebut memungkinkan muncul kembali individu-individu yang memiliki genotipe tipe liar (wild type) karena masih mengalami segregasi dan belum homogen. Oleh karena itu digunakan biji padi yang cukup banyak pada tahap aklimatisasi dengan harapan untuk memperbesar kemungkinan memperoleh individu pembawa transposon Ac/Ds. Tanaman padi yang tidak mengandung gen bar akan mengalami nekrosis (Gambar 4) setelah perlakuan basta. Sebaiknya tanaman yang mengandung gen bar akan menunjukkan ketahanan terhadap herbisida basta. Hasil pengamatan menunjukkan sebanyak 8 tanaman padi dari sampel 5.3 menunjukkan ketahanan terhadap basta, 5 tanaman pada sampel 4.5 dan 7 tanaman pada sampel A B Gambar 4 Hasil pengolesan basta pada tanaman. A: negatif dan B: positif. Analisis Kestabilan Transposon Ds pada Tanaman Padi Generasi T1 Sampel yang menunjukkan hasil positif, disertai dengan beberapa sampel hasil negatif yang akan digunakan sebagai perbandingan, kemudian diisolasi dengan metode isolasi DNA yang mengacu pada Doyle et al. (1987). Kemurnian DNA padi yang diperoleh dari hasil isolasi menggunakan metode skala besar berkisar antara yang menunjukkan DNA hasil isolasi mempunyai kemurnian yang baik. Analisis kestabilan transposon Ds dilakukan dengan amplifikasi tanaman padi generasi T1 dengan primer bar dan hpt. Berdasarkan Gambar 5 diketahui bahwa sebagian besar sampel menunjukkan hasil positif terhadap primer bar kecuali sampel 4.12 (-1), dan 4.12 (-2). Sampel yang menunjukkan hasil positif dari amplifikasi PCR dengan primer hpt (Gambar 6) berjumlah 11 sampel.

26 bp bp 500 bp bp bp 500 bp Gambar 5 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR dengan primer bar pada tanaman padi T1. K1 dan K2: kontrol (IR64), 5.3 (1-8): sampel positif, 5.3 (-1, -2): sampel negatif, 4.5 (15): sampel positif, 4.5 (-1, -2): sampel negatif, 4.12 (1-7): sampel positif, 4.12 (-1, 2): sampel negatif bp bp 500 bp bp bp 500 bp Gambar 6 Elektroforegram hasil amplifikasi PCR dengan primer hpt pada tanaman generasi T1. K1 dan K2: kontrol (IR64), 5.3 (1-8): sampel positif, 5.3 (-1, -2): sampel negatif, 4.5 (1-5): sampel positif, 4.5 (-1, -2): sampel negatif, 4.12 (1-7): sampel positif, 4.12 (-1, -2): sampel negatif (elektroforegram kedua merupakan lanjutan dari elektroforegram pertama). Tanaman padi yang mengandung transposon Ds stabil adalah tanaman yang menunjukkan hasil positif terhadap primer bar dan menunjukkan hasil negatif terhadap primer hpt. Analisis dari hasil amplifikasi dengan primer bar dan hpt seperti yang tertera pada Tabel 1 bahwa sampel yang memiliki transposon Ds stabil berjumlah 14 sampel. Hal ini mengidentifikasikan bahwa transposon Ds

27 11 telah terpisah dari transposon Ac pada proses segregasi tanaman padi T1. Hasil yang demikian sesuai dengan harapan sebab transposon Ds akan stabil dalam suatu genom jika tidak disertai dengan transposon Ac (Kolesnik et al. 2004). Tabel 1 Hasil analisis kestabilan transposon Ds Sampel Hasil bar Hasil hpt keterangan IR 64 (1) - - kontrol IR 64 (2) - - kontrol 64.B2.5.3 (1) + + tidak stabil 64.B2.5.3 (2) + - stabil 64.B2.5.3 (3) + + tidak stabil 64.B2.5.3 (4) + + tidak stabil 64.B2.5.3 (5) + + tidak stabil 64.B2.5.3 (6) + + tidak stabil 64.B2.5.3 (7) + + tidak stabil 64.B2.5.3 (8) + - stabil 64.B2.5.3 (n.1) + - stabil 64.B2.5.3 (n.2) + - stabil 64.B2.4.5 (1) + - stabil 64.B2.4.5 (2) + - stabil 64.B2.4.5 (3) + + tidak stabil 64.B2.4.5 (4) + - stabil 64.B2.4.5 (5) + - stabil 64.B2.4.5 (n.1) + - stabil 64.B2.4.5 (n.2) + + tidak stabil 64.B (1) + - stabil 64.B (2) + - stabil 64.B (3) + - stabil 64.B (4) + - stabil 64.B (5) + + tidak stabil 64.B (6) + + tidak stabil 64.B (7) + - stabil 64.B (n.1) - + tidak stabil 64.B (n.2) - - Gen tidak diturunkan PEMBAHASAN Transposon Ac/Ds diintroduksi ke dalam genom tanaman padi dengan memanfaatkan T-DNA. Transposon Ds yang telah masuk ke dalam genom akan berpindah posisi jika diinduksi oleh enzim transposase pada generasi berikutnya, sehingga dapat dimanfaatkan untuk mutasi. Jika diperoleh tanaman T0 yang cukup, diharapkan dari setiap tanaman tersebut diperoleh generasi tanaman T1 dengan insersi transposon yang berbeda. Insersi transposon diharapkan terjadi pada gen penting dan menghasilkan fenotipe tanaman tertentu sehingga fungsi gen yang dirusaknya (knock out) dapat diamati pada penelitian lebih lanjut. Sampel yang digunakan pada penelitian ini adalah 27 tanaman transgenik hasil transformasi yang telah disisipkan transposon Ac/Ds sebelumnya. Berdasarkan peta T-DNA yang digunakan pada transformasi sebelumnya

28 12 (Gambar 7) menunjukkan bahwa transposon Ac telah disisipkan gen hpt dan pada transposon Ds telah disisipkan gen bar. Gen hpt dan gen bar berfungsi sebagai marka untuk mengidentifikasi keberadaan transposon Ac dan transposon Ds. Konfirmasi keberadaan transposon Ac/Ds serta kestabilannya perlu dilakukan untuk mengetahui keberhasilan transfomasi pada sampel tanaman padi generasi T0. Konfirmasi keberadaan dan integrasi transposon dapat dilakukan dengan polymerase chain reaction (PCR) dan Southern-blot. PCR merupakan cara yang popular digunakan karena dapat menganalisis secara cepat sampel yang banyak jumlahnya. Meskipun demikian, PCR mempunyai beberapa kelemahan. Hasil PCR tidak dapat menunjukkan apakah sekuen DNA sudah terintegrasi ke dalam genom tanaman atau belum (Padmadi 2009). Berdasarkan hal tersebut maka untuk mengetahui apakah seluruh basa yang ada dalam transgen terintegrasi dalam genom tanaman perlu dilakukan Southern-blot. Konfirmasi Keberadaan Transposon Ac/Ds pada Tanaman Padi Generasi T0 Metode isolasi DNA ditentukan sesuai dengan metode analisis molekuler yang akan dilakukan dan kuantitas DNA yang dibutuhkan. Analisis molekuler yang dilakukan pada tanaman padi IR64 transgenik generasi T0 adalah amplifikasi PCR dan hibridisasi Southern. Analisis gen menggunakan hibridisasi Southern membutuhkan DNA dalam jumlah banyak dan murni (Padmadi 2009). Berdasarkan hal tersebut maka dipilih metode isolasi skala besar (Dellaporta et al. 1983). Hasil penelitian Kartini (2012) juga menunjukkan bahwa metode isolasi skala besar merupakan metode isolasi yang paling tepat untuk analisis molekuler dengan Southern blot. Konfirmasi keberadaan transposon Ac/Ds pada penelitian ini dilakukan dengan polymerase chain reaction (PCR). Menurut Abdullah dan Retnoningrum (2003), teknik PCR didasarkan pada amplifikasi fragmen DNA spesifik dimana terjadi penggandaan jumlah molekul DNA pada setiap siklusnya secara eksponensial dalam waktu yang relatif singkat. Secara umum proses ini dapat dikelompokkan dalam tiga tahap yang berurutan yaitu denaturasi templat, annealing (penempelan) pasangan primer pada untai tunggal DNA target dan extension (pemanjangan atau polimerisasi), sehingga diperoleh amplifikasi DNA antara kali. Gambar 7 Peta T-DNA genom yang digunakan pada transformasi transposon Ac/Ds (Trijatmiko et al. 2005)

29 13 Primer yang digunakan untuk konfirmasi transposon Ac/Ds pada penelitian ini ada dua, yaitu primer bar dan hpt. Primer bar berfungsi untuk mengidentifikasi keberadaan transposon Ds dan primer hpt untuk mengidentifikasi keberadaan transposon Ac. Berdasarkan hasil analisis PCR (Gambar 2) diketahui bahwa seluruh sampel mengandung transposon Ac dan Ds. Hasil demikian menunjukkan transposon Ac/Ds berhasil disisipkan ke dalam gen padi. Analisis Jumlah Salinan (copy number) T-DNA dengan Hibridisasi Southern Sampel yang positif pada hasil PCR hanya menunjukkan adanya sekuen yang homolog dengan primer dan berada pada jarak yang memungkinkan dihasilkannya produk PCR. Berdasarkan hal tersebut maka untuk mendapatkan data yang lebih spesifik perlu dilakukan teknik hibridisasi Southern. Hibridisasi merupakan proses identifikasi gen-gen hasil analisis DNA dengan menggunakan enzim restriksi yang sesuai dan diidentifikasi dengan fragmen gen target yang spesifik yang telah diberi label dengan radioisotope seperti 32p fosfat radioaktif atau dengan substansi nonradioisotop (Berg et al. 2007). Hibridisasi Southern dapat menunjukkan keberadaan transgen dan jumlah salinan dari gen hasil transformasi pada tanaman transgenik. Jumlah salinan transgen (T-DNA) ditunjukkan oleh jumlah pita yang dihasilkan. Apabila jumlah salinan gen transforman terlalu banyak pada genom maka kemungkinan akan terjadi proses pembungkaman (silencing) pada gen tertentu, namun apabila gen terkopi antara 1-10X kemungkinan tidak akan menimbulkan gene silencing pada gen gen lain (Christou et al. 1991). Berdasarkan Gambar 3 diketahui bahwa terdapat 14 sampel yang menunjukkan T-DNA yang menghasilkan satu salinan (single copy). Jumlah salinan demikian adalah hasil yang diharapkan. Apabila terjadi perubahan tingkat ekspresi pada tanaman generasi selanjutnya dapat diduga karena pengaruh integrasi gen yang ditransformasikan dan bukan karena proses pembungkaman gen. Berdasarkan hasil diketahui bahwa selain sampel yang menghasilkan satu pita, sampel yang lain tidak menghasilkan pita sama sekali. Hal ini diduga karena transgen (T-DNA) masuk ke dalam sel sehingga positif ketika dideteksi dengan PCR tetapi tidak terintegrasi ke dalam genom tanaman dan tidak menghasilkan pita saat dideteksi dengan hibridisasi Southern. Marsch-Martinez et al (2002) menyatakan bahwa kegagalan saat transformasi dapat mengakibatkan T-DNA tidak terinsersi pada genom DNA. Uji Ketahanan terhadap Herbisida Basta pada Tanaman Padi Generasi T1 Salah satu metode konfirmasi sederhana dan cepat untuk mengetahui integrasi T-DNA ke dalam genom padi adalah dengan pengecatan/pengolesan daun padi transgenik dengan herbisida basta pada konsentrasi 200 mg/l (Wang dan Waterhouse 1997). Apabila gen bar telah terintegrasi ke dalam genom tanaman padi, maka ketika daun padi transgenik yang mengandung gen tersebut diolesi dengan basta akan memberikan respon ketahanan. Respon ketahanan tersebut diketahui apabila daun yang diolesi akan tetap berwarna hijau (tahan basta) sedangkan yang tidak membawa gen tersebut akan berwarna coklat atau mengalami nekrosis (Gambar 4) (sisharmini et al 2009). Hasil penelitian remelia 2009 menghasilkan 48% padi nipponbare mutan tahan basta dari seluruh sampel padi yang diuji dengan herbisida basta. Penelitian

30 14 ini menghasilkan 13% padi tahan basta dari 150 padi IR64 mutan generasi F1 yang diuji. Perbedaan hasil tersebut diduga akibat perbedaan kultivar padi yang digunakan. Tanaman yang menunjukkan hasil positif (tahan terhadap basta) mengindikasikan bahwa gen bar yang terdapat pada elemen Ds telah terintroduksi dan terekspresi pada tanaman transgenik generasi T1 yang diuji. Gen bar memproduksi enzim fosfinotrisin asetiltransferase. Enzim yang dihasilkan tersebut memberi gugus asil kepada senyawa fosfinotrisin yang dipaparkan oleh herbisida basta sehingga berubah menjadi senyawa yang tidak berbahaya bagi tanaman sehingga tanaman tidak mengalami nekrosis. Hal ini menyebabkan daun padi yang mengandung gen bar tidak berubah warna ketika dipaparkan herbisida basta. Herbisida basta mengandung senyawa fosfinotrisin yang dapat menghambat kerja enzim dalam jalur sintesis glutamin sehingga menghasilkan senyawa toksik yaitu amoniak. Senyawa toksik tersebut yang mengakibatkan sel-sel tanaman menjadi mati sehingga mengalami gejala nekrosis (daun seperti terbakar) (Kolesnik et al. 2004). Analisis Kestabilan Transposon Ds pada Tanaman Padi Generasi T1 Tanaman padi yang tahan terhadap basta diisolasi dengan metode isolasi DNA yang mengacu pada Doyle et al. (1987). Metode isolasi ini dipilih karena hanya memerlukan bahan yang sedikit dan tidak membutuhkan waktu yang lama. Keberadaan transposon Ac dan Ds dapat diketahui dengan PCR menggunakan primer yang dapat mendeteksi keberadaan gen bar dan gen hpt. Gen bar terdapat di dalam transposon Ds, sedangkan gen hpt terdapat dalam transposon Ac pada konstruksi T-DNA. Transposon Ds akan stabil dalam suatu genom jika tidak disertai dengan transposon Ac (Kolesnik et al. 2004). Berdasarkan hasil pengamatan transposon Ds stabil berhasil terdeteksi dalam 53% sampel padi IR64 mutan yang diamati. Kolesnik et al. (2004) berhasil mendeteksi lebih dari 80% transposon Ds stabil pada pengamatan populasi padi mutan nipponbare dalam skala besar. Penelitian yang dilakukan Mulyaningsih et al. (2010) berhasil mendeteksi sekitar 76% transposon Ds dari seluruh sampel padi batutegi yang diamati. Perbedaan jumlah transposon Ds stabil yang didapat pada masing-masing penelitian diduga karena perbedaan dari kultivar padi dan konstruk gen yang digunakan. Padi mutan dengan hasil positif dari analisis kestabilan ini dapat diturunkan ke generasi selanjutnya untuk mengetahui kestabilan transposon Ds lebih lanjut. Uji stabilitas gen pada tanaman transgenik perlu dilakukan untuk mengetahui kestabilan insersi transgen pada turunannya. Tanaman padi mutan yang telah stabil dapat digunakan dalam berbagai penelitian khususnya yang berkaitan dengan analisis fungsi gengen padi (Remelia 2008). Sampel 5.3(-1), 5.3(-2) dan 4.5(-1) tidak menunjukkan ketahanan terhadap uji herbisida basta namun menunjukkan hasil positif pada amplifikasi PCR dengan primer bar. Hal ini mungkin disebabkan karena gen bar pada genom tanaman bersifat resesif sehingga tidak tahan terhadap perlakuan herbisida basta namun tetap ada dalam genom tanaman. Mangoendidjojo (2003) mengatakan bahwa gen resesif tidak dapat menunjukkan ekspresinya jika berpasangan dengan gen dominan (heterozigot). Sampel 4.12(-2) tidak menunjukkan ketahanan pada uji herbisida basta serta menunjukkan hasil negatif pada PCR bar dan hpt. Hal tersebut menunjukkan bahwa sampel tidak mengandung transposon Ac/Ds atau

31 15 merupakan tipe liar yang tidak mengandung transgen. Peristiwa ini dapat terjadi karena transgen masih mengalami segregasi dan belum homogen. Berdasarkan hukum Mendel individu-individu yang memiliki genotipe tipe liar (wild type) dapat muncul kembali pada generasi kedua (T1) maupun generasi kedua (T1) karena masih mengalami segregasi dan belum homogen (Brooker 2005). Tanaman kontrol IR64 seperti yang diharapkan menunjukkan hasil negatif pada analisis PCR. Hal ini menunjukkan gen penanda bar dan hpt mampu mendeteksi dengan baik. SIMPULAN Tanaman padi IR64 transgenik generasi T0 yang mengandung satu salinan (single copy) T-DNA pembawa transposon Ac/Ds telah berhasil dikonfirmasi. Sebanyak 14 sampel menghasilkan satu salinan pada analisis hibridisasi Southern. Uji kestabilan transposon Ds pada tanaman padi IR64 transgenik generasi T1 berhasil dilakukan dan menghasilkan 12 sampel tanaman yang mengandung transposon Ds stabil. DAFTAR PUSTAKA Berg MJ, JL Tymoczko, L Stryer Biochemistry. Sixth Ed. San Fransisco (US): WH Freeman. Bouchez D, H Hofte Functional genomic in plants. Plant Physiol. 118: Brooker R J Analysis and Principle. 2 nd ed. New York (US): McGraw-Hill companies, Inc. [BPS] Badan Pusat Statistik Berita Resmi Statistik. Jakarta: BPS Christou P, Ford TL, Kofron M Production of transgenic rice (Oryza sativa L.) plants from agronomically important indica and japonica varieties via electric discharge particle acceleration of exogenous DNA into immature zygotic embryos. Biotechnology. 9: Dellaporta Sl, Jonathan W, James BH A plant DNA minipreapration: version II. Plant molecular Biology Reporter 1: Doyle JJ, Doyle JL A rapid DNA isolation from small amount of fresh leaf tissue. J Phytochem Bull 19: Griffith AJF An Introduction to Genetic Analysis. Ed ke-7. New York (US): W.H. Freeman. Greco R, PBF Ouwerkerk, AJC Taal, C Favalli, T Begiristain, P Puigmonech, L Colombo, JHC Hoge, A Pereira Early and multiple Ac transpositions in rice suitable for efficient insertional mutagenesis. PlantMolecular Biology 46: Greco R, PBF Ouwerkerk, RJ De Kam, C Sallaud, C Favalli, L Colombo, E Guiderdoni, AH Meijer, JHC Hoge, A Pereira Transpositional behavior of an Ac/Ds system for reverse genetics in

32 16 rice. Theory Applied Genetics 108: Jeoung DH, S An, HG Kang, S Moon, J Han, S Park, HS Lee, K An, & G An T-DNA insertional mutagenesis for activation tagging in rice. Plant physiology 130: Kartini RA Karakerisasi Molekuler Padi Transgenik dengan Beberapa Metode Isolasi DNA [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Kolesnik T, I Szeverenyi, D Bachman, CS Kumar, S Jiang, R Ramamoorthy, M Cal, ZG Ma, V Sundaresan, S Ramachandran Establishing an efficient Ac/Ds tagging system in rice. The Plant Journal 37: Mangoendidjojo W Dasar-dasar Pemuliaan Tanaman. Yogyakarta (ID): Kanisius. Padmadi B Identifikasi sifat aroma tanaman padi menggunakan marka berbasis gen aromatik [skripsi]. Bogor (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Remelia M Analisis T-DNA pembawa transposon Ac/Ds pada T0 dan aktivitas Ds pada T1 tanaman padi (Oryza sativa L.) kultivar nipponbare [skripsi]. Jakarta (ID): Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Indonesia. Rodriguez RC,Nottenburg C Antibiotic resistance genes and their use in genetic transformation especially in plants. CAMBIA. [internet]. [diunduh pada 2013 feb 22]. Tersedia pada Rubin E, A.A. Levy Abortive gap repair: Underlying mechanism for Ds element formation. Molecular and Cellular Biology 17(11): Sambrook J, DW Russel Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York (US): Cold-Spring Harbor Laboratory Press. Thermo Fisher Scientific Nanodrop 2000/200c Spectrpphotometer V1.0 User Manual. Wilmington (US): Thermo Fischer Scientific. Trijatmiko KR, GV Arkel, A Karaba, EV Enckevort, A Pereira Activation tagging using En-I and Ac-Ds maize transposon systems in rice. Dalam Comparative Analysis of Drought Resistance Genes in Arabidopsis and Rice. Ph.D. Thesis Wageningen University, Wageningen, The Netherland with Summaries in English, Dutch and Indonesian. p Trijatmiko KR, Olivia N, Slamet-Loedin IH, Kohli A Molecular Analysis of Transgenic Plants. NewYork (US): Springer. Wang MB, PM Waterhouse A rapid and simple method of assaying plants transformed with hygromycin or PPT resistance genes. Plant Mol. Biol. Rep. 15: Weaver NA, PW Hendrick Genetics. 3 rd ed. Dubuque (US): Wm. C. Brown Publisher. Webb KJ, Morris P Methodologies of plant transformation, In: Gatehouse AMR, Hilder VA, Boulter D, editor. Plant Genetic Manipulation for Crop Protection. United Kingdom (GB): CAB International

33 Lampiran Lampiran 1 Konsentrasi dan kemurnian DNA tanaman padi T0 No. Sampel konsentrasi DNA A260 A /280 (ng/µl) 1 IR64 WT B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B

34 18 Lampiran 2 Konsentrasi dan kemurnian DNA tanaman padi T1 No. Sampel konsentrasi DNA (ng/µl) A260 A /280 1 IR 64 (1) IR 64 (2) B2.5.3 (1) B2.5.3 (2) B2.5.3 (3) B2.5.3 (4) B2.5.3 (5) B2.5.3 (6) B2.5.3 (7) B2.5.3 (8) B2.5.3 (n.1) B2.5.3 (n.2) B2.4.5 (1) B2.4.5 (2) B2.4.5 (3) B2.4.5 (4) B2.4.5 (5) B2.4.5 (n.1) B2.4.5 (n.2) B (1) B (2) B (3) B (4) B (5) B (6) B (7) B (n.1) B (n.2)