ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN TAKSONOMI MIKROBA

Transkripsi

1 ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN TAKSONOMI MIKROBA

2 ISOLASI MIKROBA

3 Medium dan Biakan Habitat alami Medium di Lab. Medium: Nutrien yang digunakan organisme untuk tumbuh di luar habitat alaminya Biakan: Perbanyakan mikroorganisme menggunakan berbagai media

4

5 Komponen Media Makronutrien (C, N, P, K) Mikronutrien (Fe, Mg, Ca, Na) Vitamin

6 Macam Media Mikrobiologis Media Kimia Tertentu (defined) Komposisi kimia penyusun media diketahui dengan pasti Media Kompleks (undefined) Komposisi kimia penyusun media tidak diketahui dengan pasti Sering tersusun dari ekstrak tanaman atau hewan seperti ekstrak kedelai, ekstrak kecambah, protein susu, dll.

7 Macam Media Mikrobiologis Media Padat Media yang tersusun dari bahan padat Media Cair Media yang bahan-bahan penyusunnya dilarutkan dalam air Media Semipadat Media yang telah diberi bahan pembuat gel Agar (paling sering digunakan) Gelatin Silika gel (digunakan bila membutuhkan pembuat gel non-organik)

8 Tujuan Penggunaan Media Umum Nutrien Broth/Agar, Luria Bertani Selektif & Pembeda Medium bebas N Pengayaan Medium plus senyawa tertentu Pengujian Pati agar, medium nitrat

9 Media Seletif & Pembeda Media Selektif Mengandung bahan yang menghambat pertumbuhan mikroba tertentu tetapi tidak yang lain Seringkali digunakan untuk mengisolasi mikroorganisme tertentu dari populasi mikroorganisme lainnya Media Pembeda Mengandung indikator yang menghasilkan reaksi berbeda antar mikroorganisme (contoh, warna koloni berbeda) Digunakan untuk mengidentifikasi mikroorganisme

10 Media Pertumbuhan Selektif Dimaksudkan untuk memacu pertumbuhan mikrobia yang dikehendaki dan menghambat mikrobia yang tidak dikehendaki Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol (DRBC): antibiotik yang menghambat pertumbuhan bakteri. Cocok untuk isolasi Fungi Brilliant Green Agar: Senyawa kimia cat Green menghambat bakteri Gram (+). Cocok untuk isolasi bakteri Gram (-) Bismut Sulfite Agar: Cocok untuk isolasi Salmonella typhi, menghambat bakteri lain

11 Differential Media Coliform pada media Lauryl Tryptone Broth pada suhu 30 o C mampu menghasilkan gas, sedangkan non-coliform tidak tumbuh atau tumbuh tapi tidak menghasilkan gas Baird Parker Agar: untuk membedakan Staphylococcus aureus Egg Yolk: S. aureus mampu memecah egg yolk dan menberikan zona bening sekitar koloni

12 Media Padat (Agar) Media Cair (Broth)

13 Media Pengayaan Memungkinkan pertumbuhan mikroba yang diinginkan Contoh: Di dalam tanah hanya terdapat sejumlah kecil mikroba pendegradasi fenol di antara berjutajuta mikroba lainnya Medium yang mengandung fenol diinokulasi tanah tersebut dan diinkubasi Biakan yang mulai tumbuh dipindahkan/reinokulasi ke medium baru (diulang beberapa kali) Hanya mikroba yang mampu memetabolisme fenol yang tumbuh dalam medium tersebut

14 Pengayaan Azotobacter

15 Inokulasi media mengandung agar untuk memperoleh koloni tunggal

16 Biakan campuran Biakan tunggal

17 Goresan di permukaan media yang mengandung agar

18 IDENTIFIKASI MIKROBA YANG TELAH DIISOLASI

19 Taksonomi Konvensional vs. Molekular Karakter Fenotipik Termasuk di dalamnya karakter fisik dan biokimia Dua mikroba yang tak berhubungan bisa memiliki fenotipe yang sama Filogeni 70% DNA terhibridisasi? 97% kesamaan pada 16S rrna? Mikroba dengan fenotipe berbeda dapat memiliki 16S rrna yang identik

20 Karakter Fenotipik yang Digunakan dalam Taksonomi Konventional Morfologi, reaksi pengecatan Gram, dinding sel, lipida, organela inklusi dan penyimpan produk, pigment, penggunaan sumber karbon, penggunaan sumber nitrogen, penggunaan sumber sulfur, produk fermentasi, kebutuhan gas, kisaran suhu, kisaran ph, patogenisitas, hubungan simbiotik, habitat.

21 Pengecatan Gram

22

23 Prosentasi G+C Komposisi basa DNA merupakan salah satu karakter yang perlu diketahui untuk melakukan deskripsi minimal dari suatu genera dan spesies (Lévy-Frébault & Portaels, 1992; Goodfellow& O Donnell,1993). Seringkali, nisbah GC juga digunakan. Jika dua mikroba yang diduga berkerabat dekat berdasarkan kriteria fenotipiknya tidak memiliki kemiripan nilai GC, maka pada kenyataannya mereka tidaklah berkerabat dekat.

24

25 Kandungan GC Struktur duplek DNA : G-C dan A-T Kandungan G+C (mol% GC) beragam dalam mikroorganisme Titik denaturasi oleh panas meningkat OD 260 meningkat. Kesimpulan: 1. Beda kandungan G+C<5% dalam spesies yang sama 2. Perbedaan %GC hubungan kekerabatan jauh 3. Komposisi basa DNA bermanfaat untuk melihat/mengukur keberagaman genetik

26 Peranan 16S rrna 50S subunit 23S rrna 5S rrna 34 protein 70S ribosom 16S rrna 30S subunit 21 protein

27 Operon Ribosomal RNA (rrna) 16S-23S ITS 23S-5S ITS 16S rdna 23S rdna 5S 1500 bp 3000 bp 120 bp Inti Pemrosesan Sitoplasma 16S rrna 23S rrna 5S rrna

28 Filogenetik dalam Mikrobiologi 1. Memahami hubungan evolusioner (= filogenik) antar organisme Cukup berbeda daripada yang semula dipahami 2. Ekologi Mikroba Kemampuan untuk membuktikan struktur komunitas tanpa memerlukan pembiakan

29

30 Skema Penentuan Urutan Basa (sequencing) Gen 16S rrna DNA extraction 16S rrna gene PCR DNA Cloning or single-strand prep Database search Sequencing Vector + 16S rrna Phylogenetic tree

31 Amplifikasi Gen 16S rrna menggunakan PCR DNA Genom atau lisat sel elektroforesis Primer PCR dntp Taq DNA polymerase 95 C, 1 min 60 C, 1 min 72 C, 2 mins 35 daur 1636 bp Primer 9F (5 -GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ) 16S rrna gene Primer 1542R (5 -AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3 ) Gambar hasil elektroforesis pada gel agarosa dari gen 16S rrna yang diamplifikasi menggunakan PCR

32 Urutan basa (sequence) gen 16S rrna dari galur Chj707 T 1 gtttgatcct ggctcaggat gaacgctagc ggnaggccta acacatgcaa gccgagcggt 61 atggatagct tgctatccag agagcggcgt acgggtgcgt aacacgtgtg caacctgcct 121 ttatctgggg gatagccttt cgaaaggaag attaataccc cataatatgg tgtccggcat 181 cggtcgcatt gaaagcctcg gcggatagag atgggcacgc gcaagattag atagttggcg 241 gggtaacggc ccaccaagtc gatgatcttt aggggtcctg agagggagat cccccacact 301 ggtactgaga cacggaccag actcctacgg gaggcagcag tgaggaatat tggacaatgg 361 gtggaagcct gatccagcca tcccgcgtga aggatgacgg tcctatggat tgtaaacttc 421 ttttgtacag ggataaacct gccctcgtga gggcagctga aggtactgta cgaataagca 481 ccggctaact ccgtgccagc agccgcggta atacggaggg tgcgagcgtt atccggattt 541 attgggttta aagggtccgt aggcgggcct gtaagtcagt ggtgaaatct catagcttaa 601 ctatgaaact gccattgata ctgcaggcct tgagtaaatt tgaagtggct ggaataagta 661 gtgtagcggt gaaatgcata gatattactt agaacaccga ttgcgaaggc aggtcactaa 721 gatttaactg acgctgatgg acgaaagcgt ggggagcgaa caggattaga taccctggta 781 gtccacgccg taaacgatgc taactcgttt ttggacttcg ggttcagaga ccaagcgaaa 841 gtgataagtt agccacctgg ggagtacgtc cgcaaggatg aaactcaaag gaattgacgg 901 gggcccgcac aagcggtgga ttatgtggtt taattcgatg atacgcgagg aaccttacca 961 agacttaaat gggaattgac agatttagaa atagatcctc cttcgggcaa ttttcaaggt 1021 gctgcatggt tgtcgtcagc tcgtgccgtg aggtgttagg ttaagtcctg caacgagcgc 1081 aacccctgcc aacagttgcc atcattcagt tggggactct gttgggactg cctacgcaag 1141 tagagaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcacggccc ttacgtcttg ggccacacac 1201 gtaatacaat ggccggtaca gagggcagct acctggtgac aggatgcgaa tctcgaaagc 1261 cggtctcagt tcggattgga gtctgcaact cgactctatg aagctggaat cgctagtaat 1321 cgcgcatcag ccatggcgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaag 1381 ccatggaagt ctggggtacc tgaagtcggt gaccgtaata ggagctgcct agggtaaaac 1441 aggtaactag ggctaagtcg taacaagggg gg Panjang Total: 1472bp

33 Hasil Pembandingan terhadap Database NCBI menggunakan program BLAST

34 Hasil Pembandingan terhadap Database NCBI menggunakan program BLAST

35 Pohon filogenetik (cabang Chryseobacterium- Bergeyella- Riemerella) Chryseobacterium gleum ATCC35910 T (M58772) Chryseobacterium indologenes ATCC29897 T (M58773) Chryseobacterium joostei LMG18212 (AJ271010) Chryseobacterium proteolyticum 9670 (AB039830) Chryseobacterium defluvii B2 T (AJ309324) Chryseobacterium indoltheticum ATCC27950 T (M58774) Chryseobacterium balustinum ATCC33487 T (M58771) Chryseobacterium scophthalmum LMG13028 T (AJ271009) Chj707 T Ko2 100 Ko10 Bergeyella zoohelcum ATCC43767 T (M93153) Riemerella anatipestifer ATCC11845 T (U10877) Riemerella columbina LMG11607 T (AF181448) Chryseobacterium meningosepticum ATCC13253 T (M58776) Empedobacter brevis ATCC14234 T (M59052) Weeksella virosa ATCC43766 T (M93152) Ornithobacterium rhinotracheal LMG9086 T (U87101) Coenonia anatina LMG14382 T (Y17612) Cellulophaga lytica ATCC23178 T (M62796) 82 Flavobacterium aquatile ATCC11947 T (M62797)

36 Resolusi Taksonomik (yang saat ini digunakan)

37 PEMONITORAN DAN PENGHITUNGAN

38 Pengukuran Pertumbuhan Mikroba menggunakan Pembiakan Plate Counts: Dengan membuat pengenceran berseri dari cuplikan

39 Plate Count/ Pour Plate Media agar dalam cawan Petri diinokulasi (dicampurkan dengan agar pada pour plate atau diratakan di permukaan agar pada plate count) dengan pengenceran berseri

40 Plate Count/ Pour Plate Setelah masa inkubasi, jumlah koloni yang muncul di media agar dihitung. Hanya berlaku untuk agar yang memiliki koloni (CFUs)

41 Metoda Most Probable Number (MPN) Menggunakan banyak tabung Yang dihitung adalah tabung yang menunjukkan positif dan dibandingkan dengan tabel statistik MPN

42 Pengukuran Pertumbuhan Mikroba Senyawa Organik (CH 2 O) + O 2 CO 2 + H 2 O + senyawa antara metabolisme + materi sel + energi (ATP)

43 Pengukuran Pertumbuhan Mikroba dengan Pembiakan CO NaOH Na 2 CO 3 + H 2 O Pengukuran Pertumbuhan Mikroba tanpa Pembiakan ATP + D-lusiferin + O 2 lusiferase oksilusiferin + AMP + pirofosfat + CO 2 + sinar (562 nm)

44 DETEKSI MIKROBA TANPA PEMBIAKAN

45 Metoda Molekular untuk Mendeteksi Mikroba Komponen dinding sel, Protein, Lipopolisakarida Asam Nukleat RNA LMW RNA DNA Teknik menggunakan PCR

46 LMW (Low Molecular Weight) RNA Molekul RNA yang berberat molekul rendah, memiliki nilai yang tinggi untuk mempelajari keragaman dalam populasi karena karakter khususnya. Karakter LMW RNA Stabil selama masa pertumbuhan sel, dan tidak tergantung komposisi media pertumbuhan. Dimiliki oleh semua jenis sel hidup: prokaryot maupun eukaryot. Memiliki fungsi yang sama di semua sel hidup: Untuk sintesis protein. Diduga ada sejak awal evolusi.

47 LMW RNA Molekul yang mana saja? 5S rrna 5.8S rrna trna class 1 trna class 2 LMW RNA PROFILING: Elektroforesis menggunakan polyacrylamide gels

48 PROFIL LMW RNA Kenapa bisa disebut sidik jari molekular mikroba? Spesies prokaryot dari genus yang sama menunjukkan 5S rrna yang identik. Spesies eukaryot dari genus yang sama menunjukkan kombinasi zona 5S-5.8S rrna yang identik. Galur-galur dari spesies prokaryot maupun eukaryot yang sama menunjukkan profil trna yang identik

49 METODA ANALISIS DNA Ukuran dan struktur suatu molekul DNA DNA Plasmid Derajat kekerabatan antar molekul menggunakan prosedur hibridisasi Kelemahan: i. Kurang stabil di beberapa galur ii. Beberapa galur tak memiliki plasmid iii. Dapat terjadi transfer plasmid antar galur DNA Kromosom Teknik terkait PCR Penentuan urutan basa DNA (sequencing) suatu gen Profiling dari produk PCR yang dielektroforesis

50 Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba PROFILING DNA PLASMID Plasmid adalah molekul asam nukleat yang paling mudah diuji. Molekul-molekul tersebut berperan penting karena membedakan kemampuan galur mikroba. Kemampuan galur mikroba untuk menjadi simbion atau patogen ditentukan oleh plasmid yang dimilikinya. DNA plasmid mudah diekstrak dan dielektroforesis menggunakan gel agarosa sederhana.

51 Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba PROFILING DNA KROMOSOM

52 Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Thermal Gradient Gel Electrophoresis (TGGE) Prinsip: Berdasarkan amplifikasi zona GC berkeragaman tinggi (hypervariable) dari 16S rdna, dan pemisahan fragmen DNA yang dihasilkannya menggunakan elektroforesis gel poliakrilamida dengan keberadaan senyawa denaturan atau suhu bergradien linier

53 Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) Thermal Gradient Gel Electrophoresis (TGGE) Keunggulan: dapat dipercaya, reproducible, cepat dan relatif murah Pembatas: Baru dimanfaatkan untuk prokaryot. Sidik jari tidak terkait langsung dengan informasi taksonomi Analisis perbandingan urutan DNA dengan database 16S rdna Analisis pola hibridisasi dengan probe oligonukleotida spesifik taxon terhadap 16SrRNA

54 Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Prinsip: Berdasarkan pembentukan struktur melipat dari benang DNA untai tunggal yang tergantung urutan DNA penyusunnya. Biasanya terdapat di daerah berkeragaman tinggi dari gen 16S rrna.

55 Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Keunggulan: Cepat dan dapat membedakan di tingkat spesies Pembatas: Sidik jari tidak dapat digunakan untuk analisis filogenetik

56 Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Metoda terkait PCR Prinsip: Berdasarkan pola pemotongan menggunakan enzim endonuklease restriksi terhadap produk PCR. Produk PCR dihasilkan menggunakan oligonukleotida primer yang didesain untuk menempel di urutan basa DNA konsensus di berbagai gen (yang paling sering digunakan adalah gen 16S rrna) Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

57 Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Metoda terkait PCR Keunggulan: Telah digunakan baik pada prokaryot maupun eukaryot. Pembatas: Kadang-kadang tidak diperoleh pembedaan pada tingkatan taksonomik, tergantung pada zona diterapkannnya enzim endonuklease restriksi. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

58 Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Metoda terkait PCR Length heterogeneity-pcr (LH-PCR) Prinsip: Berdasarkan keragaman alami dari panjang gen 16SrRNA (atau gen lain). Oligonukleotida berfluoresen digunakan sebagai primer forward, bersama primer reverse yang tidak berlabel, untuk mengamplifikasi daerah berkeragaman tinggi dari gen 16 rrna. Fragmen yang dihasilkan dideteksi berdasarkan fluoresensi yang diinduksi laser dengan deteksi menggunakan sequencer otomatis. Pembatas: Tingkat pembedaan lebih rendah daripada teknik T-RFLP, karena kelompok taksonomi yang berbeda dapat menghasilkan produk dengan panjang yang sama

59 Operon Ribosomal RNA (rrna) 16S-23S ITS 23S-5S ITS 16S rdna 23S rdna 5S 1500 bp 3000 bp 120 bp Inti Pemrosesan Sitoplasma 16S rrna 23S rrna 5S rrna

60 Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Metoda terkait PCR Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis (ARDRA) Prinsip: Berdasarkan kespesifikan DNA ribosom pada spesies bakteri. Fragmen yang teramplifikasi pada PCR kemudian dielektroforesis. Pola yang diperoleh dianalisis secara matematis. Tingkat pembedaan pada aras spesies berguna untuk dimanfaatkan pada studi filogenetik dan ekologis

61 Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Metoda terkait PCR rdna Internal Spacer Analysis (RISA) Prinsip: Berdasarkan perbedaan panjang daerah antara (spacer) gen 16S dan 23S rrna yang teramplifikasi. Spacer ini sangat beragam dalam ukuran dan urutan basanya. Keunggulan: Teknik yang sangat baik untuk mempelajari keragaman populasi, dan dapat membedakan hingga aras spesies. Dapat digunakan untuk karakterisasi galur karena ada perbedaan sangat besar antar galur

62 Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Metoda terkait PCR Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) Prinsip: Berdasarkan pola yang terbentuk dari elektroforesis langsung hasil PCR menggunakan satu primer pendek dan suhu annealing rendah, yang menghasilkan amplifikasi acak.

63 Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Metoda terkait PCR Two-primers RAPD (TP-RAPD) Prinsip: Berdasarkan hasil amplifikasi 16S rdna menggunakan dua primer universal pada konsentrasi tinggi (10 kali) dengan suhu annealing 50-55ºC Teknik ini sangat bermanfaat untuk mempelajari taksonomi dan keragaman dengan pembedaan hingga aras spesies pada bakteri dan jamur

64 Sidik Jari DNA dari Populasi Mikroba Metoda terkait PCR Prinsip: Berdasarkan pola elektroforesisi langsung hasil PCR menggunakan primer untuk mengamplifikasi urutan DNA pendek berulang (short repetitive sequence) yang banyak ditemukan di jasad prokaryot. Repetitive element sequence-based PCR (rep-pcr) Keunggulan: These techniques show intraspecific variations among microorganisms, and have resolution at species level, so their usefulness is very similar to that of RAPD

65 DNA Fingerprinting of Microorganism Populations PCR-based methods Repetitive element sequence-based PCR Principle: Depending on the number of primers used, there are different techniques based on repetitive sequences: 1 primer: 2 primers: BOX-PCR REP-PCR ERIC-PCR