LAMPIRAN. Preparasi sampel daun binahong. Ekstraksi Daun Binahong

Transkripsi

1 LAMPIRAN Lampiran 1. Diagram Alir Kerja Preparasi sampel daun binahong Ekstraksi Daun Binahong Membuat konsentrasi ekstrak daun binahong : 1 Gram ekstrak ditambah aquades 10 ml kemudian di tambah larutan Twen 80 sebanyak 0,001 - Pengenceran serial larutan ekstrak daun binahong - Penanaman biakan bakteri pada tabung reaksi Di Inkubasi selama jam pada suhu 37 o C mengamati kekeruhan sampel dan dibandingkan dengan kontrol positif, kemudian tentukan KHM (sampel di streak pada media NA) Uji KBM, sampel di encerkan pada media NaCl 0,9 % sebanyak 9 ml. pengenceran sesuai kepadatan sel bakteri (10 6 ) pada kamar hitung (Haemocytometer) pengamatan menggunakan Mikroskop. Inkubasi selama jam pada suhu 37 o C Hitung Koloni dengan colony counter dan menentukan KBM

2 Lampiran 2.Skema kerja 2.1 Preparasi Sampel Daun Binahong Segar Sampel - Dicuci bersih dan ditiriskan - Dikeringkan dengan cara diangin-anginkan - Dikeringkan di dalam green house selam 5 hari tidak terkena sinar matahari secara langsung pada suhu 35 0 C - Dihaluskan menggunakan blender sampai berbentuk serbuk

3 2.2.Ekstraksi Daun Binahong Dengan Metode Maserasi 200 gr Sampel - Sampel dimasukkan Erlenmeyer - Ditambahkan pelarut Etil asetat sebanyak 500 ml - Direndam sambil di Shaker selama 1 jam - Dimaserasi selama 24 jam pada suhu 50º C - Difiltrasi/dipisahkan dengan kertas saring Filtrat 1 Residu - Direndam sambil dishaker selama 1 jam - Dimaserasi selama 24 jam seperti langkah - Difiltrasi/dipisahkan dengan kertas saring Filtrat 2 Residu - Direndam sambil dishaker selama 1 jam - Dimaserasi selama 24 jam - Difiltrasi/dipisahkan dengan kertas saring Filtrat 3 Residu Dibuang - Filtrat 1,2,3 digabung kemudian di evaporasi dengan Rotary Evaporator Vakum pada suhu 50 0 C Ekstrak Pekat - Ekstrak siap diujikan

4 2.3. Identifikasi Senyawa Kimia Uji Alkaloid 0,5 gram ekstrak sampel Hasil - ditambahkan 0,5 ml HCL 2% - ditambahkan 2-3 tetes reagen dragendrof dan 2-3 tetes mayer Uji Flavanoid 5 ml filtrate Hasil -ditambah serbuk Mg. 1 ml HCL pekat dan 2 ml amil alkohol - di kocok kuat-kuat - terjadi perubahan warna, ditunjukkan dengan imbulnya warna merah, kuning atau jingga pada lapisan amilalkohol Uji Polifenol 0,2 Mg Ekstrak Pekat Hasil -dilarukan dalam 10 ml air -dipanaskan selama 10 menit - laruan didinginkan dan disaring - filtrate di tetesi dengan FeCl3 sebanyak 3 tetes. - lalu diamati perubahan warnanya. - hasil positif polifenol terbentuk warna hijau kehitaman Uji Fitokimia secara kualitatatif dan kuantitatif Dilakukan di Lab Kimia UIN MALIKI Malang dan Lab Kimia Universitas Muhammadiyah Malang.

5 2.4 Pengenceran Larutan Ekstrak Daun Binahong 1. Uji Konsentrasi Hambat Minimum (Pendahuluan) - 1 gram ekstrak pekat daun binahong - diencerkan dengan menggunakan pelarut aquades 10 ml, - kemudian ditambahkan larutan tween 80 sebanyak 100 µl - kemudian divortek sampai homogeny - Kemudian di ujikan dengan pengenceran berseri dari konsentrasi 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25% dan 3,125% pada masing-masing bakteri. 2. Uji Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) Dan Konsentrasi Bunuh Minimum (KBM) Untuk Uji Pada Bakteri Staphylococcus aureus - 50% : 0,5 gram ektrak pekat + 9,5 ml aquades - 45% : 0,45 gram ekstrak pekat + 9,55 ml aquades - 40% : 0,4 gram ekstrak pekat + 9,6 ml aquades - 35% : 0,35 gram ektrak pekat + 9,65 ml aquades - 30% : 0,3 gram ektrak pekat + 9,7 ml aquades - 25% : 0,25 gram ektrak pekat + 9,75 ml aquades Untuk Uji Pada Bakteri Pseudomonas aeruginosa - 100% : 1 Gram ekstrak pekat + 9 ml aquades - 90% : 0,9 gram ekstrak pekat+ 9,1 ml aquades - 80% : 0,8 gram ekstrak pekat + 9,2 ml aquades - 70% : 0,7 gram ekstrak pekat + 9,3 ml aquades - 60% : 0,6 gram ekstrak pekat + 9,4 ml aquades - 50% : 0,5 gram ekstrak pekat + 9,5 ml aquades. Untuk Seluruh Pengenceran ditambahkan 1 ml larutan dari (campuran aquades 10 ml dan larutan tween 80 sebanyak 100 µl.)

6 Lampiran 3. Uji Aktivitas Antibakteri 3.1 Pembuatan Media 1. Media Nutrient Agar 6 gram nutrient agar Media agar miring - dilarutkan dengan aquades 500 ml dalam Erlenmeyer - dipanaskan sampai mendidih - dimasukkan dalam beberapa tabung reaksi dan ditutup dg kapas - disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit. - Diletakkan dalam posisi miring selama 24 jam pada suhu - 37 C 2. Media Nutrient Broth 14,5 gram nutrient broth Media agar miring - dilarutkan dengan aquades 500 ml dalam Erlenmeyer - dipanaskan sampai mendidih - dimasukkan dalam beberapa tabung reaksi dan ditutup dg kapas - disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit. - Diletakkan dalam posisi miring selama 24 jam pada suhu - 37 C

7 3.2 Peremajaan Biakan Bakteri Murni Biakan Murni Bakteri - di goreskan pada media agar padat pada cawan secara aseptis - Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C dalam incubator. - diambil satu koloni, ditumbuhkan dimedia NB dinkubasi selama 24 Pada suhu 37 C kemudian, -kekeruhan bakteri pada media dibandingka dengan NB tanpa bakteri Peremajaan Bakteri 3.3 Pembuatan Suspensi Bakteri Hasil peremajaan bakteri - diambil 1 ose, kemudian dilarutkan pada media NaCL fisiologis 0,9% sebanyak 5 ml. - di vortek biar homogen - dibandingkan dengan standar Mc Farland 10 8 sel/ml. - diencerkan 100x pada media NaCl fisiologis 0,9% dan media NB - didapatkan suspensi bakteri sebanyak 10 6 bakteri sel/ml, Bakteri siap di ujikan

8 3.4 Uji Aktivistas Bakteri Dengan Metode Dilusi Tabung HASIL Uji (KHM) - Menyiapkan tabung sebanyak 8, 2 kontrol 6 perlakuan - ditambahkan 4 ml media Nutrient Broth - ditambahkan larutan ekstrak dg konsenrasi 100% sebanyak 1 ml - kemudian di encerkan dengam mengambil 1 ml ke setiap tabung - ditambahkan suspensi bakteri sebanya 1 ml pada tiap tabung - diinkubasi selama jam pada suhu 37 0 C - diamati kejernihan pada media tabung - di streaking/ di gores pada media NA pada cawan petri - di inkubasikan pada suhu 37 C selama jam - diamati pertumhan bakteri untuk hasil KHM Hasil dari KHM - Menyiapkan tabung sebanyak 8, 2 kontrol 6 perlakuan - ditambahkan 1 ml suspensi biakan bakteri aktif dan dihomogenkan - ditambahkan larutan ekstrak sesuai konsenrasi sebanyak 1 ml - diinkubasi selama jam pada suhu 37 0 C - diamati kejernihan pada media tabung - diambil suspensi bakteri sebanyak 1 ml (10 6 ) - diencerkan pada media FeCL 0,9% sebanyak 9 ml - di streaking/ di gores pada media NAP pada cawan petri - di inkubasikan pada suhu 37 C selama jam - dihitung jumlah koloni menggunakan colony counter HASIL

9 Lampiran : 4 Tabel 1. Data pengaruh pemberian konsentrasi ekstrak daun binahong (Anredera cordifoilia (Ten) Steenis) Terhadap Penurunan Jumlah Koloni bakteri Staphylococcus aureus Per ml (10 6 sel/ml) Konsentrasi Ulangan I II III Total Rerata Kontrol Positif mg mg mg mg mg Total Tabel 2. Data pengaruh pemberian konsentrasi ekstrak daun binahong (Anredera cordifoilia (Ten) Steenis) Terhadap Penurunan Jumlah Koloni bakteri Pseudomonas aeruginosa Per ml (10 6 sel/ml) Konsentrasi Ulangan I II III Total Rerata Kontrol Positif mg mg mg mg mg Total

10 Lampiran 5. Data Penghitungan Analisis Variansi dalam RAL a. Bakteri Staphylococcus aureus 1. Faktor Koreksi (FK) = = = = 4,091 x Menghitung JK a. JK Total = = ( ) FK = 2,804 x ,091 x = 2,395 x b. JK Perlakuan = = = 2,803 x ,091 x = 2,394 x c. JK Galat = JK Total JK Perlakuan = 2,395 x ,394 x = 5,067 x Menghitung db a. db Total = N -1 = 21-1= 20 b. db Perlakuan = n 1= 7 1 = 6 c. db Galat = db Total db Perlakuan = 20 6 = 14

11 4. Menghitung KT a. KT Perlakuan = = = 3,999 x b. KT Galat = = = 3,619 x Mencari F hitung = = = 11024, Mencari BNT BNT 5% = t (α)(db galat) x = t (0,05)(14) x = 2,145 x (155335,19) = ,847 BNT 1% = t (α)(db galat) x = t (0,01)(14) x = 2,977 x (155335,19) = ,432

12 b. Bakteri Pseudomonas aeruginosa 1. Faktor Koreksi (FK) = = = = 4,308 x Menghitung JK a. JK Total = = ( ) FK = 2,964 x ,308 x = 2,533 x b. JK Perlakuan = = = 2,958 x ,308 x = 2,527 x c. JK Galat = JK Total JK Perlakuan = 2,533 x ,527 x = 5,661 x Menghitung db a. db Total = N -1 = 21-1= 20 b. db Perlakuan = n 1= 7 1 = 6 c. db Galat = db Total db Perlakuan = 20 6 = 14

13 4. Menghitung KT a. KT Perlakuan = = = b. KT Galat = = = 5. Mencari F hitung = = = 1041, Mencari BNT BNT 5% = t (α)(db galat) x = t (0,05)(16) x = 2,145 x (519190,46) = ,776 BNT 1% = t (α)(db galat) x = t (0,01)(16) x = 2,977 x (519190,46) = ,338

14 Lampiran 6. Analisisa Data Dengan One Wey ANOVA Ringkasan ANOVA Pengaruh Ekstrak Daun Binahong terhadap Bakteri Staphylococcus aureus SK db JK KT F hit F 5% F 1% Sig Perlakuan 5 2,394 x ,9902 x ,958 4,694 0,000 Galat 12 5,067 x ,6194 x Total 17 2,395 x Ringkasan ANOVA Pengaruh Ekstrak Daun Binahong Terhadap Bakteri Pseudomonas aeruginosa SK db JK KT F hit F 5% F 1% Sig Perlakuan 5 2,52732 x ,2122 x ,7525 2,958 4,694 0,000 Galat 12 5, x ,0434 x Total 17 2,53298 x 10 15

15 Lampiran 7: Perhitungan Analisa Varian dengan menggunakan SPSS versi 15 A. Bakteri Staphylococcus aureus One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test N Normal Parameters Most Extreme Differences Kolmogorov-Smirnov Z Asymp. Sig. (2-tailed) a. b. a,b Test distribution is Normal. Calculated from data. Mean Std. Deviation Absolute Positive Negative Standardized Residual Test of Homogeneity of Variances Aktivitas_penghambatan Levene Statistic df1 df2 Sig Oneway Aktivitas_penghambatan 250 mg 300 mg 350 mg 400 mg 450 mg Total Descriptives 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std. Deviation Std. Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum 3 3E Aktivitas_penghambatan Between Groups Within Groups Total ANOVA Sum of Squares df Mean Square F Sig. 2.4E E E E E

16 Post Hoc Tests Dependent Variable: Aktivitas_penghambatan LSD Multiple Comparisons (I) Konsentrasi 250 mg 300 mg 350 mg 400 mg 450 mg (J) Konsentrasi 250 mg 300 mg 350 mg 400 mg 450 mg 300 mg 350 mg 400 mg 450 mg 250 mg 350 mg 400 mg 450 mg 250 mg 300 mg 400 mg 450 mg 250 mg 300 mg 350 mg 450 mg 250 mg 300 mg 350 mg 400 mg 250 mg 300 mg 350 mg 400 mg 450 mg *. The mean difference is significant at the.05 level. Mean Difference 95% Confidence Interval (I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound * * * * * * * * * * * *

17 Tukey HSD a Konsentrasi 450 mg 400 mg 350 mg 300 mg 250 mg Sig. Aktivitas_penghambatan Subset for alpha =.05 N E Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = Notasi LSD/BNT Pengaruh Ekstrak Daun Binahong Terhadap Bakteri Staphylococcus aureus Konsentrasi ekstrak daun Binahong (Anredera cordifolia (Ten) Steenis) 50 %(/ml) 45% (450 mg/ml) 40%(400 mg/ml) 35% (350 mg/ml) 30% (300 mg/ml) 25%(250 mg/ml) Kontrol positif Rerata Rerata jumlah koloni bakteri Staphylococcus aureus per ml (10 6 ) 0,000 a 43,667 a 137,000 a 1733,333 a 29066,670 a ,000 b b Keterangan: Angka yang diikuti notasi huruf yang sama tidak berbeda nyata pada uji LSD/BNT

18 B. Bakteri Pseudomonas aeruginosa One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test N Normal Parameters Most Extreme Differences Kolmogorov-Smirnov Z Asymp. Sig. (2-tailed) a. b. a,b Test distribution is Normal. Calculated from data. Mean Std. Deviation Absolute Positive Negative Standardized Residual Test of Homogeneity of Variances Aktivitas_penghambatan Levene Statistic df1 df2 Sig Oneway Aktivitas_penghambatan 600 mg 700 mg 800 mg 900 mg 1000 mg Total Descriptives 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std. Deviation Std. Error Lower Bound Upper Bound Minimum Maximum 3 3E Aktivitas_penghambatan Between Groups Within Groups Total ANOVA Sum of Squares df Mean Square F Sig. 2.5E E E E E

19 Post Hoc Tests Dependent Variable: Aktivitas_penghambatan LSD Multiple Comparisons (I) Konsentrasi 600 mg 700 mg 800 mg 900 mg 1000 mg (J) Konsentrasi 600 mg 700 mg 800 mg 900 mg 1000 mg 600 mg 700 mg 800 mg 900 mg 1000 mg 700 mg 800 mg 900 mg 1000 mg 600 mg 800 mg 900 mg 1000 mg 600 mg 700 mg 900 mg 1000 mg 600 mg 700 mg 800 mg 1000 mg 600 mg 700 mg 800 mg 900 mg *. The mean difference is significant at the.05 level. Mean Difference 95% Confidence Interval (I-J) Std. Error Sig. Lower Bound Upper Bound * * * * * * * * * * * *

20 Tukey HSD Konsentrasi 1000 mg 900 mg 800 mg 700 mg 600 mg Sig. a Aktivitas_penghambatan N Subset for alpha = E+007 Means for groups in homogeneous subsets are displayed. a. Uses Harmonic Mean Sample Size = Notasi LSD/BNT Pengaruh Ekstrak Daun Binahong Terhadap Bakteri Pseudomonas aeruginosa Konsentrasi ekstrak daun Binahong (Anredera cordifolia (Ten) Steenis) 100% (1000 mg/ml) 90% (900 mg/ml) 80% (800 mg/ml) 70% (700 mg/ml) 60% (600 mg/ml) 50% (/ml) Kontrol positif (0%) Rerata jumlah koloni bakteri Pseudomonas aeruginosa per ml (10 6 ) 0,000 a 64,667 a 1246,667 a 1690,000 a 26433,333 a ,000 b b Keterangan: Angka yang diikuti notasi huruf yang sama tidak berbeda nyata pada uji LSD/BNT

21 Lampiran 8: Uji Korelasi dan Regresi Linear Jumlah Koloni Bakteri Staphylococcus aureus per ml (10 6 sel/ml) Regression Descriptive Statistics jumlah koloni per ml konsentrasi ekstrak Mean Std. Deviation N Correlations Pearson Correlation Sig. (1-tailed) N jumlah koloni konsentrasi per ml ekstrak Jumlah koloni per ml Konsentrasi ekstrak Jumlah koloni per ml..007 Konsentrasi ekstrak.007. Jumlah koloni per ml 7 7 Konsentrasi ekstrak 7 7 Variables Entered/Removed(b) Model 1 Variables Entered konsentrasi ekstrak(a) Variables Removed Method. Enter a All requested variables entered. b Dependent Variable: jumlah koloni per ml

22 Model Summary(b) Adjusted R Std. Error of the Model R R Square Square Estimate 1.860(a) a Predictors: (Constant), konsentrasi ekstrak b Dependent Variable: jumlah koloni per ml ANOVA(b) Mode l Sum of Squares df Mean Square F Sig. 1 Regression (a) Residual Total a Predictors: (Constant), konsentrasi ekstrak b Dependent Variable: jumlah koloni per ml Coefficients(a) Model Unstandardized Coefficients Standardized Coefficients t Sig. B Std. Error Beta 1 (Constant) konsentra si ekstrak a Dependent Variable: jumlah koloni per ml

23 Jumlah Koloni Bakteri Pseudomonas aeruginosa per ml (10 6 sel/ml) Regression Descriptive Statistics Mean Std. Deviation N jumlah koloni bakteri Pseudomonas per ml konsentrasi ekstrak daun binahong Correlations Pearson Correlation jumlah koloni bakteri Pseudomonas per ml Sig. (1-tailed) N konsentrasi ekstrak daun binahong jumlah koloni bakteri Pseudomonas per ml konsentrasi ekstrak daun binahong jumlah koloni bakteri Pseudomonas per ml konsentrasi ekstrak daun binahong jumlah koloni bakteri Pseudomonas per ml konsentrasi ekstrak daun binahong Variables Entered/Removed(b) Model 1 Variables Entered konsentrasi ekstrak daun binahong(a) Variables Removed Method. Enter a All requested variables entered. b Dependent Variable: jumlah koloni bakteri Pseudomonas per ml

24 Model Summary(b) Adjusted R Std. Error of the Model R R Square Square Estimate 1.860(a) a Predictors: (Constant), konsentrasi ekstrak daun binahong b Dependent Variable: jumlah koloni bakteri Pseudomonas per ml ANOVA(b) Sum of Model Squares 1 Regression Residual Total df Mean Square F Sig (a) a Predictors: (Constant), konsentrasi ekstrak daun binahong b Dependent Variable: jumlah koloni bakteri Pseudomonas per ml Model Coefficients(a) Unstandardized Coefficients Standardized Coefficients t Sig. B Std. Error Beta 1 (Constant) konsentrasi ekstrak daun binahong a Dependent Variable: jumlah koloni bakteri Pseudomonas per ml

25 Lampiran 9 Pengaruh Konsentrasi Ekstrak daun Binahong dengan Penurunan 99,9% Asal Sub Biakan (0%) Pada Kedua Bakteri Uji 1. Kadar Bunuh Minimum Ekstrak Daun Binahong Anredera cordifolia (Ten) Steenis pada bakteri Staphylococcus aureus per ml (10 6 sel/ml) dengan penurunan 99,9% asal sub biakan 0% (kontrol) Konsentrasi Ulangan I II III Total Rerata % KBM Kontrol Positif mg mg mg mg mg Total Kadar Bunuh Minimum Ekstrak Daun Binahong Anredera cordifolia (Ten) Steenis pada bakteri Pseudomonas aureginosa per ml (10 6 sel/ml) dengan penurunan 99,9% asal sub biakan 0% (kontrol) Konsentrasi Ulangan I II III Total Rerata % KBM Kontrol Positif mg mg mg mg mg Total

26 Lampiran 10: Alat Dan Bahan Penelitian Timbangan Analitik Blender Penyaring Buchner Rotary Evaporator Vakum Sheker oven Bahan-Bahan Penelitian Alat-Alat Gelas Penelitian

27 Inkubator Autoklaf Colony Counter Vortek Hotplate/Stirrer Alat Uji Antibakteri

28 Lampiran 11. Ekstraksi Secara Maserasi Daun Binahong Anredera cordifolia (Ten) Steenis. Serbuk Daun Binahong Maserasi Ekstrak etil Asetat Ekstrak Daun Binahong di Shaker Penyaringan Ekstrak Daun Binahong Ekstrak di Rotary Evaporator vakum Ekstrak Pekat Etil Asetat Daun Binahong

29 Lampiran 12 : A. Hasil Uji KHM (Konsentrasi hambat minimum) Uji dilusi bakteri S.aureus Uji dilusi bakteri P.aureginosa Penanaman bakteri pada media NA Penanaman bakteri pada media NA Uji tween pada bakteri S.aureus Uji tween pada bakteri P.aureginosa

30 B. Hasil Uji kadar bunuh minimum (KBM) Bakteri Staphylococcus aureus Uji Dilusi Tabung Kontrol positif

31 C.Hasil Uji kadar bunuh minimum (KBM) Bakteri Pseudomonas aureginosa

32