Mihara, H., Sumi, H., Yoneta, T., Mizumoto, H., Ikeda, R., Seiki, M., Maruyama, M., (1991), A Novel fibrinolytic enzyme extracted from the earthworm,

Transkripsi

1 DAFTAR PUSTAKA Ahn, M.Y., Hahn, B.S., Ryu, S.K., Hwang, S.J., Kim, Y.S., (2005), Purification and characterization of a serine protease (CPM-2) with fibrinolytic activity from the dung beetles, Arch. Pharm. Res, 28, Berg, J.M., Tymoczko, J.L., Strayer, L., (2002), Biochemistry, 5 th Ed., W.H. Freeman and Florida, Bhagavan, N.V., (2002), Medical Biochemistry, Harcourt Academic Press, California, Bhattacharjee, G., Chaudhuri, PS., (2002), Cocoon production, morphology, hatching pattern and fecundity in seven tropical earthworm species a laboratory-based investigation, J. Biosci., 27, Bolger, M.B., (2001), Three-dimensional structure of fibrolase, the fibrinolytic enzyme from southern copperhead venom, modeled from the X-ray structure of adamalysin II and atrolysin C, AAPS Pharmsci, 3, Deutscher, M.P., (1990), Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc., California, Dong, G.Q., Yuan, X.L., Shan, Y.J., Zhao, Z.H., Chen, J.P dan Cong, Y.W., (2004), Molecular cloning and characterization cloning and characterization of cdna encoding fibrinolytic enzyme-3 from eartworm Eisenia foetida, Acta Biochim. Biophys. Sin., 36 (4), Edwards, C.A., Dominguez, J,. Nenhanser,. E.F, (1998), Growth and reproduction of P. excavatus (Megascolecidae) as factors organic waste management, Biol. Fertil. Soils, 27, Edward., C.A., dan Lofty, J.R., (1972) Biology of earthworm. Chapman nad Hal Ltd:London, 1 36 Elyani, N., (2005), Deteksi enzim fibrinolitik dari cacing tanah P. excavatus, Tesis, Program Studi Kimia, Institut Teknologi Bandung. Fan, Q. Wu, C,. Li., Fan, R., WU, C., Hou, Q., He, R., (2001), Some feature of instestinal absorbtion of intact fibrinolytic enzyme III-1 from L. rubellus, Biochem. Biophys. Acta, 1526, Fersht, A., (2000), Structure and mechanism in protein science, 3 rd Edition, W.H Freeman and Company, New York, Fulyani, F., (2006), Identifikasi enzim fibrinolitik dari cacing tanah P. excavatus, Skripsi, Program Studi Kimia, Institut Teknologi Bandung. Hardiany, A., (2002), Identifikasi enzim fibrinolitik cacing tanah Pheretima sp dengan zimografi, Tesis, Program Studi Kimia, Institut Teknologi Bandung. 37

2 Mihara, H., Sumi, H., Yoneta, T., Mizumoto, H., Ikeda, R., Seiki, M., Maruyama, M., (1991), A Novel fibrinolytic enzyme extracted from the earthworm, Lumbricus rubellus, Jpn. J. Physiol, 41, Nakajima,N., Mihara, N., Sumi, H., (1993), Characterization of potent fibrinolytic enzymes in earthworm, Lumbricus rubellus, Biosci. Biotech. Biochem., 57, Nakajima, N., Sugimoto, M., Ishihara, K., (2003), Earthworm-serine protease: characterization, molecular cloning, and application of the catalytic function, J. Molec. Catal., 23, Nurachman, Z., Hermawan, J., Racmayanti, Y., Bardja, L., (2003), A simple way to visualize fibrinolysis in the classroom, Biochem. Mol. Bio. Edu., 31, Murray, R.K.,Garner, D.K., Mayes, P.A., Rodwel, V.W., (1992), Biokimia Harper. Edisi 24. CV. EGC, Jakarta. Mathews, C.K., van Holde, K.E., Ahrn, K.G., (2000), Biochemistry, 3 rd Ed., Addison- Wesley, Pub. Comp., San Fransisco, Pechenick, (2005), Biology of the Invertebrates, 5 th Ed., McGraw Hill International, New York, Sahlan, M., (2002), Eksplorasi enzim fibrinolitik dari cacing tanah Pheretima sp galur local, Skripsi, Departemen Kimia, Institut Teknologi Bandung. Smith, E.T., (1991), Exploring Biology, 5 th Ed., Harcourt Brace & Word Inc., London Stephenson, J., (1930), The Oligochaeta, Oxford University Press, Oxford. Scopes, K., (1994), Protein purification : Principle and Practice,3 rd Ed., Springer, New York. Tao, G., Sun., Z.J., Fu, S. H., Liang, G. D., (2005), Cloning of thrombolytic enzyme (lumbrokinase) from earthworm and its expression in the yeast Pichia pastoris, Prot. Expr. Purif., 42, Wallwork, J.A., (1920), Ecology of soil animals, Mc Graw-Hill, London. Webb, J., Thompson, C., (1992), Trombolysis for acute myocardial infraction, Can. Fam. Physician, 38, Wiseman, A., (1986), Handbook of enzyme biotechnology, 2 nd Ed., John Willey & Sons, New York, Yang, J.S., Ru, B.G., (1997), Purification and characterization of an SDS-actived fibrinolytic enzyme from Esenia fetida, J. Comp.Biochem. Physiol, 118B,

3 LAMPIRAN A Penentuan Kadar Protein Enzim A.1 Kurva Standar BSA (dibaca pada A 595 ) No BSA standar (mg/ml) A 1 A 2 A 3 A rata-rata 1 2 0,096 0,152 0,130 0, ,280 0,267 0,280 0, ,373 0,386 0,367 0, ,471 0,444 0,532 0, ,665 0,585 0,610 0,620 Kurva Standar BSA A y = x R 2 = Konsentrasi BSA Dari kurva tersebut dihasilkan persamaan garis y = 0,0604x + 0,0106 yang dipakai untuk perhitungan kadar enzim, 39

4 A. 2 Perhitungan Kadar Protein Sampel Perhitungan kadar protein pada sample dilakukan menggunakan persamaan yang didapatkan dari aluran kurva standar, Dengan memperhitungkan faktor pengenceran, diperoleh hasil sebagai berikut: Sampel Ekstrak kasar Filtrasi gel A 595 nm Konsentrasi pengujian A 1 A 2 A 3 A rata-rata (μg/ml) Faktor Konsentrasi pengenceran awal (mg/ml) 0,345 0,364 0,371 0,360 5, ,6 0,673 0,631 0,643 0,649 10,6 20 0,21 Sampel Konsentrasi Awal Volume Total Protein Total (mg/ml) (ml) (mg) Ekstrak Kasar 11, Hasil Filtrasi 0, ,4 40

5 LAMPIRAN B Penentuan Aktivitas Enzim B. 1 Kurva Uji Azokaseinolitik Ekstrak Kasar Enzim Waktu (menit) A 1 A 2 A 3 A rata-rata ,187 0,189 0,190 0,184 0,185 0,189 0,423 0,423 0,420 0,404 0,403 0,403 0,592 0,591 0,597 0,595 0,600 0,599 0,773 0,768 0,776 0,774 0,773 0,781 0,187 0,412 0,596 0,774 Uji Aktivitas Azokaseinolitik Ekstrak Kasar Enzim Absorbansi 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 y = 0,0194x + 0,0066 R 2 = 0, Waktu (Menit) 41

6 B. 2 Kurva Uji Azokaseinolitik Hasil Filtrasi Gel Waktu (menit) A 1 A 2 A 3 A rata-rata 0,312 0,320 0,314 0,283 0,288 0,287 0,300 0,577 0,565 0,570 0,517 0,517 0,522 0,544 0,804 0,809 0,809 0,775 0,786 0,781 0,794 0,925 0,936 0,939 0,944 0,953 0,961 0,943 Uji Aktivitas Azokaseinolitik Enzim Hasil Filtrasi Gel Absorbansi 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 y = 0,0218x + 0,1015 R 2 = 0, Waktu (menit) 42

7 B. 3 Perhitungan Analisis Pemurnian Enzim Unit aktivitas (U) didefinisikan sebagai perubahan absorban sebesar satu satuan yang terjadi per jam per ml sample. Dari kurva dihasilkan persamaan garis y = ax + b, dimana gradien garis merupakan fungsi perubahan absorbansi terhadap waktu (menit) m = da/dt, sehingga U = (da/dt) 60 fp 1/mL, fp = faktor pengenceran Maka didapatkan hasil sebagai berikut : Sampel da/dt Faktor pengenceran Unit aktivitas (U) Ekstrak kasar 0, Filtrasi gel 0, ,3 Aktivitas total enzim didapatkan dari hasil kali unit aktivitas dengan volume total enzim. Sedangkan yield dihitung dari perbandingan aktivitas total ekstrak kasar enzim dengan enzim hasil filtrasi gel. Sampel Unit Aktivitas (U) Volume total (ml) Aktivitas total (U ml) Yield (%) Ekstrak kasar Filtrasi gel 52, Aktivitas spesifik enzim adalah hasil bagi dari aktivitas total enzim dengan proteim total. Kelipatan pemurnian didapatkan dari hasil perbandingan aktivitas spesifik antara enzim hasil filtrasi gel dengan ekstrak kasarnya. Sampel Protein total (mg) Aktivitas total Aktivitas spesifik (U ml) (U ml/ mg) Kelipatan pemurnian Ekstrak kasar Filtrasi gel 28, ,5 43

8 LAMPIRAN C Optimasi Suhu dan ph Unit aktivitas (U) pada pengujian optimasi ph dan suhu ini didefinisikan sebagai besarnya perubahan absorbansi sebesar satu satuan. Aktivitas enzim pada pengujian optimasi ph dan suhu ini didefinisikan sebagai besarnya perubahan absorbansi sebesar satu satuan per menit per ml enzim. Unit aktivitas (U) = (A rata-rata A blanko ) (t reaksi t 0 ) Aktvitas enzim = U fp 1/mL C. 1 Optimasi Suhu Aktivitas relatif merupakan perbandingan dari unit aktivitas berbagai suhu dengan unit aktivitas pada suhu 55 o C. Aktivitas Suhu ( o C) A 1 A 2 A 3 A rata-rata (U/menit/mL) Aktivitas relatif (%) 34 0,414 0,415 0,434 0,421 0, ,620 0,636 0,736 0,664 1, ,949 0,959 0,917 0,940 1, ,069 1,073 0,990 1,044 2, ,148 1,159 1,132 1,146 2, ,367 1,378 1,390 1,378 2, ,331 1,350 1,312 1,331 2, ,214 1,187 1,127 1,176 2, ,979 1,128 1,100 1,069 2,

9 Kurva Optimasi Suhu Aktivitas relatif (%) suhu C. 2 Optimasi ph Aktivitas relatif pada ph merupakan perbandingan dari nilai unit aktivitas enzim pada berbagai ph dengan unit aktivitas enzim ph 8. Aktivitas Aktivitas ph A 1 A 2 A 3 A rata-rata (U/menit/mL) relatif (%) 4 0,164 0,137 0,152 0,151 0, ,383 0,397 0,351 0,377 0, ,961 0,950 0,992 0,967 0, ,043 1,006 1,043 1,031 0, ,063 1,063 1,070 1,065 0, ,263 1,315 1,210 1,262 0, ,264 1,130 1,009 1,134 0, ,130 1,124 1,136 1,130 0, ,09 1,084 1,123 1,099 0,

10 Kurva Optimasi ph Aktivitas relatif (%) ph 46