METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Alat dan Bahan

Transkripsi

1 METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan selama 14 bulan, dimulai dari bulan Juni 2009 sampai Agustus 2010 bertempat di Laboratorium Riset Anatomi dan Laboratorium Embriologi, Depertemen Anatomi Fisiologi dan Farmakologi serta Laboratorium Pendidikan dan Layanan Terpadu, Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor. Adapun pengambilan sampel dilakukan di Tempat Pemotongan Hewan (TPH) Perumahan Sindang Sari RT 04/RW 07 Ciampea, Bogor. Alat dan Bahan Alat yang digunakan pada penelitian ini meliputi termos es, gunting, pinset, gelas ukur, gelas piala, gelas Erlenmayer, tabung reaksi, pipet Pasteur, pipet mikro, spatula, gelas pengaduk, magnetic stirrer, timbangan digital, blender, ph meter, cawan petri, termometer, water heater, pengocok mekanis (shaker), vortex mixer, alat sentrifus, tabung sentrifus, microtube, refrigerator (4 o C), freezer (-30 o C), set liquid IEF BioRad Rotofor, alat vakum, cooler machine dan seperangkat alat elektroforesis. Penelitian ini menggunakan empat sampel abomasum domba lokal. Semua sampel abomasum ini diperoleh dari hewan yang disembelih untuk kepentingan konsumsi langsung dari TPH. Sebelum disembelih hewan diperiksa status kesehatan dan ditentukan umurnya berdasarkan perubahan morfologi gigigiginya. Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini adalah: asam asetat 10% untuk ekstraksi mukosa abomasum dan NaOH 1N untuk proses netralisasi. Bio-Lyte Ampholyte ph 3-10, NaOH 0.1 N, H 3 PO 4 untuk proses pemusatan liquid IEF. Gel elektroforesis dibuat dengan bahan-bahan yaitu BIS acrylamide, aquades, tris HCl (ph 8.8 dan 6.8), SDS 10%, N,N,N,N -tetramethylenediamine (TEMED), ammonium persulfat 10%. Bahan yang digunakan untuk pewarnaan silver adalah perak nitrat, etanol absolut, aquades, dan asam asetat glasial. Sensitizer menggunakan campuran etanol absolut, glutaraldehid, sodium tiosulfat, dan sodium asetat. Developer menggunakan sodium karbonat dan formaldehid, serta stopper. Persiapan sampel yang akan dirunning terdiri dari

2 ekstrak sampel, Laemmli sample buffer, dan loading dye buffer protein. Terakhir persiapan running buffer yang terdiri dari tris HCl, glycine, dan SDS 0.1%. Pengambilan Sampel Sampel abomasum diambil langsung dari TPH. Sebelum disembelih domba diperiksa status kesehatannya dan ditentukan umurnya berdasarkan susunan gigi-giginya. Segera setelah disembelih lambung bagian abomasum dikeluarkan dari tubuh, dan dimasukkan ke dalam plastik yang berisi NaCl fisiologis. Setelah itu, dimasukkan ke dalam termos dingin dan segera dibawa ke laboratorium untuk proses selanjutnya. Isolasi Rennet Abomasum disayat pada daerah kurvatura mayor untuk mengeluarkan kotoran yang ada di dalamnya dan dicuci dengan NaCl fisiologis. Meja yang akan digunakan diusahakan steril dengan cara didesinfeksi dan bunsen dinyalakan untuk menjamin proses aseptis. Abomasum yang telah bersih kemudian ditimbang, selanjutnya bagian fundus dan pilorus dipisahkan dan masing-masing ditimbang kembali. Bagian mukosa fundus dikelupas dan ditimbang kembali untuk selanjutnya dilakukan proses ekstraksi. Proses ekstraksi yang digunakan adalah modifikasi metode Qadri et al. (1962) oleh Nisa et al. (2009). Mukosa fundus yang diperoleh dicincang menggunakan gunting dan ditambahkan asam asetat 10% dengan perbandingan 1 : 2 (mukosa : asam asetat). Untuk mempercepat proses ekstraksi, campuran tersebut dihomogenkan menggunakan blender sebanyak lima kali (5x), masingmasing satu menit dengan selang waktu 30 detik. Di sekitar tabung blender diberikan es batu untuk menjaga agar suhu tidak terlalu tinggi. Campuran yang telah diblender kemudian dibagi ke dalam beberapa tabung untuk disentrifugasi. Tiap tabung dilabel dan diukur ketinggian sampelnya. Sentrifugasi dilakukan dengan kecepatan rpm pada suhu 4 0 C selama 20 menit. Supernatan dipisahkan dari endapan dengan cara mengambil supernatan pada tabung sentrifus menggunakan mikro pipet. Hasil ekstraksi tersebut kemudian dinetralisasi menggunakan NaOH 1N sampai mencapai ph rennet optimum 5,4 (Putra 2009). Selanjutnya dilakukan pengujian aktivitas koagulasi susu.

3 Pengujian Aktivitas Rennet dalam Mengkoagulasikan Susu Uji aktivitas rennet terhadap koagulasi susu dilakukan dengan menggunakan metode Scott (1981). Uji ini dilakukan terhadap supernatan yang sudah dinetralisasi untuk membuktikan keberadaan enzim protease (khimosin dan pepsin). Konsentrasi supernatan yang digunakan adalah 4%. Susu terlebih dahulu dipasteurisasi dengan suhu 72 0 C selama 15 detik dan didiamkan selama beberapa menit hingga mencapai suhu C. Selanjutnya susu dimasukkan kedalam gelas piala sebanyak 9.6 ml dan ditambah dengan 0.4 ml supernatan. Campuran tersebut kemudian diaduk beberapa saat sampai homogen. Setelah itu didiamkan dan diamati sampai terjadi penggumpalan susu. Waktu dari mulai menggumpal sampai susu menggumpal sempurna dihitung dengan pengukur waktu (stopwatch). Parameter yang diamati dalam pengujian koagulasi adalah waktu koagulasi dan tekstur koagulan yang terbentuk. Fraksinasi Enzim Protease Rennet Proses fraksinasi dimulai dengan menyusun membran dan elektroda alat Rotofor. Elektroda anoda berisikan membran kation yang membawa muatan positif yang direndam semalaman dalam elektrolit anoda (H 3 PO 4 0,1 M). Elektroda katoda berisikan membran anion yang membawa muatan negatif juga direndam semalaman dalam larutan elektrolit katoda (NaOH 0.1 M). Elektroda yang sudah dirakit ke dalam cooling finger kemudian diisi dengan elektrolit yang sesuai pada chamber elektrolit. Cooling finger yang telah dirakit kemudian dipasang pada rotor machine, dan bagian posterior focusing chamber ditutup dengan selotip. Tahapan fraksinasi dengan liquid IEF meliputi proses pre-running selama lima menit, prefocusing selama 30 menit dan focusing selama tiga jam. Prerunning dilakukan dengan air destilasi sebanyak 55 ml yang kemudian dikeluarkan dari chamber dengan cara disedot dengan vaccum pump. Prefocusing dilakukan dengan menjalankan zat pelarut tambahan untuk memunculkan gradien ph. Proses focusing dilakukan dengan memasukkan sampel pada chamber pada daya konstan 15 Watt. Preparasi sampel rennet sebanyak 40 ml supernatan dengan penambahan amfolit ph 3-10 sebanyak 2% dari total volume sampel, yakni sebanyak 0.8 ml. Lubang focusing chamber bagian anterior kemudian juga ditutup dengan selotip untuk mencegah

4 kebocoran. Sebelumnya dilakukan pengaturan suhu chamber mencapai 4 C selama 30 menit. Proses pemanenan fraksi dilakukan ketika voltase stabil selama tiga jam. Ujung pipa kolektor yang runcing ditusukkan pada bagian posterior lubang chamber dan mesin vakum dinyalakan pada Gauge. Protein yang telah difraksinasi akan tertarik dan masuk ke dalam fraksi koleksi berdasarkan titik isolistriknya yang ditunjukkan dengan gradien ph. Setelah itu dilakukan pengujian ph pada masing-masing fraksi dengan menggunakan kertas indikator ph dan dilakukan uji aktivitas pada hasil fraksinasi dengan metode Scott (1981) pada susu yang telah dipasteurisasi. Analisa Protein Menggunakan Metode SDS-PAGE Pengujian protein dilakukan terhadap enzim yang terdapat pada fraksi yang telah diuji dalam rentang ph optimum dan menunjukkan hasil uji koagulasi berupa pembentukan curd yang kemudian akan dianalisis menggunakan SDS- PAGE. Intensitas warna yang tinggi (gelap) pada pita mengindikasikan kualitas dan kuantitas protein yang tinggi, sedangkan warna terang mengindikasikan kualitas dan kuantitas protein yang rendah. Pita diwarnai dengan pewarnaan silver. Analisa Data Data yang diperoleh dalam penelitian ini dianalisa secara statistika deskriptif. Statistika deskriptif adalah bidang statistika yang membicarakan cara atau metode mengumpulkan, menyederhanakan, dan menyajikan data sehingga bisa memberikan informasi.

5 Mukosa fundus Isolasi Rennet Fraksinasi dengan IEF Rotofor Uji ph Uji Koagulasi Pengujian kualitas dengan SDS-PAGE Gambar 3 Diagram alir metodologi penelitian