HAPLOGROUP mtdna MANUSIA ATAS DASAR RFLP DAN POSISI MUTASI URUTAN NUKLEOTIDA LENGKAP TESIS. Oleh Mastura NIM : Program Studi Kimia

Transkripsi

1 HAPLOGROUP mtdna MANUSIA ATAS DASAR RFLP DAN POSISI MUTASI URUTAN NUKLEOTIDA LENGKAP TESIS Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister dari Institut Teknologi Bandung Oleh Mastura NIM : Program Studi Kimia INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2007

2 ABSTRAK HAPLOGROUP mtdna MANUSIA ATAS DASAR RFLP DAN POSISI MUTASI URUTAN NUKLEOTIDA LENGKAP Oleh Mastura NIM : Mitokondria adalah organel sel eukariot yang berfungsi sebagai organ respirasi pembangkit energi dengan menghasilkan adenosine triphosphate (ATP). Urutan genom DNA mitokondria (mtdna) manusia secara lengkap telah berhasil ditentukan yang dikenal dengan urutan nukleotida Cambridge Reference Sequence (CRS), dan menjadi rujukan standar dalam berbagai studi genetika molekul terutama yang berkaitan dengan polimorfisme mtdna manusia. Peneliti-peneliti terdahulu telah menggunakan Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) sebagai salah satu metode untuk mengamati polimorfisme dalam studi antropologi molekul, dan metode tersebut sangat ampuh digunakan dalam menentukan elusidasi hubungan evolusi di antara kelompok etnis. Penelitian mengenai polimorfisme mtdna manusia berdasarkan enzim restriksi di antaranya telah berhasil mengelompokkan populasi asli Amerika menjadi haplogroup A, B, C, dan D. Pada penelitian ini akan dilakukan penentuan haplogroup berdasarkan prinsip RFLP yang dilakukan atas dasar posisi mutasi dari urutan nukleotida lengkap mtdna manusia secara in silico. Tahapan penelitian yang dilakukan meliputi penentuan jumlah, jenis dan posisi mutasi urutan nukleotida lengkap mtdna manusia menggunakan program Mito Mutation Analyzer (MMA), selanjutnya dilakukan penentuan haplogroup menggunakan empat belas enzim restriksi endonuklease. Enzim yang digunakan dalam penentuan haplogroup berdasarkan prinsip RFLP yaitu enzim HaeIII, AluI, HincII, HhaI, HaeII, HpaI, RsaI, MboI, AvaII, BamHI, NIaIII, HinfI, TaqI, dan AccI. Analisis 584 urutan nukleotida lengkap mtdna manusia dengan program Mito Mutation Analyzer (MMA) menghasilkan luaran berupa jenis, posisi dan jumlah mutasi, insersi serta delesi. Jumlah mutasi tertinggi sebanyak 129 titik, sedangkan jumlah terendah 12 titik. Penentuan haplogroup berdasarkan posisi mutasi dari urutan nukleotida lengkap menggunakan empat belas enzim restriksi memberikan hasil berupa haplogroup yang sangat bervariasi. Hasil penelitian menunjukan haplogroup terbanyak sampai yang terendah masing-masing secara berturut-turut terdapat pada individu yang memiliki satu haplogorup yaitu haplogroup H dan F, diikuti dengan individu yang memiliki dua haplogroup: EH, HL, HV, HI, HU, HX, FH, dan DE, selanjutnya individu yang termasuk ke tiga haplogroup: HJT, HIL, EHL, DEH, CEH, FHI, dan individu yang memiliki empat haplogroup: FHJT, HJLT, EHIL, EHJT, AEHL, FHIL. Terdapat sejumlah individu yang tidak termasuk ke haplogroup manapun, sedangkan sisanya individu yang belum di ketahui suku bangsanya.

3 Atas dasar enzim restriksi, setiap sampel ditentukan haplogroupnya. Haplogroup yang tingkat kesamaannya paling tinggi dengan haplogroup RFLP secara berturutturut masing-masing terdapat pada individu yang memiliki satu haplogroup, selanjutnya individu yang termasuk ke dalam dua haplogroup, tiga haplogroup dan individu yang memiliki empat haplogroup. Terdapat individu yang tidak termasuk ke haplogroup manapun. Di lihat dari segi jumlah dan tingkat kesamaannya, ternyata haplogroup RFLP hanya sesuai untuk individu yang memiliki satu haplogroup, sedangkan sisanya tidak mempunyai sesuatu yang spesifik untuk dapat digolongkan ke dalam group tertentu, karena sebagian besar individu memiliki lebih dari satu haplogroup sehingga individu tersebut dapat masuk ke haplogroup manapun. Atas dasar penelitian ini dapat ditarik kesimpulan bahwa sebagian haplogroup sesuai dengan haplagroup RFLP dan sisanya tidak sesuai dengan haplogroup RFLP. Untuk individu yang tidak termasuk ke haplogroup tertentu, kemungkinan dapat dibuat haplogroup baru berdasarkan posisi mutasi urutan nukleotida yang spesifik atau berdasarkan sisi pemotongan dari enzim restriksi yang terdapat pada urutan nukleotida mtdna tersebut. Kata kunci : metode RFLP, haplogroup, urutan nukleotida lengkap, mtdna manusia

4 ABTRACT HUMAN mtdna HAPLOGROUP BASE ON RFLP AND NUCLEOTIDE SEQUENCE MUTATION By Mastura NIM : Mitochondria is an organelle of the eukaryote cell that functions as the energy generating system which produce adenosine triphosphate (ATP). The complete sequence of genome human DNA mitochondria (mtdna) have been determined and recognized as the Cambridge Reference Sequence (CRS) nucleotide sequence, and become the standard reference in molecular genetics study especially related to human mtdna polymorphism. Preview researchers used RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) as one of the methods to determine the evolution relationship among ethnical groups. Research concerning human mtdna polymorphism base on restriction enzyme have succeededly grouped the original population of America into haplogroup A, B, C, and D. The research consist of several and takes, namely determination of amount, complete nucleotide sequence mutation position and type of human mtdna using a mito mutation analyzer (MMA) programe, and determination of the haplogroup by using 14 endonuclease restriction enzymes. The enzymes used are HaeIII, AluI, HincII, HhaI, HaeII, HpaI, RsaI, MboI, AvaII, BamHI, NIaIII, HinfI, TaqI, and AccI The analysis of 584 the nucleotide sequence of human mtdna using the above software revealed the amount and the position of mutation and also the insersion or deletion. The highest amount of the mutation is 129 position with the lower is 12 position. The determination of haplogroup base on the mutation position of the complete nucleotide sequence showed variative haplogroups. Based on this analysis almost all the samples could be associated into several haplogroups and some sample could be long to more than one haplogroups. Majority of samples belong to one haplogroups, namely H and F haplogroups, and the rest of sample belong to two, three, and four haplogroups respectively. The higst degree of similarity between haplogroup in this research and those which based on RFLP are shown in individuals owning one haplogroup. It could be concluded due to excistence of individual owning more than one haplogroup or individual withoud any haplogroup, a new haplogroup based on nucleotide mutation showed be created. Keyword : RFLP method, Haplogroups, complete sequence nucleotide, human mtdna

5 HAPLOGROUP mtdna MANUSIA ATAS DASAR RFLP DAN POSISI MUTASI URUTAN NUKLEOTIDA LENGKAP Oleh Mastura NIM : Program Studi Kimia Institut Teknologi Bandung Menyetujui Pembimbing Tanggal (Achmad Saifuddin Noer, Ph.D)

6 PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS Tesis S2 yang tidak dipublikasikan terdaftar dan tersedia di Perpustakaan Institut Tekonologi Bandung, dan terbuka untuk umum dengan ketentuan bahwa hak cipta ada pada pengarang dengan mengikuti aturan HaKI yang berlaku di Institut Teknologi Bandung. Referensi kepustakaan diperkenankan dicatat, tetapi pengutipan atau peringkasan hanya dapat dilakukan seizin pengarang dan harus disertai dengan kebiasaan ilmiah untuk menyebutkan sumbernya. Memperbanyak atau menerbitkan sebagian atau seluruh tesis haruslah seizin Direktur Program Pascasarjana, Institut Teknologi Bandung

7 LEMBARAN DEDIKASI Bukankah Kami telah melapangkan untukmu dadamu, dan Kami telah menghilangkan darimu bebanmu, yang memberatkan punggungmu, dan Kami tinggikan bagimu sebutan namamu, karena sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan, sesungguhnya sesudah kesulitan itu ada kemudahan, maka apabila kamu telah selesai (dari suatu urusan), kerjakankah dengan sungguhsungguh (urusan) yang lain, dan hanya kepada Tuhanmulah hendaknya kamu berharap.(alam Nasyrah 1-8) Kupersembahkan kepada suami tercinta, yang telah mendampingiku dengan penuh cinta dan kasih sayang,., semua itu bagaikan mutiara yang menyinari hatiku serta anak-anakku tersayang Yusuf dan Syamil, kalian adalah permata di dalam hatiku...

8 UCAPAN TERIMA KASIH Segala puji bagi Allah SWT karena telah memberikan karunia dan rahmat-nya yang tak terhingga kepada penulis. Rasa syukur yang sedalam-dalamnya, karena atas Karunia-Mu maka dapat kutuliskan kata-kata ini sampai menjelang akhir penantianku untuk menyelesaikan pendidikan S2 ini. Engkau menjadi penerang di saat hatiku mulai gelisah. Engkau menjadi kekuatannku disaat aku mulai lemah dan tidak berdaya, cahaya di dalam kegelapan, tempat bersandar di tengah kegalauan, tempat meminta disaat kesusahan, tempat mengadu dikala duka menyergap. Segala puji bagi Allah, hanya karena Rahmat-Mu aku dapat menjalani semua ini dengan hati yang penuh harapan dan impian akan masa depan yang lebih baik, untuk ku dan untuk orang-orang yang mencintai dan menyayangiku dengan sepenuh hati. Rasa terimakasih yang tak terhingga penulis haturkan kepada Bapak Dr. Achmad Saifuddin Noer, yang telah membimbing penulis dalam menyelesaikan tesis ini dengan penuh kesabaran, pengertian dan kebijaksanaan, hanya Allah yang dapat membalas atas semua ilmu yang telah Bapak berikan kepada penulis, Bapak adalah Good Father for me Pada kesempatan ini penulis juga ingin menyampaikan rasa terimakasih kepada semua pihak yang telah ikut memotivasi, membantu dan memberikan wawasan ilmu untuk penulis khususnya kepada : 1. Direktur Program Pascasarjana ITB dan seluruh staf yang telah memberikan kesempatan untuk mengikuti Program Magister Kimia dan telah membantu kelancaran proses studi dan penelitian

9 2. Dirjen DIKTI Depdiknas dan Pimpinan Proyek BPPS atas bantuan beasiswa selama proses studi berlangsung 3. Ketua Departemen Kimia, Pengelola Program Magister Kimia, Ketua Bidang Biokimia, Kepala Laboratorium dan seluruh dosen berserta karyawan di Departemen Kimia, atas segala bentuk pelayanan yang diberikan selama pendidikan. 4. Staf dosen Biokimia-ITB, Bapak Dr. Akhmaloka, Ibu Dr. Dessy Natalia, Bapak Dr.Rukman Hertadi, Ibu Dr. Fida Madayanti, Bapak Dr. Zeily Nurachman, Bapak Dr. M. Abdulkadir M dan seluruh dosen kimia atas segala wawasan akademis yang sangat bermanfaat bagi penulis. 5. Bapak Drs.H.Jalaluddin Raden,MM, Kepala SMA Negeri 3 Langsa atas izin dan pengertiannya terhadap penulis 6. Ibu Dr. Yoni F Syukriani atas sampelnya juga motivasi, saran dan bantuan yang diberikan untuk penulis 7. Mba Vera, Pak Savante, Mba Hira dan Mba Prima, Pak Tanto atas segala bantuannya 8. Adik-adikku yang sangat baik hati: Faika, yang terbaik dan tak terlupakan, Ira dan Mery yang selalu membantu, hanya Allah yang dapat membalas semua kebaikan kalian 9. Rekan-rekan S2 2004, Pak Ari, Pak Rafi, Dini, Anne, Eka dan rekan S2 2005, Indira, Dwita, Ira, Puti dan Anton atas semua saran, bantuan serta diskusinya yang menyenangkan 10. Adikku Karima Yolita atas program MMA nya yang sangat membantu

10 11. Teristimewa kepada suami tercinta atas dukungan, pengorbanan, pengertian, kesetiaan dan doanya, serta permata hatiku Yusuf dan Syamil yang selalu menemaniku dengan penuh senyum dan tawa, kalian semua adalah penyemangatku Seluruh keluargaku terutama Ibu, Ibu dan Bapak mertuaku atas doanya yang setiap saat untuk keberhasilanku. Kak ina, Bang Zakir, Bang Mahlil, atas bantuan moril, juga adikku Maskur dan Maulizar Penulis tidak mampu membalas semua kebaikan ini, hanya Allah yang dapat membalasnya. Akhirnya penulis mengharapkan semoga penelitian ini dapat memberikan konstribusi berarti dalam khasanah ilmu pengetahuan khususnya dalam bidang Biologi molekul dan bioinformatik dewasa ini dan dimasa mendatang. Bandung, September 2007 Penulis

11 DAFTAR ISI ABSTRAK... ii ABSTRACT... iv PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS... vi UCAPAN TERIMAKASIH... viii DAFTAR ISI... x DAFTAR LAMPIRAN... xii DAFTAR GAMBAR DAN ILUSTRASI... xiii DAFTAR TABEL... xiv DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG... xv BAB I Pendahuluan... 1 I. I Latar Belakang... 1 I.2 Rumusan Masalah... 2 I.3 Tujuan Penelitian... 2 I.4 Ruang Lingkup Penelitian... 3 I.5 Strategi Penelitian... 3 I.6 Sistematika Tesis... 3 BAB II Tinjauan Pustaka... 4 II.1 Mitokondria... 4 II.2 Fungsi Mitokondria... 5 II.3 Genom Mitokondria... 6 II.4 Sifat Genetik Mitokondria... 8 II.5 Laju Mutasi mtdna... 9 II.6 Haplogroup mtdna II.7 Analisis Variasi mtdna dengan Metode RFLP II.8 Program Mito Mutation Analyzer (MMA) II.9 Basis Data BAB III Metodologi Penelitian III.1 Analisis Urutan Keseluruhan mtdna manusia Menggunakan Program MMA III.2 Penentuan Haplogroup mtdna Manusia dengan Enzim Restriksi BAB IV Hasil dan Pembahasan... 16

12 IV.1 Analisis Urutan Nukleotida Lengkap dengan Metode MMA IV.2 Penentuan Haplogroup dengan Enzim Restriksi Endonuklease BAB V Kesimpulan DAFTAR PUSTAKA DAFTAR LAMPIRAN... 35

13 DAFTAR LAMPIRAN LAMPIRAN A Haplogroup mtdna Manusia yang Di analisis dengan Enzim Restriksi LAMPIRAN B Individu yang Memiliki Satu Haplogroup LAMPIRAN C Individu yang Memiliki Dua Haplogroup LAMPIRAN D Individu yang Memiliki Tiga Haplogroup LAMPIRAN E Individu yang Memiliki Empat Haplogroup LAMPIRAN F Urutan Nukleotida Lengkap mtdna Manusia LAMPIRAN G Suku Bangsa LAMPIRAN H File Sampel Urutan Nukleotida yang telah Selesai Diedit LAMPIRAN I File Sampel Urutan Nukleotida yang telah Dianalisis dengan Program MMA LAMPIRAN J Hasil Analisis Urutan Nukleotida Lengkap dengan Empat Belas Enzim Restriksi LAMPIRAN K Hasil Analisis dengan Enzim Restriksi untuk Individu yang Memiliki Satu Haplogroup LAMPIRAN L Hasil Analisis dengan Enzim Restriksi untuk Individu yang Memiliki Dua Haplogroup LAMPIRAN M Hasil Analisis dengan Enzim Restriksi untuk Individu yang Memiliki Tiga Haplogroup LAMPIRAN N Hasil Analisis dengan Enzim Restriksi untuk Individu yang Memiliki Empat Haplogroup LAMPIRAN O Individu yang Tidak Termasuk ke Haplogroup Manapun... 98

14 DAFTAR GAMBAR DAN ILUSTRASI Gambar II. 1 Struktur dan Organisasi Fungsional mtdna Manusia... 7 Gambar IV.1 Urutan Nukleotida Lengkap yang belum diedit Gambar IV.2 Urutan Nukleotida Lengkap yang telah selesai diedit Gambar IV.3 Urutan Nukleotida Lengkap yang telah Dianalisis dengan Program MMA Gambar IV.4 Hasil Analisis Urutan Nukleotida Lengkap dengan Enzim Restriksi Gambar IV.5 Salah Satu Hasil Analisis dengan Enzim Restriksi untuk Individu yang Memiliki Satu Haplogroup Gambar IV.6 Salah Satu Hasil Analisis dengan Enzim Restriksi untuk Individu yang Memiliki Dua Haplogroup Gambar IV.7 Salah Satu Hasil Analisis dengan Enzim Restriksi untuk Individu yang Memiliki Tiga Haplogroup Gambar IV.8 Salah Satu Hasil Analisis dengan Enzim Restriksi untuk Individu yang Memiliki Empat Haplogroup... 27

15 DAFTAR TABEL Tabel II. 1 Perbedaan kodon mtdna manusia dengan kodon universal...9 Tabel II. 2 Perbedaan karakteristik DNA inti dan DNA mitokondria manusia...10 Tabel IV.1 Haplogroup, enzim restriksi, sisi pemotongan, jenis dan posisi mutasi Urutan nukleotida...19 Tabel IV.2 Contoh beberapa Individu yang Memiliki Satu Haplogroup...22 Tabel IV.3 Contoh beberapa Individu yang Memiliki Dua Haplogroup...24 Tabel IV.4 Contoh beberapa Individu yang Memiliki Tiga Haplogroup...26 Tabel IV.5 Contoh beberapa Individu yang Memiliki Empat Haplogroup...28 Tabel IV.6 Jumlah Haplogroup yang Sesuai dan Tidak Sesuai dengan Haplogroup RFLP...29

16 DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG SINGKATAN NAMA Pemakaian pertama kali pada halaman ATP Adenosine triphosphate 1 mtdna DNA mitokondria 1 DNA Deoxyribonucleic acid 1 CRS Cambridge reference sequence 1 RFLP Restriction fragment length polymorphism 1 MMA Mito mutation analyzer 3 kda Kilo Dalton 4 ADP Adenosine diphosphate 5 NADH Nicotinamide adenine dinucleotide hydrogen 6 FADH 2 Flavine adenine dinucleotide hydrogen 6 ND NADH dehydrogenase 6 H Heavy 6 L Light 6 RNA Ribonucleic acid 6 trna Transfer RNA 6 rrna Ribosomal RNA 6 SNP Single nucleotide polymorphism 10 HincII Haemophilus influenza Rc 11 HpaI Haemophilus parainfluenzae 11 Hinf I Haemophilus influenzae Rf 11 BamHI Bacillus amyloliquefaciens H 11 HhaI Haemophilus haemolyticus 11 HaeII Haemophilus aegypticus 11 MboI Moraxella bovis 11 AluI Arthrobacter luteus 11 HaeIII Haemophilus aegypticus 11 AvaII Anabaena variabilis 11 RsaI Rhodopseudomonas sphaeroides 11 TaqI Thermus aquaticus 11