IDENTIFIKASI SENYAWA TOKSIK EKSTRAK METANOL SPONS Clathria (Thalysias) sp DAN UJI AKTIVITASNYA SEBAGAI ANTIKANKER TERHADAP SEL HeLa

Transkripsi

1 TESIS IDENTIFIKASI SENYAWA TOKSIK EKSTRAK METANOL SPONS Clathria (Thalysias) sp DAN UJI AKTIVITASNYA SEBAGAI ANTIKANKER TERHADAP SEL HeLa PUTU LAKUSTINI CAHYANINGRUM NIM PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI KIMIA TERAPAN PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2014 i

2 IDENTIFIKASI SENYAWA TOKSIK EKSTRAK METANOL SPONS Clathria (Thalysias) sp DAN UJI AKTIVITASNYA SEBAGAI ANTIKANKER TERHADAP SEL HeLa Tesis untuk Memperoleh Gelar Magister Pada Program Magister, Program Studi Kimia Terapan Program Pascasarjana Universitas Udayana PUTU LAKUSTINI CAHYANINGRUM NIM PROGRAM MAGISTER PROGRAM STUDI KIMIA TERAPAN PROGRAM PASCASARJANA UNIVERSITAS UDAYANA DENPASAR 2014 ii

3 LEMBAR PENGESAHAN TESIS INI TELAH DISETUJUI TANGGAL 9 Desember 2014 Pembimbing I, Pembimbing II, Prof. Dr. Drs. I Made Dira Swantara, M.Si Prof. Dr. Ir. I Gede Mahardika, M.S NIP NIP Mengetahui Ketua Program Kimia Terapan Program Pascasarjana Universitas Udayana, Direktur Program Pascasarjana Universitas Udayana, Prof. Dr.Drs. I Made Dira Swantara, M.Si Prof. Dr. dr. A.A. Raka Sudewi, Sp. S(K). NIP NIP iii

4 PENETAPAN PANITIA PENGUJI TESIS Tesis ini Telah Diuji pada Tanggal 9 Desember 2014 Panitia Penguji Tesis Berdasarkan SK Rektor Universitas Udayana, No: 4433/UN14.4/HK/2014 Tanggal 4 Desember 2014 Ketua : Prof. Dr. Drs. I Made Dira Swantara, M.Si. Anggota : 1. Prof. Dr. Ir. I Gede Mahardika, M.S. 2. Dra. Ni Made Puspawati, M.Phil. PhD. 3. Dr. I Nengah Wirajana, S.Si., M.Si. 4. Dr. Drs. Manuntun Manurung, M.S. iv

5 SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT Saya yang bertandatangan di bawah ini : Nama : Putu Lakustini Cahyaningrum NIM : Program Studi : Kimia Terapan Judul Tesis :Identifikasi Senyawa Toksik Ekstrak Metanol Spons Clathria (Thalysias) sp dan Uji aktivitasnya sebagai Antikanker Terhadap Sel HeLa Dengan ini menyatakan bahwa karya ilmiah tesis ini bebas plagiat. Apabila di kemudian hari terbukti plagiat dalam karya ilmiah ini, maka saya bersedia menerima sanksi sesuai peraturan Mendiknas RI No. 17 Tahun 2010 dan Peraturan Perundang-undangan yang berlaku. Denpasar, Desember 2014 Yang membuat pernyataan, Putu Lakustini Cahyaningrum v

6 UCAPAN TERIMA KASIH Pertama-tama perkenankanlah penulis memanjatkan puji syukur ke hadapan Ida Sang Hyang Widhi Wasa/ Tuhan Yang Maha Esa, karena hanya atas asung wara nugraha-nya tesis ini dapat diselesaikan sesuai dengan waktunya. Pada kesempatan ini perkenankanlah penulis mengucapkan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Prof. Dr. Drs. I Made Dira Swantara, M.Si., selaku pembimbing utama dan sekaligus Ketua Program Studi Kimia Terapan yang dengan penuh perhatian telah memberikan dorongan, semangat, bimbingan, dan saran serta dukungan dana penelitian dalam penyelesaian tesis ini. Terima kasih sebesar-besarnya pula penulis sampaikan kepada Prof. Dr. Ir. I Gede Mahardika, M.S. sebagai pembimbing II yang dengan penuh perhatian dan kesabaran telah memberikan bimbingan dan saran kepada penulis. Ucapan terima kasih kasih juga ditujukan kepada Rektor Universitas Udayana atas kesempatan dan fasilitas yang diberikan kepada penulis untuk mengikuti dan menyelesaikan pendidikan Program Magister di Universitas Udayana. Ucapan terima kasih juga ditujukan kepada Direktur Program Pascasarjana Universitas Udayana atas kesempatan yang diberikan penulis untuk menjadi mahasiswa Program Magister pada Program Pascasarjana Universitas Udayana. Pada kesempatan ini, penulis juga menyampaikan rasa terimakasih kepada Kepala Laboratorium Marine Biologi Universitas Udayana serta para staf yang memberikan peminjaman fasilitas penelitian, staf Laboratorium PSSP Lembaga Penelitian dan Pengabdian Kepada Masyarakat IPB dan staf di Laboratorium vi

7 Bersama FMIPA Universitas Udayana dalam analisis sampel. Ungkapan terima kasih penulis sampaikan pula kepada para penguji tesis, yaitu Dra. Ni Made Puspawati, M.Phil. PhD., Dr. I Nengah Wirajana, S.Si., M.Si., dan Dr. Drs. Manuntun Manurung, M.S. yang telah memberikan masukan, saran, sanggahan, dan koreksi sehingga tesis ini dapat terwujud seperti ini. Pada kesempatan ini penulis menyampaikan ucapan terima kasih yang tulus disertai penghargaan kepada seluruh dosen program studi Kimia Terapan Universitas Udayana yang telah memberikan ilmu tiada tara kepada penulis. Penulis ucapkan terimakasih kepada Bapak I Wayan Dangin dan Ibu Putu Lasmi Yulianthi Sapanca, kedua adik tersayang serta suami tercinta atas doa dan dukungannya baik moril maupun materiil serta semangat dan dukungannya selama ini. Penulis sampaikan terimakasih kepada teman-teman seperjuangan program Studi Kimia Terapan 2012, khususnya rekan seperjuangan baik dalam suka dan duka Ni Made Diani atas bantuan, semangat dan kerjasama yang tercipta selama ini serta tidak lupa kepada Gusti Aplisia Malelak dan Evayanti Bue atas segala bantuan dan kerjasamanya selama ini. Semoga Ida Sang Hyang Widhi Wasa selalu melimpahkan rahmatnya kepada semua pihak yang telah membantu dalam penyusunan tesis ini. Akhir kata penulis ucapkan terima kasih dan semoga tesis ini dapat memberikan informasi dan manfaat baru bagi pembaca Denpasar, Desember 2014 Penulis vii

8 ABSTRAK IDENTIFIKASI SENYAWA TOKSIK EKSTRAK METANOL SPONS Clathria (Thalysias) sp DAN UJI AKTIVITASNYA SEBAGAI ANTIKANKER TERHADAP SEL HeLa Telah dilakukan identifikasi dan uji aktivitas antikanker terhadap sel HeLa dari ekstrak metanol spons Clathria (Thalysias) sp. Uji untuk mengetahui toksisitas spons Clathria (Thalysias) sp dilakukan dengan Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) menggunakan larva Artemia salina L. terhadap ekstrak kasar metanol dan etanol spons tersebut. Hasil uji menunjukkan ekstrak metanol bersifat lebih toksik dibandingkan ekstrak etanol dengan nilai LC 50 30,19 ppm. Hasil partisi ekstrak metanol menghasilkan ekstrak n-heksana, kloroform dan air. Ekstrak kloroform memiliki toksisitas paling tinggi dengan LC 50 64,57 ppm. Ekstrak kloroform dipisahkan dengan kromatografi kolom silika gel menggunakan eluen n-heksana : etil asetat (8:2), diperoleh 4 fraksi yaitu F A, F B, F C, dan F D. Fraksi B (F B ) memberikan nilai toksisitas paling tinggi dengan nilai LC 50 72,44 ppm. Isolat toksik (F B ) selanjutnya diuji secara in vitro terhadap sel HeLa, namun belum dapat menghambat pertumbuhan dan membunuh sel HeLa dengan nilai IC 50 sebesar 511,012 ppm. Identifikasi isolat F B dilakukan dengan menggunakan Kromatografi Gas-Spektroskopi Massa. Hasilnya teridentifikasi adanya 7 senyawa yaitu metil dodekanoat, metil tetradekanoat, metil heksadekanoat, dekil metil ptalat, metil 9- oktadekenoat, metil oktadekanoat dan bis(2-etilheksil)-1,2-benzenadikarboksilat. Kata kunci : Clathria (Thalysias) sp, toksisitas, aktivitas antikanker, sel HeLa viii

9 ABSTRACT IDENTIFICATION OF TOXIC COMPOUNDS IN METHANOL EXTRACT OF SPONGE Clathria (Thalysias) sp AND ANTICANCER ACTIVITIES TEST ON HeLa CELLS Identification of active compounds extracted from marine sponge Clathria (Thalysias) sp and their anticancer activity against HeLa cell had been carried out. Preliminary test to determine the toxicity of the methanol and ethanol crude extract of marine sponge Clathria (Thalysias) sp were conducted using Brine Shrimp Lethality Test (BSLT). The test results showed that the methanol extract was more toxic than ethanol extract with ppm LC 50 values. Further, partition of the methanol extract using n-hexane, chloroform and water was conducted and were found that the chloroform extract was the most toxic against Artemia salina L. larvae with LC 50 of 64,57 ppm. The chloroform extract were then separated by column chromatography using n-heksane : ethyl acetate (8:2) as eluent and 4 fractions (F A, F B, F C, dan F D ) were obtained. Fraction B, with LC 50 of 72,44 ppm, was the most toxic among those fractions. However, after tested in vitro against HeLa cell with IC 50 values of 511,012 ppm, fractions B was found unable to inhibit growth or kill the Hela cells. Identification of chemical compounds presumed to be the active anticancer in isolate of fraction B was conducted using Gas Chromatography-Mass Spectroscopy (GC-MS). Isolate of fraction B was found containing seven compounds i.e (1) dodecanoic acid methyl ester, (2) tetradecanoic acid methyl ester, (3) hexadecanoic acid methyl ester, (4) phthalic acid decyl methyl ester, (5) 9-octadecenoic acid methyl ester, (6) octadecanoic acid methyl ester and (7) 1,2-benzenedicarboxylic acid bis-2(- ethylhexyl) ester. Keywords : Clathria (Thalysias) sp, toxicity, anticancer activity, HeLa Cells ix

10 RINGKASAN Kanker merupakan suatu penyakit yangmana terjadi pertumbuhan sel-sel jaringan tubuh yang tidak normal, cepat dan tidak terkendali. Pengobatan kanker pada umumnya menggunakan kombinasi kemoterapi, radiasi, hormon, dan obat pembunuh sel kanker. Cara kemoterapi memiliki beberapa kelemahan dan efek samping berbahaya bagi tubuh. Selain itu, masih adanya obat-obatan antikanker yang memiliki efek farmakologis yang kurang selektif dimana disamping membunuh sel kanker juga membunuh sel normal, menimbulkan efek samping yang merugikan bagi penderita penyakit kanker. Efek samping yang ditimbulkan akibat penggunaan obat-obat antikanker mendorong banyak orang untuk beralih ke pengobatan dengan menggunakan bahan-bahan yang berasal dari alam dengan tujuan mendapatkan khasiat yang lebih besar dan efek toksik yang seminimal mungkin. Keanekaragaman hayati perairan laut Indonesia memberi peluang untuk memanfaatkan biota laut dalam pencarian senyawa bioaktif yang baru, salah satunya adalah spons. Spons merupakan biota laut yang potensial dijadikan bahan eksplorasi pencarian senyawa baru antikanker karena spons merupakan penghasil senyawa bioaktif antiviral maupun senyawa sitotoksik. Hewan laut ini mengandung senyawa aktif yang persentase keaktifannya lebih besar dibandingkan dengan senyawa-senyawa yang dihasilkan oleh tumbuhan darat. Telah dilaporkan pula bahwa sebagian senyawa yang diisolasi dari spons mempunyai aktivitas toksik yang tinggi terhadap antibakteri, antikanker dan antiparasit. Dalam penelitian ini spons yang diisolasi adalah spons Clathria (Thalysias) sp yang diambil dari perairan Sanur, Bali. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui aktivitas antikanker isolat toksik ekstrak spons Clathria (Thalysias) sp dan memperoleh senyawa yang terkandung dalam isolat toksik spons Clathria (Thalysias) sp. Identifikasi dan uji aktivitas antikanker terhadap sel HeLa ekstrak spons Clathria (Thalysias) sp telah dilakukan. Uji pendahuluan untuk mengetahui toksisitas ekstrak spons Clathria (Thalysias) sp dilakukan dengan Brine Shrimp Lethality Test (BSLT) menggunakan ekstrak kasar metanol dan etanol. BSLT merupakan uji toksisitas menggunakan larva Artemia salina L. untuk mengetahui suatu bahan bersifat toksik dan berpotensi dikembangkan sebagai antikanker. Hasil uji BSLT terhadap kedua ekstrak menunjukkan nilai LC 50 ekstrak metanol bersifat lebih toksik dibandingkan ekstrak etanol dengan nilai LC 50 30,19 ppm. Penelitian ini kemudian dilanjutkan dengan partisi, pemisahan ekstrak metanol, uji aktivitas antikanker terhadap sel HeLa dan identifikasi senyawa antikanker dengan menggunakan Kromatografi Gas Spektroskopi Massa. Hasil partisi ekstrak metanol menghasilkan ekstrak n-heksana, kloroform dan air. Ekstrak kloroform memiliki toksisitas paling tinggi dengan nilai LC 50 64,57 ppm. Ekstrak kloroform dipisahkan dengan kromatografi kolom silika gel menggunakan eluen n-heksana : etil asetat (8:2), diperoleh 4 fraksi (F A -F D ). Fraksi B memberikan nilai toksisitas paling tinggi dengan nilai LC 50 72,44 ppm. Isolat toksik (F B ) selanjutnya diuji secara in vitro terhadap sel HeLa, namun belum dapat x

11 menghambat pertumbuhan dan membunuh sel HeLa dengan nilai IC 50 sebesar 511,012 ppm.tingginya nilai IC 50 yang dimiliki menunjukkan fraksi B belum aktif sebagai antikanker terhadap sel HeLa karena memiliki nilai IC 50 > 30 ppm. Hasil identifikasi isolat F B dengan menggunakan Kromatografi Gas Spektroskopi Massa menunjukkan adanya 7 senyawa yang identik dengan database yaitu metil dodekanoat, metil tetradekanoat, metil heksadekanoat, dekil metil ptalat, metil 9-oktadekenoat, metil oktadekanoat dan bis(2-etilheksil)-1,2- benzenadikarboksilat. xi

12 DAFTAR ISI Halaman SAMPUL DALAM... PRASYARAT GELAR... LEMBAR PENGESAHAN... PENETAPAN PANITIA PENGUJI... SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT... UCAPAN TERIMA KASIH... ABSTRAK... ABSTRACT... RINGKASAN... DAFTAR ISI... DAFTAR TABEL... DAFTAR GAMBAR... DAFTAR LAMPIRAN... DAFTAR SINGKATAN... i ii iii iv v vi viii ix x xii xiv xv xvii xviii BAB I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Penelitian Rumusan Masalah Tujuan Penelitian Manfaat Penelitian... 6 BAB II. KAJIAN PUSTAKA 2.1 Spons Morfologi spons Struktur dan fungsi tubuh spons Klasifikasi spons Metabolit Sekunder dan Senyawa Bioaktif Spons Spons Clathria (Thalysias) sp Teknik Isolasi Senyawa Metabolit Sekunder dari Spons Ekstraksi Pemisahan dan pemurnian Metode Identifikasi Senyawa Bahan Alam Uji fitokimia Kromatografi gas- spektroskopi massa Kanker Gambaran umum kanker serviks Pengobatan kanker Uji Toksisitas Terhadap Larva Artemia salina L Uji In vitro terhadap sel HeLa xii

13 BAB III. KERANGKA BERPIKIR, KONSEP, DAN HIPOTESIS 3.1 Kerangka Berpikir dan Konsep Penelitian Hipotesis Penelitian BAB IV. METODE PENELITIAN 4.1 Rancangan Penelitian Waktu dan Tempat Penelitian Bahan dan Peralatan Penelitian Bahan penelitian Bahan kimia Alat penelitian Prosedur Penelitian Skrining sampel Isolasi metabolit Uji toksisitas terhadap larva Artemia salina L Pemisahan dan pemurnian metabolit Uji aktivitas antikanker secara in vitro terhadap sel HeLa Identifikasi Senyawa Toksik A. Uji golongan senyawa kimia (uji fitokimia) B. Kromatografi gas- spektroskopi massa (GC-MS) BAB V. HASIL PENELITIAN 5.1 Penyiapan Bahan Uji Pendahuluan Ekstraksi Spons Clathria (Thalysias) sp Partisi Ekstrak Metanol Spons Clathria (Thalysias) sp Uji Toksisitas Masing-masing Fraksi (n-heksana, kloroform, dan air) terhadap Larva Artemia salina L Pemisahan dan Pemurnian Ekstrak Kloroform Spons Clathria (Thalysias) sp Toksisitas Fraksi Hasil Pemisahan Ekstrak Kloroform Terhadap Larva Artemia salina L Uji Kemurnian Isolat Toksik (F B ) Uji Antikanker Isolat Toksik (F B ) Ekstrak Kloroform Terhadap Sel HeLa Identifikasi Isolat Toksik Uji fitokimia Identifikasi isolat F B dengan kromatografi gasspektroskopi massa (GC-MS) BAB VI. SIMPULAN DAN SARAN 6.1 Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN xiii

14 DAFTAR TABEL Halaman 5.1 Hasil Uji Toksisitas Ekstrak metanol dan etanol spons Clathria (Thalysias) sp terhadap larva Artemia salina L Uji Toksisitas fraksi n-heksana, kloroform, air terhadap larva Artemia salina L Harga Rf Hasil Kromatografi lapis tipis dari Berbagai Eluen Hasil Pemisahan dengan Kromatografi Kolom Gradien Hasil Pemisahan ekstrak kloroform dengan Kromatografi Kolom Hasil Uji Toksisitas Fraksi Hasil Kromatografi Kolom Terhadap Larva Artemia salina L Hasil Uji Kemurnian F B dengan metode KLT Data absorbansi isolat toksik (F B ) ekstrak spons Clathria (Thalysias) sp terhadap sel HeLa Uji Fitokimia untuk Fraksi F B Senyawa-senyawa yang diduga dari masing-masing puncak pada kromatogram Fraksi B ekstrak spons Clathria (Thalysias) sp Kemungkinan Fragmen yang Hilang dari Senyawa Metil Dodekanoat Kemungkinan Fragmen yang Hilang dari Senyawa Metil Tetradekanoat Kemungkinan Fragmen yang Hilang dari Senyawa Metil Heksadekanoat Kemungkinan Fragmen yang Hilang dari Senyawa Dekil Metil Ptalat Kemungkinan Fragmen yang Hilang dari Senyawa Metil-9- Oktadekenoat Kemungkinan Fragmen yang Hilang dari Senyawa Metil Oktadekanoat Kemungkinan Fragmen yang Hilang dari Senyawa Bis (2-etilheksil)-1,2-benzenadikarboksilat xiv

15 DAFTAR GAMBAR Halaman 2.1 Struktur dan Fungsi Tubuh Spons Sistem Saluran Pada Spons Kelas Hexactinellida Kelas Demospongiae Kelas Calcarea Struktur Senyawa Aeroplysinin Struktur Kimia Senyawa Strongylophorine 2 dan Stronggyloporine Struktur Kimia Senyawa Muqubilin Struktur Kimia Senyawa Aaptamine Struktur Kimia Senyawa N-Amidino-4-bromo-pyrole-2-carboxamide Struktur Kimia Senyawa (A) Spongouridin dan (B) Spongothimidine Struktur Kimia Senyawa Adociaquinon B Struktur Kimia Senyawa Bistratamide D Struktur Kimia Senyawa Discodermolide Spons Clathria (Thalysias) sp Dua Senyawa yang diduga termasuk golongan senyawa fenolik (A) dan Steroid yaitu -sitosterol (B) Struktur Kimia Microcionamides A dan Microcionamides B Gambar Sel HeLa Kerangka Konsep Penelitian Skema Kerja Isolasi, Identifikasi dan Uji Aktivitas Antikanker Ekstrak Spons Clathria (Thalysias) sp terhadap sel HeLa Spons Clathria (Thalysias) sp Reaksi Reduksi MTT menjadi Formazan Grafik Laju inhibisi Fraksi B Ekstrak Spons Clathria (Thalysias) sp Terhadap sel HeLa Kromatogram Hasil Analisis Fraksi B dengan GC-MS (a) Spektrum massa senyawa pada puncak 1 (b) Spektrum massa senyawa metil dodekanoat Struktur senyawa metil dodekanoat Pola Fragmentasi senyawa metil dodekanoat (a) Spektrum massa senyawa pada puncak 3 (b) Spektrum massa senyawa metil tetradekanoat Struktur senyawa metil tetradekanoat Pola fragmentasi senyawa metil tetradekanoat (a) Spektrum massa senyawa pada puncak 6 (b) Spektrum massa senyawa metil heksadekanoat Struktur senyawa metil heksadekanoat Pola fragmentasi senyawa metil heksadekanoat (a) Spektrum massa senyawa pada puncak 7 (b) Spektrum massa senyawa dekil metil ptalat xv

16 5.15 Struktur senyawa dekil metil ptalat Pola fragmentasi senyawa dekil metil ptalat (a) Spektrum massa senyawa pada puncak 8 (b) Spektrum massa senyawa metil-9-oktadekenoat Struktur senyawa metil-9-oktadekenoat Pola fragmentasi senyawa metil-9-oktadekenoat (a) Spektrum massa senyawa pada puncak 9 (b) Spektrum massa senyawa metil oktadekanoat Struktur senyawa metil oktadekanoat Pola fragmentasi senyawa metil oktadekanoat (a) Spektrum massa senyawa pada puncak 13 (b) Spektrum massa senyawa bis (2-etilheksil)-1,2-bezenadikarboksilat Struktur senyawa bis(2-etilheksil)-1,2-benzenadikarboksilat Pola fragmentasi senyawa bis(2-etilheksil)-1,2- benzenadikarboksilat xvi

17 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1. Prosedur Pembuatan Pereaksi Pendeteksi Pembuatan Larutan untuk Uji Toksisitas terhadap Larva Artemia salina Leach Perhitungan Nilai LC 50 Ekstrak Kasar Metanol dan Etanol terhadap larva Artemia salina Leach Perhitungan Nilai LC 50 Hasil Partisi Ekstrak Kasar Metanol terhadap Larva Artemia salina Leach Perhitungan Harga Rf Hasil KLT Ekstrak Kental Kloroform dengan Berbagai Campuran Eluen Gambar Hasil Kromatografi Lapis Tipis dengan Berbagai Eluen Perhitungan Nilai LC 50 Hasil Kromatografi Kolom terhadap Larva Artemia salina Leach Perhitungan Harga Rf Hasil KLT Penggabungan Kromatografi Kolom Ekstrak Kloroform Gambar Hasil KLT Penggabungan dengan Pengembang n-heksana : Etil Asetat (8:2) Perhitungan Harga Rf Uji Kemurnian Fraksi B Hasil Kromatogram Fraksi B Ekstrak Kloroform Spons Clathria (Thalysias) sp Hasil Spektroskopi Massa Senyawa-Senyawa Fraksi B Ekstrak Kloroform Spons Clathria (Thalysias) sp Data Hasil Uji Aktivitas Antikanker Fraksi B Terhadap Sel HeLa dengan Metode MTT Perhitungan IC 50 Fraksi B Terhadap Sel HeLa Surat Keterangan Identifikasi Spons Clathria (Thalysias) sp Deskripsi Spons Clathria (Thalysias) sp xvii

18 DAFTAR SINGKATAN LC 50 IC 50 DMSO MTT RPMI FBS DCM NaOH FeCl 3 H 2 SO 4 HCl Mg g mg cm nm ml μl ppm Rpm CO 2 PBS : Lethal Concentration : Inhibition Concentration : Dimetil sulfoksida : 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium bromida : Rossswell Park Memorial Institute : Fetal Bovine Serum : Diklorometana : Natrium Hidroksida : Besi (III) klorida : Asam sulfat : Asam klorida : Magnesium : gram : miligram : sentimeter : nanometer : milimeter : mikroliter : part per milion atau mg/l : rotate per minute : Karbon dioksida : Phosphate Buffer Solution xviii