KARAKTERISASI DAN PENENTUAN PARAMETER. Enterobacter cloacae RESTI SITI MUTHMAINAH

Transkripsi

1 KARAKTERISASI DAN PENENTUAN PARAMETER KINETIK ENZIM β-galaktosidase DARI Enterobacter cloacae RESTI SITI MUTHMAINAH DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011

2 ABSTRAK RESTI SITI MUTHMAINAH. Karakterisasi dan Penentuan Parameter Kinetik Enzim β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae. Dibimbing oleh DJAROT SASONGKO H.S dan TATIK KUSNIATI. Enzim β-galaktosidase merupakan enzim yang dapat mengubah laktosa menjadi glukosa dan galaktosa. Enzim β-galaktosidase dihasilkan dari berbagai organisme meliputi tanaman, hewan, dan mikrorganisme. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengkarakterisasi (aktivitas, ph optimum, suhu optimum, aktivator, inhibitor dan tingkat pemurnian) serta menentukan parameter kinetik (V maks dan K M ) enzim β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae. Bakteri ditumbuhkan pada media laktosa, pepton, dan ekstrak khamir (LPY) yang mengandung laktosa 2%, pepton 1%, ekstrak khamir 2%, dan NaCl 1% dalam 1 liter akuades. Kondisi optimum β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae pada waktu produksi 18 jam, ph 7 dan suhu 35 C. Ion-ion logam (Ca 2+, Hg +, Cu 2+, Co 2+, Zn 2+, Mg 2+, dan Mn 2+ ) merupakan inhibitor enzim β-galaktosidase, sedangkan ion Mg 2+ dan Mn 2+ diketahui berperan sebagai aktivator enzim. Hasil penentuan parameter kinetik dari enzim β-galaktosidase yang dimurnikan dengan pengendapan ammonium sulfat dan dialisis diperoleh V maks sebesar µmol/menit dan K M sebesar mm, sedangkan untuk pembandingnya ekstrak kasar enzim didapatkan nilai V maks µmol/menit dan K M mm.

3 ABSTRACT RESTI SITI MUTHMAINAH. Characterization and Determination of Kinetic Parameters β-galactosidase enzyme from Enterobacter cloacae. Supervised by DJAROT SASONGKO H.S and TATIK KUSNIATI. β-galactosidase is an enzyme that can convert lactose into glucose and galactose. Β-galactosidase enzyme produced from various organisms include plants, animals and microorganisms. The purpose of this study was to characterize (activity, optimum ph, optimum temperature, activators, inhibitors and the level of purification) as well as determine the kinetic parameters (V max and K M ) β- galactosidase enzyme from Enterobacter cloacae. Bacteria were grown in lactose media, peptone, and yeast (LPY) that contain lactose 2%, peptone 1%, 2% yeast extract, and 1% NaCl in 1 liter of distilled water. The optimum condition of β- galactosidase from Enterobacter cloacae was on production time 18 hours, ph 7 and temperature 35 C. Metal ions (Ca 2+, Hg +, Cu 2+, Co 2+, Zn 2+, Mg 2+, and Mn 2+ ) is an inhibitor of the enzyme β-galactosidase, whereas Mg 2+ and Mn 2+ are known role as an enzyme activator. The result of the determination of kinetic parameters of β- galactosidase enzyme which was purified by ammonium sulfate precipitation and dialysis V max obtained at µmol / min and K M at mm, whereas the crude extract obtained V max value of µmol / min and K M values of mm.

4 KARAKTERISASI DAN PENENTUAN PARAMETER KINETIK ENZIM β-galaktosidase DARI Enterobacter cloacae RESTI SITI MUTHMAINAH Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia DEPARTEMEN BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2011

5 Judul Skripsi : Karakterisasi dan Penentuan Parameter Kinetik Enzim β- Galaktosidase dari Enterobacter cloacae Nama : Resti Siti Muthmainah NRP : G Disetujui Komisi Pembimbing Dr. Djarot Sasongko H.S, MS Ketua Dr. Ir. Tatik Khusniati, M. App. Sc Anggota Diketahui Dr. I Made Artika, M.App, Sc Ketua Departemen Biokimia Tanggal Lulus :

6 PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-nya sehingga penulis dapat menyelesaikan Laporan Penelitian dengan judul Karakterisasi dan Penentuan Parameter Kinetik Enzim β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae. Kegiatan penelitian ini telah dilakukan dari bulan Juli hingga Desember 2010 di Laboratorium Biokimia Mikrob, Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), di Jalan Raya Bogor km 46, Cibinong. Pada kesempatan ini, penulis mengucapkan terima kasih kepada Bapak Dr. Djarot Sasongko HS, MS selaku ketua komisi pembimbing dari Program Studi Biokimia dan Ibu Dr. Ir. Tatik Khusniati, M.App.Sc selaku anggota pembimbing dari institusi LIPI. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada ayah, mama, adik, keluarga yang telah memberikan dukungan moril, doa dan kasih sayangnya. Keluarga pondok dinar, staf LIPI dan teman-teman Biokimia 43 terima kasih atas bantuan, nasihat, dan semangatnya. Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini, untuk itu penulis mengharapkan kritik dan saran membangun ke arah perbaikan. Semoga usulan penelitian ini dapat bermanfaat bagi kita semua. Bogor, Februari 2011 Resti Siti Muthmainah

7 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Garut pada tanggal 17 Januari 1988 dari pasangan Entun Martunus dan Siti Hapsoh. Penulis merupakan anak pertama dari tiga bersaudara. Tahun 2000 penulis lulus dari SDN 1 Cikelet, Garut, dan melanjutkan ke sekolah menengah pertama di MTs Bahrul Ulum, Garut dan lulus tahun Penulis menyelesaikan studi di SMUN 6 Garut, pada tahun 2006 dan pada tahun yang sama penulis diterima di Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Pada tahun 2007, penulis diterima di Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif di Himpunan Profesi Crebs Departemen Keilmuan periode 2007/2008. Penulis juga pernah menjadi asisten mata kuliah Struktur dan Fungsi Subseluler pada tahun ajaran 2009/2010. Penulis juga pernah menjadi asisten mata kuliah Biokimia Umum pada tahun ajaran 2010/2011. Penulis pernah diberi kesempatan pada awal 2008 melaksanakan praktik lapang di Laboratorium Biokimia Mikrob, Bidang Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), di Jalan Raya Bogor km 46, Cibinong dengan judul Isolasi dan Seleksi Bakteri Penghasil Enzim β-galaktosidase pada Beberapa Buah-Buahan Tropis.

8 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR GAMBAR... viii DAFTAR TABEL... viii DAFTAR LAMPIRAN... PENDAHULUAN... 1 TINJAUAN PUSTAKA β-galaktosidase... 1 Enterobacter cloacae... 2 Isolasi dan Pemekatan Enzim... 2 Karakterisasi Enzim... 3 Analisis Aktivitas β-galaktosidase... 4 BAHAN DAN METODE Alat dan Bahan... 4 Tahapan Penelitian... 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Produksi Enzim β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae... 6 Hasil Optimasi Suhu β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae... 7 Hasil Optimasi ph β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae... 8 Aktivitas Enzim β-galaktosidase Terhadap Penambahan Ion Logam... 8 Aktivitas Spesifik β-galaktosidase Hasil Pengendapan Amonium Sulfat... 9 Hasil Tahapan Pemurnian Enzim β-galaktosidase Nilai V maks dan K M Enzim β-galaktosidase SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Saran DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN ix

9 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Reaksi hidrolisis laktosa oleh β-galaktosidase Enterobacter cloacae Reaksi hidrolisis ONPG oleh β-galaktosidase Kurva pertumbuhan dan aktivitas β-galasidase dari Enterobacter cloacae Kadar protein β-galaktosidase pada Enterobacter cloacae Pengaruh suhu terhadap aktivitas β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae Pengaruh pemanasan selama 1 jam pada berbagai suhu terhadap aktivitas β- galaktosidase Pengaruh ph terhadap aktivitas β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae Pengaruh pemanasan selama 1 jam pada berbagai ph terhadap aktivitas β- galaktosidase Aktivitas enzim β-galaktosidase pada penambahan ion logam Aktivitas spesifik β-galaktosidase pada pengendapan ammonium sulfat berbagai konsentrasi Kurva Michaelis-Menten ekstrak kasar enzim β-galaktosidase dan dialisis Kurva Lineweaver-Burk ekstrak kasar enzim β-galaktosidase dan dialisis... 11

10 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Diagram alir penelitian Perhitungan aktivitas β-galaktosidase Penentuan kurva pertumbuhan Enterobacter cloacae Penentuan kurva standar ONP pada panjang gelombang 420 nm Data hasil aktivitas β-galaktosidase waktu pertumbuhan Enterobacter cloacae Penentuan kadar protein pada panjang gelombang 595 nm Data hasil kadar protein waktu pertumbuhan Enterobacter cloacae Penentuan suhu optimum enzim β-galaktosidase dari Enterbacter cloacae Data hasil pengaruh pemanasan selama 1 jam pada berbagai suhu terhadap aktivitas enzim β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae Penentuan ph optimum enzim β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae Data hasil pengaruh pemanasan selama 1 jam pada berbagai ph terhadap aktivitas enzim β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae Penentuan pengaruh ion logam pada aktivitas β-galaktosidase Data hasil aktivitas β-galaktosidase dengan pengendapan ammonium sulfat pada berbagai fraksi Data hasil kadar protein dengan pengendapan ammonium sulfat pada berbagai fraksi Data hasil aktivitas spesifik β-galaktosidase dengan pengendapan ammonium sulfat pada berbagai fraksi pemurnian Data penentuan kinetika enzim pada ekstrak kasar enzim β-galaktosidase Data penentuan kinetika enzim β-galaktosidase pada dialisis Komposisi media LPY dalam 1 L aquades Pembuatan pereaksi... 26

11 PENDAHULUAN Laktosa merupakan gula pereduksi yang terdapat pada atom C pertama dari molekul glukosa. Seperti diketahui laktosa merupakan disakarida yang tersusun dari glukosa dan galaktosa dengan ikatan 1-4. Di dalam tubuh, laktosa disintesis di dalam kelenjar susu (Belitz et al. 2009). Laktosa merupakan karbohidrat utama dengan proporsi 4.7% dari total susu (Chaplin 2004). β-galaktosidase termasuk kelompok enzim glikosidase yang mampu menghidrolisis gugus β-d-galaktosil terminal dari polimer β-dgalaktosida. Enzim β-galaktosidase termasuk dalam kelompok metaloenzim dan merupakan enzim tetramer dengan empat subunit yang identik (Jacobson et al. 1994). Enzim β-d-galaktosidase ini berfungsi dalam memecah laktosa yang terdapat di mukosa usus halus. Enzim tersebut bekerja memecah laktosa menjadi monosakarida yang siap untuk diserap oleh tubuh yaitu glukosa dan galaktosa. Apabila ketersediaan β-dgalaktosidase tidak mencukupi, laktosa yang terkandung dalam susu tidak akan mengalami proses pencernaan dan akan dipecah oleh bakteri di dalam usus halus. Proses fermentasi yang terjadi dapat menimbulkan gas yang menyebabkan kembung dan rasa sakit di perut. Sedangkan sebagian laktosa yang tidak dicerna akan tetap berada dalam saluran cerna dan tidak terjadi penyerapan air dari feses sehingga penderita akan mengalami diare. Gejala ini dinamakan laktosa intoleran, dimana suatu kondisi ketidakmampuan mencerna laktosa menjadi glukosa dan galaktosa karena enzim β- D-galaktosidase yang rendah pada mukosa usus halus. Penderita laktosa intoleran di Amerika sekitar 95%, Eropa 50%, Asia 80%, dan Afrika 80% (Rusynyk & Still 2001). Enzim β-galaktosidase banyak digunakan untuk biosintesis galaktooligosakarida dan laktulosa yang merupakan senyawa prebiotik, pemacu pertumbuhan mikrob probiotik, dan yang terpenting dalam keseimbangan mikroflora dalam usus pencernaan manusia. Manfaat lain dari β-galaktosidase adalah untuk mengkonversikan limbah industri susu hewani menjadi substrat untuk bioindustri (Gonzalec Siso et al.1996). Enzim β-galaktosidase dapat dihasilkan dari tanaman, hewan, dan mikroorganisme. Salah satunya adalah Enterobacter cloacae. Enterobacter cloacae menghasilkan β- galaktosidase dengan aktivitas transglikosilasi sebesar 55% (Liu et al. 2009). Bidang Mikrobiologi LIPI Cibinong telah mengidentifikasi kemampuan E. cloacae dalam memproduksi enzim ini. Namun demikian, karakterisasi dan penentuan parameter kinetik enzim β-galaktosidase dari bakteri Enterobacter cloacae belum diteliti. Penelitian ini bertujuan mengkarakterisasi (aktivitas, ph optimum, suhu optimum, aktivator, inhibitor dan tingkat pemurnian) serta menentukan parameter kinetik (V maks dan K M ) enzim β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae. Hipotesis penelitian ini adalah bakteri Enterobacter cloacae menghasilkan β-galaktosidase yang terkarakterisasi. Selain itu, dihasilkan β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae yang terukur parameter kinetik (V maks dan K M ) dan tingkat pemurniannya. Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai berbagai bakteri Enterobacter cloacae yang menghasilkan β-galaktosidase yang terkarakterisasi. Selain itu, diharapkan juga dapat memberikan informasi ilmiah mengenai parameter kinetik (V maks dan K M ) dan tingkat pemurnian enzim β-galaktosidase dari bakteri Enterobacter cloacae. TINJAUAN PUSTAKA β-galaktosidase β-galaktosidase (EC ) termasuk enzim hidrolase yang dapat menghidrolisis ikatan β-d-galaktosida pada ujung nonreduksi residu β-d-galaktosa (Gambar 1). Nama sistematiknya adalah β-d-galaktosida galaktohidrolase. Enzim ini mempunyai nama lain yaitu laktase. Enzim β-galaktosidase bersifat intraseluler pada bakteri dan khamir, tetapi bersifat ekstraseluler pada fungi. Enzim β-galaktosidase juga bersifat induktif, karena akan diproduksi jika terdapat induser berupa laktosa (Mahoney 2004). Enzim β-galaktosidase dari bakteri seperti Lactobacillus bulgaricus bersifat aktif pada ph rendah (dibawah ph 5.5) dengan suhu berkisar 30-60ºC. Enzim β-galaktosidase dari yeast seperti Kluyveromyces lactis dan Kluyveromyces fragilis bersifat aktif pada ph netral sekitar 6-8 dengan suhu berkisar 25-40ºC. Enzim yang sama hasil produksi dari fungi seperti Aspergillus niger dan Aspergillus oryzae aktif pada ph rendah berkisar serta bersifat termostabil (Mahoney 2004). β- galaktosidase terdapat pada usus halus manusia yang dapat menghidrolisis laktosa menjadi glukosa dan galaktosa serta mempunyai ph optimum 6 (Campbell et al. 2000) Matthews (2005) menyatakan bahwa enzim ini berbentuk tetramer yang terdiri dari 4 rantai

12 2 polipeptida (monomer) serta berbobot molekul sekitar 464 kda. Setiap monomer terdiri dari 1023 asam amino. Enzim ini berperan sebagai katalisator pada reaksi hidrolisis dan transglikosilasi (Liu et al. 2009). Gambar 1 Reaksi hidrolisis laktosa oleh β- galaktosidase (Chaplin 2004). Enterobacter cloacae Bakteri ini memiliki klasifikasi sebagai berikut: kingdom Bacteria, filum Proteobacteria kelas Gamma Proteobacteria, ordo Enterobacteriales, famili Enterobacteriaceae, genus Enterobacter, dan spesies Enterobacter cloacae. Enterobacter cloacae merupakan bakteri Gram negatif, tidak membentuk spora, anaerob fakultatif, dan motil dengan flagela peritrikus (Buchanan 2006). Enterobacter cloacae mempunyai bentuk seperti batang dengan ukuran x µm, sehingga kecil dibandingkan dengan bakteri lainnya (Gambar 2). Enterobacter cloacae dapat diisolasi dari buah-buahan, usus hewan, tanah, dan perairan (Pelczar & Chan 1999). Liu et al (2009) menyatakan bahwa bakteri ini mampu menghasilkan β-galaktosidase dengan suhu optimum 35 C dan aktif pada kisaran ph Enzim β-galaktosidase yang dihasilkan dari bakteri ini mampu mengkatalisis reaksi hidrolisis dan transglikosilasi. Gambar 2 Enterobacter cloacae (Pelczar & Chan 1999). Isolasi dan Pemekatan Enzim Pemekatan enzim merupakan langkah awal dari proses pemurnian selanjutnya dan dapat digunakan untuk keperluan analisis enzim. Pemekatan enzim dapat dilakukan dengan dua metode yaitu analitik dan preparatif (penyiapan). Metode analitik menggunakan pengendapan asam (contohnya asam trikloroasetat) dan imunopresipitasi yang dapat menyebabkan denaturasi protein. Berbeda dengan metode analitik, metode preparatif tetap mempertahankan aktivitas protein. Pemekatan protein dengan metode preparatif misalnya dengan pengendapan garam, pengendapan dengan senyawa organik, ultrafiltrasi, liofiliasi, dan dialisis. Metode pemekatan β-galaktosidase yang dilakukan pada penelitian ini adalah menggunakan pengendapan dengan garam. Pengendapan protein pada awal pemurnian berfungsi untuk memekatkan konsentrasi protein enzim, mereduksi volume larutan enzim, dan memisahkan enzim yang diinginkan dari sebagian enzim yang tidak dikehendaki. Prinsip pengendapan dengan garam berdasarkan pada kelarutan protein yang berinteraksi polar dengan molekul air, interaksi ionik protein dengan garam, dan daya tolak menolak protein yang bermuatan sama. Pengendapan dengan garam biasanya menggunakan garam divalen seperti MgCl 2, MgSO 4, dan amonium sulfat biasanya lebih efektif daripada garam monovalen seperti NaCl, NH 4 Cl, dan KCl (Boyer 2000). Efek salting-in tidak dipengaruhi oleh sifat garam netral tetapi dipengaruhi oleh konsentrasi dan jumlah muatan pada tiap ion dalam larutan. Kelarutan protein meningkat pada kenaikan konsentrasi garam, kenaikan kelarutan protein akan meningkatkan kekuatan ion larutan. Pada penambahan garam dengan konsentrasi tertentu kelarutan protein akan menurun (salting-out). Konsentrasi garam yang optimum ini sekaligus menurunkan aktivitas enzim. Hal ini dikarenakan sebagian protein mengalami denaturasi dan rusak oleh pengaruh perlakuan selama pengendapan. Semakin banyak molekul air yang berikatan dengan ion-ion garam akan menyebabkan penarikan molekul air yang mengelilingi permukaan protein. Peristiwa ini mengakibatkan protein saling berinteraksi, teragregasi, dan mengendap (Scopes 1987). Pemilihan garam amonium sulfat untuk pengendapan β-galaktosidase karena beberapa keuntungan seperti kelarutannya tinggi, tidak bersifat toksik, murah, dan stabilitasnya terhadap enzim. Proses pengendapan terjadi penurunan kadar protein pada supernatan dan akan terjadi peningkatan protein pada endapan. Penambahan garam dilakukan sedikit demi sedikit sambil diaduk pada suhu rendah, hal ini bertujuan untuk menghindari timbulnya buih yang dapat menyebabkan denaturasi protein.

13 3 Karakterisasi Enzim Bakteri mengandung enzim konstitutif dan induktif. Enzim konstitutif merupakan enzim yang terdapat dalam sel bakteri dalam jumlah tetap dan tidak bergantung pada keadaan metabolisme organisme tersebut seperti enzim yang terlibat di dalam lintasan glikolisis. Enzim induktif dalam sel bakteri terdapat dalam berbagai konsentrasi. Dalam keadaan normal terdapat dalam jumlah kecil, tetapi konsentrasinya akan meningkat dengan cepat bila substrat tersebut merupakan sumber karbon satu-satunya bagi sel (Lehninger 2004). Aktivitas enzim terhadap substrat dipengaruhi oleh beberapa faktor yaitu, ph, suhu, konsentrasi substrat, aktivator (koenzim dan kofaktor), dan inhibitor. ph Efek ph pada enzim berkaitan dengan keadaan ionisasi dari sistem yang dikatalisis, termasuk substrat, dan enzim itu sendiri. Perubahan ph dapat mempengaruhi keadaan ionisasi dari asam-asam amino pada sisi aktif enzim sehingga akan mempengaruhi interaksinya dengan molekul substrat. Kadar ph yang terlalu tinggi atau terlalu rendah akan menyebabkan ketidakstabilan pada konformasi enzim sehingga menyebabkan struktur pada enzim rusak. Enzim mempunyai ph optimum yang khas yang akan menyebabkan aktivitas maksimal. Keadaan optimum ini dihubungkan dengan saat gugus pemberi proton atau penerima proton yang aktif pada sisi enzim berada pada kondisi ionisasi yang tepat. Keadaan optimum tidak harus sama dengan ph lingkungannya. Aktivitas enzim dalam sel sebagian diatur oleh ph media kulturnya (Lehninger 2004). Enzim β-galaktosidase yang berasal dari fungi mempunyai ph optimum sekitar , sedangkan yang berasal dari yeast berkisar (Huang et al. 1995). Enzim β-galaktosidase dari bakteri mempunyai ph optimum (Winarno 1999). Suhu Suhu mempengaruhi laju reaksi katalisis enzim dengan dua cara. Pertama, kenaikan suhu akan meningkatkan energi molekul substrat dan pada akhirnya meningkatkan laju reaksi enzim. Peningkatan suhu juga berpengaruh terhadap perubahan konformasi substrat sehingga sisi aktif substrat mengalami hambatan untuk memasuki sisi aktif enzim dan menyebabkan turunnya aktivitas enzim. Kedua, peningkatan energi termal molekul yang membentuk struktur protein enzim itu sendiri akan menyebabkan rusaknya interaksi-interaksi non kovalen yang menjaga struktur 3D enzim secara bersama-sama sehingga enzim mengalami denaturasi. Denaturasi menyebabkan struktur lipatan enzim membuka pada bagian permukaannya sehingga sisi aktif enzim berubah dan terjadi penurunan aktivitas enzim (Hames dan Hooper 2000). Peningkatan suhu sebelum tercapai suhu optimum akan meningkatkan kecepatan reaksi katalitik enzim karena energi kinetik molekulmolekul yang bereaksi, yaitu pada saat kompleks enzim-substrat melampaui energi aktivasi terlalu besar, sehingga memecah ikatan sekunder pada konformasi enzim dan sisi aktifnya. Hal ini mengakibatkan enzim terdenaturasi dan kehilangan sifat katalitiknya (Matin 1981). β-galaktosidase yang dihasilkan oleh fungi mempunyai suhu optimum 55 C, sedangkan yeast mempunyai suhu optimum 35 C (Crueger & Crueger 1982). Aktivator dan Inhibitor Beberapa enzim membutuhkan komponen tambahan bagi aktivitasnya. Bila komponen tambahan tersebut berupa senyawa anorganik disebut kofaktor, sedangkan jika senyawa organik disebut koenzim. Pada beberapa enzim, kofaktor dan koenzim terlibat langsung pada proses katalitik, tetapi ada juga yang berfungsi sebagai pembawa gugus fungsional tertentu. Hampir semua enzim dapat dihambat oleh senyawa kimia tertentu misalnya ion logam, senyawa pengkelat, senyawa organik, bahkan substrat enzim itu sendiri (Lehninger 2004). Parameter Kinetik Michaelis-Menten mendefinisikan suatu tetapan yang dinyatakan sebagai tetapan Michaelis-Menten (K M ) adalah konsentrasi substrat tertentu pada saat enzim mencapai setengah kecepatan maksimumnya. Kecepatan maksimum (V maks ) adalah kecepatan yang berangsur-angsur dicapai pada konsentrasi substrat tinggi. Persamaan Michaelis-Menten adalah pernyataan aljabar bagi bentuk hiperbolik kurva tersebut dengan parameter pentingnya adalah konsentrasi substrat ([S]), kecepatan awal (V 0 ), V maks, dan K M. Persamaan ini menjadi dasar bagi semua penelitian kinetika enzim karena memungkinkan perhitungan kuantitatif sifat-sifat enzim dan analisis penghambatan enzim (Lehninger 2004). Persamaan Michaelis-Menten adalah sebagai berikut. V 0 V = K maks M [ S] + [ S]

14 4 Terlihat bahwa K M tidak dipengaruhi oleh konsentrasi substrat maupun konsentrasi enzim. K M hanya dapat diubah oleh faktor lingkungan. Kecepatan maksimum (V maks ) dapat ditingkatkan dengan meningkatkan konsentrasi enzim dan mengubah faktor lingkungan. Persamaan Michaelis-Menten dapat ditransformasikan ke suatu persamaan lain yang disebut persamaan Lineweaver-Burk. Persamaan ini akan menghasilkan nilai V maks dan K M yang lebih tepat karena pemetaan 1/V 0 terhadap 1/[S] menghasilkan garis lurus. Garis ini akan memiliki sudut K M /V maks, perpotongan garis pada sumbu y sebesar 1/V maks dan perpotongan pada sumbu x sebesar -1/K M (Lehninger 2004). Persamaan Lineweaver-Burk adalah sebagai berikut. 1 V 0 K = V M maks [ S] V maks Keterangan: Vo = kecepatan awal V maks = kecepatan maksimum [S] = konsentrasi substrat = konstanta Michaelis-Menten K M Analisis Aktivitas β-galaktosidase Aktivitas β-galaktosidase dapat diketahui dengan menggunakan substrat laktosa untuk menentukan jumlah glukosa dan galaktosa yang terbentuk. Oleh karena itu, penentuan aktivitas β-galaktosidase sering dilakukan dengan mengukur jumlah glukosa dan galaktosa. Umumnya digunakan o-nitrofenil-β-galaktosida (ONPG) sebagai pengganti substrat laktosa. Laju dari reaksi tersebut dapat diikuti dengan memperkirakan jumlah kromogen o-nitrofenol yang terbentuk (Winarno 1999). Metode analisis aktivitas β-galaktosidase pada penelitian ini menggunakan substrat o- nitrofenil-β-galaktosida (onpg). Dalam keadaan normal, onpg tidak berwarna. Ketika β-galaktosidase menghidrolisis onpg maka akan menghasilkan galaktosa dan o-nitrofenol (onp). Reaksi ini dihentikan dengan penambahan Na 2 CO 3 sehingga ph di dalam larutan menjadi basa sekitar ph Pada ph tersebut onp akan berubah menjadi bentuk anionik yang berwarna kuning dan β- galaktosidase menjadi inaktif. Jumlah onp sebanding dengan jumlah β-galaktosidase yang bereaksi sehingga intensitas warna kuning yang dihasilkan dari onp dapat digunakan untuk menentukan konsentrasi enzim. Jumlah onp yang terbentuk dapat dideteksi dengan spektrofotometer pada λ = 420 nm (Miller 2005) (Gambar 3). onpg Galaktosa onp (tidak berwarna) (kuning) Gambar 3 Reaksi hidrolisis ONPG oleh β- galaktosidase (Miller 2005). BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan yang digunakan antara lain biakan berupa Enterobacter cloacae yang merupakan koleksi Bidang Mikrobiologi LIPI Cibinong. Media kultur dan media produksi terdiri atas 10 g laktosa, 5 g pepton, 10 g ekstrak khamir, dan 5 g NaCl yang dilarutkan dalam 1000 ml akuades (ph 7). Bufer yang digunakan adalah bufer fosfat 0.1 M, 0.05 M, dan 0.01 M, bufer asetat 0.1 M, bufer Tris-HCl 0.1 M. Bahan untuk penentuan aktivitas enzim β- galaktosidase, pembuatan kurva standar dan kadar protein adalah enzim β-galaktosidase, commasie briliant blue 0.1%, o-nitrofenil-β-dgalaktopiranosida (onpgal), Na 2 CO 3 1 M, dan o-nitrofenol (onp), bovine serum albumin (BSA). Bahan untuk pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim digunakan berbagai ion logam (Hg +, Cu 2+, Ca 2+, Co 2+, Mg 2+, Mn 2+, Zn 2+ ). Bahan untuk pemurnian enzim digunakan garam amonium sulfat dan membran selofan. Alat-alat yang digunakan untuk penentuan waktu produksi optimum, uji aktivitas enzim β- galaktosidase dan karakterisasinya serta produksi β-galaktosidase adalah mikropipet, jarum ose, tip, laminar air flow cabinet, tabung reaksi, tabung Eppendorf, labu Erlenmeyer, labu ukur, termometer, neraca analitik, vorteks, penangas air Memmert, penangas bergoyang, stopwatch, ph meter HM-25G TOADKK, kuvet, spektrofotometer UV-Vis 1700 Shimadzu, inkubator Isuzu, botol sentrifus, sonikator Eyela. Alat-alat yang digunakan untuk dialisis adalah gelas piala 1 liter, membran selofan, kantung dialisis, dan magnetic stirrer. Metode Penelitian Penentuan Waktu Produksi Optimum (Liu et.al 2009) Sebanyak 2% inokulum bakteri Enterobacter cloacae dengan kerapatan optik

15 5 0.7 setara dengan jumlah koloni/sel, diinokulasi ke dalam 300 ml media kultur, lalu diinkubasi dan diagitasi pada suhu 37ºC. Sel dipanen dua kali dalam sehari (setiap 6 jam) pada hari ke-0 hingga hari ke-2 sebanyak 15 ml. Setelah itu, jumlah bakteri diukur pada OD 600, dan sampel disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama 15 menit pada suhu 4ºC. Kemudian, pelet dilarutkan dalam 1 ml bufer fosfat 0.05 M ph 6.5. Pemecahan sel dilakukan dengan menggunakan glass bead dan divorteks selama 5 menit. Selanjutnya, suspensi sel disentrifus dengan kecepatan rpm selama 15 menit pada suhu 4ºC. Supernatannya kemudian digunakan untuk uji aktivitas β- galaktosidase. Uji Aktivitas Enzim β-galaktosidase (Liu et al. 2009) Sebanyak 1000 µl buffer fosfat 0.1 M ph 7 dan 100 µl enzim dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 5 menit. Larutan ditambahkan 200 µl o-nitrofenil-β-d-galaktopiranosida (onpgal) 4 mg/ml dan diinkubasi pada suhu 37 C selama 15 menit. Menit ke-15 larutan ditambahkan 1000 µl Na 2 CO 3 1 M. Setelah itu, larutan dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 420 nm. Aktivitas enzim (U/ml) didefinisikan sebagai jumlah µmol o- nitrofenol (onp) yang dibentuk per menit per mililiter enzim pada kondisi percobaan. Pembuatan kurva standar dilakukan dengan cara membuat stok onp berbagai konsentrasi dari mg/ml ( µmol) yang dilarutkan dalam 20 ml bufer fosfat 0.01 M ph 7, kemudian larutan diaduk rata. Sebanyak 1000 µl buffer fosfat 0.1 M ph 7 dan 100 µl aquades dimasukkan ke dalam tabung reaksi. Larutan tersebut ditambahkan 200 µl onp, dan 1000 µl Na 2 CO 3 1 M. Setelah itu, larutan dianalisis dengan menggunakan spektrofotometer UV-VIS pada panjang gelombang 420 nm. Rumus perhitungannya sebagai berikut: mikromol onp Aktivitas (U/ml) = V t Keterangan: V = Volume enzim yang diuji (0.1 ml) t = Waktu inkubasi ( 15 menit) Karakterisasi β-galaktosidase (Liu et al. 2009) Karakterisasi enzim meliputi suhu optimum, ph optimum, efek ion logam, pengaruh pemanasan dan parameter kinetik. Enzim diujikan pada suhu inkubasi (25-45 C) dengan selang 5ºC, dan bufer pada kisaran ph selang 0.5 diinkubasi selama 5 menit sebelum ditambahkan onpgal 4 mg/ml. Pada pengaruh pemanasan selama 1 jam, enzim diujikan pada berbagai suhu dan ph, diinkubasi selama 1 jam, kemudian ditambahkan onpgal 4 mg/ml dan diinkubasi selama 15 pada suhu 37 ºC. Ion-ion logam yang digunakan (Hg +, Cu 2+, Ca 2+, Co 2+, Mg 2+, Mn 2+, Zn 2+ ) pada konsentrasi 0.01 M. Penentuan parameter kinetiknya dilakukan pada enzim kasar dan enzim hasil pemurnian (dialisis) yang diujikan pada konsentrasi 0.1, 1, 2, 4, 5 mg/ml dan waktu inkubasi 5-20 menit selang 5. Produksi β-galaktosidase (Wang & Sakakibara 1997) Sebanyak 2% inokulum E. cloacae diinokulasikan ke dalam 900 ml media produksi yang telah steril, diinkubasi pada suhu 37 C. Kemudian, sel dipanen setelah inkubasi selama 18 jam (waktu produksi β-galaktosidase optimum). Setelah itu, cairan disentrifus dengan kecepatan rpm ( g) selama 15 menit pada suhu 4 C. Peletnya dilakukan pencucian sebanyak dua kali dengan buffer fosfat 0.05 M ph 6.5. Setelah itu, sebanyak pelet yang diperoleh dilarutkan dalam 30 ml buffer fosfat 0.05 M ph 6.5, dan dilakukan pemecahan sel dengan sonikator 50 khz selama 5 menit pada suhu 4 C. Suspensi sel disentrifus dengan kecepatan rpm selama 15 menit pada suhu 4 C. Supernatan yang diperoleh merupakan cairan enzim β- galaktosidase. Penentuan Kadar Protein (Bradford 1976) Enzim β-galaktosidase sebanyak 100 µl ditambahkan 5 ml larutan coomassie briliant blue 0.1%. Larutan divorteks dan didiamkan selama 5 menit lalu diukur absorbansinya pada panjang gelombang 595 nm. Pembuatan kurva standar protein yang digunakan adalah bovine serum albumin (BSA) dengan berbagai konsentrasi dari mg/ml serta perlakuan yang sama dengan penentuan kadar protein. Pengendapaan dengan Amonium Sulfat (Scopes 1987) Sebanyak 20 ml ekstrak kasar β- galaktosidase diendapkan dengan amonium sulfat. Amonium sulfat yang ditambahkan secara bertahap dengan konsentrasi yaitu 10, 20, 30, 40, 50, 60, dan 70%, lalu diaduk dengan magnetic stirer secara perlahan selama 1 jam. Setelah itu, campuran disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama 15 menit dengan suhu 4ºC. Endapan enzim dipisahkan dan

16 6 dilarutkan dalam 1 ml bufer fosfat 0.05 M ph 6.5. Aktivitas yang tinggi menunjukan persentase kejenuhan amonium sulfat yang optimum. Jumlah amonium sulfat (gram) yang digunakan untuk melarutkan 1 liter larutan enzim menggunakan rumus dibawah ini dengan S1 merupakan konsentrasi awal amonium sulfat sedangkan S2 merupakan konsentrasi akhir amonium sulfat. Angka 533 menunjukan bahwa untuk membuat larutan jenuh 100% dibutuhkan 533 gram amonium sulfat per liter. Jumlah amonium sulfat (gram/liter) = 533 (S2 - S1) S2 Aktivitas spesifik yang tinggi menunjukan persentase kejenuhan amonium sulfat yang optimum dan selanjutnya digunakan dalam tahap pemurnian. Sebelum tahap pemurnian selanjutnya dilakukan dialisis dengan membran selofan. Enzim dimasukkan ke dalam membran selofan dan didialisis menggunakan bufer fosfat 0.01 ph 7 selama 24 jam. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Produksi Enzim β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae Produksi enzim β-galaktosidase dilakukan dengan menumbuhkan bakteri Enterobacter cloacae pada media laktosa, pepton, yeast (LPY) cair setelah sebelumnya dikulturkan dalam medium yang sama hingga mencapai OD=0.7 setara dengan jumlah koloni/sel (Liu et al. 2009). Pemanenan sel dilakukan dengan cara sentrifugasi dengan kecepatan rpm ( g) selama 15 menit pada suhu 4 C, untuk mencegah kerusakan enzim. Prinsip metode sentrifugasi ini, yaitu proses pemisahan ekstrak enzim yang didasarkan pada berat molekul dengan menggunakan gaya sentrifugal. Sentrifugasi dilakukan pada suhu rendah untuk mencegah terjadinya kerusakan enzim. Berdasarkan hal tersebut berat molekul yang ringan akan berada diatas dan yang berat berada dibawah (Koolman 2000). Sel kemudian dicuci sebanyak dua kali dengan menggunakan bufer fosfat 0.05 ph 6.5 agar terbebas dari pengotor yang berasal dari media. Selanjutnya, pemecahan sel dilakukan dengan metode sonikasi 50 khz selama 5 menit. Metode ini bertujuan untuk memecah dinding sel dengan frekuensi gelombang suara yang lebih besar. Sel dipecah didalam bufer fosfat 0.05 ph 6.5 pada suhu 4 C agar enzim tidak mengalami kerusakan. Menurut Liu et al (2009), enzim β- galaktosidase pada bakteri Enterobacter cloacae merupakan enzim intraseluler, sehingga memerlukan pemecahan dinding sel. Pemanenan sel dilakukan pada fase eksponensial, karena pembentukan enzim terdapat pada fase tersebut. Oleh karena itu, perlu dilakukan pengukuran pertumbuhan bakteri Enterobacter cloacae selama 30 jam melalui pengukuran optical density (OD) pada panjang gelombang 600 nm. Kurva pertumbuhan diawali dengan fase awal (lag) yang merupakan masa penyesuaian mikroba. Pada fase tersebut terjadi sintesis enzim oleh sel yang dipergunakan untuk metabolisme metabolit. Setelah fase awal itu selesai, baru mulai terjadi reproduksi selular. Konsentrasi selular meningkat perlahan-lahan hingga makin lama makin meningkat sampai pada suatu saat laju pertumbuhan atau reproduksi seluler mencapai titik maksimal dan terjadi pertumbuhan secara logaritmik atau eksponesial. Berdasarkan kurva pertumbuhan tersebut diperoleh bahwa Enterobacter cloacae menunjukan fase eksponensial setelah diinkubasi selama jam (Gambar 4). Selanjutnya, setelah substrat tertentu yang diperlukan untuk pertumbuhan bakteri dalam media biakan mendekati habis dan terjadi penumpukan produk-produk penghambat, maka terjadi penurunan laju pertumbuhan bakteri tersebut. Fase penurunan ditandai oleh berkurangnya jumlah sel hidup (viable) dalam media akibat terjadinya kematian (mortalitas) (Mangunwidjaja et al.1994). Berdasarkan aktivitas β-galaktosidase yang diperoleh, dibuatkan kurva aktivitas β-galaktosidase. Kurva aktivitas menunjukkan bahwa aktivitas β-galaktosidase tertinggi diperoleh pada jam ke-18 sebesar U/mL enzim (Gambar 4). Adapun kadar protein β-galaktosidase tertinggi juga diperoleh pada jam ke-18 sebesar mg/ml (Gambar 5). Hasil ini relatif lebih besar dibandingkan dengan aktivitas enzim β- galaktosidase dari Lactobacillus bulgaricus sebesar 0.088U/ml, sehingga prosfektif untuk produksi (Yuningtias 2008). Gambar 4 Kurva pertumbuhan ( ) dan aktivitas β-galaktosidase ( ) dari Enterobacter cloacae.

17 7 Gambar 5 Kadar protein β-galaktosidase Enterobacter cloacae. Hasil Optimasi Suhu β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae Aktivitas enzim akan semakin meningkat sejalan dengan kenaikan suhu sampai tingkat optimum, sesudahnya aktivitas enzim akan menurun, sehingga kehilangan sebagian aktivitasnya. Penentuan suhu terhadap aktivitas enzim β-galaktosidase diperlihatkan pada Gambar 6. Aktivitas enzim β-galaktosidase pada suhu C menunjukkan kenaikan secara bertahap. Suhu optimum β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae dicapai pada suhu 35 C dengan aktivitas enzimnya sebesar U/ml. Menurut Liu et al (2009), β- galaktosidase dari Enterobacter cloacae mencapai aktivitas tertinggi pada suhu 35 C. Peningkatan suhu pada batas optimum menyebabkan naiknya energi kinetik yang mempercepat gerak vibrasi, translasi, serta rotasi enzim dan substrat. Kondisi ini memperbesar peluang enzim dan substrat untuk bertumbukan. Semakin sering bertumbukan, maka reaksi pengikatan kompleks enzim substrat akan meningkat. Pada suhu setelah suhu optimum, akivitas enzim menurun. Hal ini dikarenakan enzim adalah molekul protein yang dapat terdenaturasi pada suhu tinggi. Peningkatan suhu hingga batas tertentu dapat menyebabkan semakin bertambahnya kerusakan enzim (Palmer 1991). Pada suhu yang lebih rendah dari suhu optimum, aktivitas enzim juga rendah, hal ini disebabkan karena rendahnya energi aktivasi yang tersedia. Energi tersebut dibutuhkan untuk menciptakan kondisi tingkat kompleks aktif, baik dari molekul enzim atau molekul substrat (Hames dan Hooper 2000). Pengaruh pemanasan juga dapat mempengaruhi aktivitas β-galaktosidase, seperti diperlihatkan oleh Gambar 7. Pemanasan selama 1 jam pada berbagai suhu ditunjukkan oleh suhu 35 C, dimana pada suhu tersebut aktivitas enzim mengalami peningkatan secara signifikan sebesar U/ml. Hasil penelitian Rhimi et al (2010) menyebutkan bahwa suhu optimum β- galaktosidase dari bakteri Streptococcus thermophillus sekitar 57 C. Hasil penelitian Chen et al (2008) memperlihatkan bahwa suhu optimum β-galaktosidase dari Basillus stearothermophilus sekitar 70 C dan Bacillus licheniformis sekitar 45 C (Phan Tran et al 1998). Yuningtias (2008) menyebutkan bahwa suhu optimum β-galaktosidase dari bakteri Lactobacillus bulgaricus aktif pada suhu 43 C dengan aktivitas enzim U/ml. Hal ini menunjukkan bahwa enzim β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae aktif pada suhu yang lebih rendah jika dibandingkan dengan bakteri lain penghasil enzim ini. Oleh karena itu, komsumsi energi yang diperlukan lebih rendah, sehingga menguntungkan untuk digunakan pada bioindustri. Gambar 6 Pengaruh suhu terhadap aktivitas β- galaktosidase dari Enterobacter cloacae. Gambar 7 Pengaruh pemanasan selama 1 jam pada berbagai suhu terhadap aktivitas β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae.

18 8 Hasil Optimasi ph β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae Enzim mempunyai gugus yang dapat terionisasi. Dengan demikian, perubahan ph dapat menyebabkan perubahan gugus tersebut yang dapat mengakibatkan perubahan struktur, komformasi, dan sisi aktif enzim (Chakraborti et al. 2000). Keasaman (ph) dapat mempengaruhi aktivitas enzim. Daya katalisis enzim menjadi rendah pada ph rendah maupun tinggi, karena terjadinya denaturasi protein enzim. Enzim mempunyai gugus aktif yang bermuatan positif (+) dan negatif (-). Aktivitas enzim akan optimum kalau terdapat keseimbangan antara kedua muatannya. Pada keadaan asam muatannya cenderung positif, dan pada keadaan basa muatannya cenderung negatif sehingga aktivitas enzimnya menjadi berkurang atau bahkan menjadi tidak aktif (Koolman 2000). Peningkatan ph sebelum titik optimum menyebabkan terus meningkatnya aktivitas enzim, sampai seluruh enzim berikatan dengan membentuk kompleks enzim-substrat. ph optimum untuk masing-masing enzim tidak selalu sama. Pengaruh ph terhadap aktivitas enzim β- galaktosidase diperlihatkan pada Gambar 8. Penggunaan tiga macam bufer (bufer asetat, bufer fosfat, dan bufer Tris-HCl) bertujuan untuk menyediakan lingkungan dengan kisaran ph cukup luas ( ), sehingga tidak perlu menggunakan pereaksi yang bersifat asam atau basa kuat untuk membuat kondisi reaksi pada kisaran ph tersebut. Pemilihan buffer yang sesuai sangat penting untuk menjaga protein pada ph yang diinginkan dan untuk memastikan hasil penelitian yang konstan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa mulai dari ph aktivitas enzim β-galaktosidase pada bakteri Enterobacter cloacae mengalami peningkatan. ph optimum β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae dicapai pada ph 7 dengan nilai aktivitas enzim sebesar U/ml. Pada kondisi ph tersebut sisi aktif enzim sudah seluruhnya berikatan dengan substrat membentuk kompleks enzim-substrat. Menurut Lehninger (2004), pada ph optimum, gugus penerima proton yang penting pada sisi aktif berada dalam tingkat ionisasi yang diinginkan. Peningkatan ph diatas batas optimum kerja enzim menyebabkan kerja enzim menurun, karena terjadi denaturasi enzim atau perubahan struktur tiga dimensi molekul enzim. Berdasarkan Gambar 9, memperlihatkan pengaruh pemanasan terhadap aktivitas β- galaktosidase dimana pada ph 7 aktivitas enzim mengalami peningkatan sebesar U/ml. Sebagai perbandingan, ph optimum aktivitas enzim β-galaktosidase dari Leuconostoc sekitar ph 7.2 (Huang et al 1993). Hasil penelitian Rhimi et al (2009) menyebutkan bahwa β-galaktosidase yang diisolasi dari Lactobacillus bulgaricus memiliki kisaran ph optimum ph optimum enzim β-galaktosidase yang diisolasi dari Streptococcus thermophilus sekitar ph (Rhimi et al 2010). Gambar 8 Pengaruh ph terhadap aktivitas β- galaktosidase dari Enterobacter cloacae. Gambar 9 Pengaruh pemanasan selama 1 jam pada berbagai ph terhadap aktivitas β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae. Aktivitas Enzim β-galaktosidase Terhadap Penambahan Ion Logam Ion logam diperlukan sebagai aktivator untuk meningkatkan aktivitas pada enzimenzim tertentu. Namun, ion logam tersebut dapat pula sebagai penghambat (inhibitor) pada konsentrasi yang berbeda. Ion logam diperlukan oleh enzim sebagai komponen pada sisi aktifnya. Logam berat mempunyai kemampuan untuk berikatan dengan enzim dengan menggantikan fungsi ion logam dari gugus enzim (Murray et al. 2003). Pengaruh ion logam terhadap aktivitas enzim β-galaktosidase diperlihatkan pada Gambar 8. Ion Mn 2+ dan

19 9 dapat meningkatkan aktivitas enzim (U/ml) pada ion Mn 2+ dan Mg 2+ masing-masing sebesar U/ml dan U/ml dibandingkan dengan aktivitas enzim kontrol. Hal tersebut menunjukkan bahwa ion Mn 2+ dan ion Mg 2+ dapat meningkatkan aktivitas enzim β-galaktosidase dari bakteri Enterobacter cloacae (aktivator enzim). Ion Hg 2+ dan Cu 2+ memiliki kemampuan tertinggi sebagai inhibitor, dimana aktivitas enzim pada ion Hg + dan Cu 2+ mengalami penurunan masing-masing sebesar U/ml dan U/ml dibandingkan aktivitas enzim kontrol. Hal tersebut menunjukkan bahwa ion Hg + dan Cu 2+ dapat menurunkan aktivitas enzim β- galaktosidase secara drastis. Ion-ion Ca 2+, Zn 2+, dan Co 2+ juga mengalami penurunan aktivitas enzim masing-masing sebesar U/ml, U/ml, dan U/ml. Hal tersebut menunjukkan bahwa ion Ca 2+, Zn 2+, dan Co 2+ hanya menghambat sebagian aktivitas enzim β-galaktosidase (inhibitor parsial). Hasil penelitian Liu et al (2009) menyebutkan bahwa β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae dihambat secara signifikan oleh ion Hg + dan ion Cu 2+ pada konsentrasi 0.01 mm. Ion-ion logam yang dapat meningkatkan aktivitas enzim β- galaktosidase dari Enterobacter cloacae (aktivator) adalah ion Mg 2+ dan Mn 2+. Hasil penelitian Chen et al (2008) menyebutkan bahwa β-galaktosidase dari Bacillus stearothermophilus dihambat secara signifikan oleh ion Fe 2+, Zn 2+, Cu 2+, Pb 2+, dan Sn 2+. Mg 2+ menolak protein yang bermuatan sama. Kelarutan protein (ph dan temperatur tertentu) meningkat pada kenaikan konsentrasi garam (salting in). Kenaikan kelarutan protein akan meningkatkan kekuatan ion larutan. Pada penambahan garam dengan konsentrasi tertentu kelarutan protein menurun (salting out). Molekul air yang berikatan dengan ion-ion garam semakin banyak yang menyebabkan penarikan selubung air yang mengelilingi permukaan protein sehingga mengakibatkan protein saling berinteraksi, beragregasi, dan kemudian mengendap (Harris 1989). Aktivitas spesifik adalah satu unit enzim permiligram protein (Wirahadikusumah 1989). Adapun nilai aktivitas spesifik tersebut dapat digunakan sebagai ukuran besarnya kemurnian enzim hasil isolasi (Lehninger 2004). Hasil pengendapan amonium sulfat terhadap aktivitas spesifik β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae ditunjukkan pada Gambar 9, pengendapan dengan amonium sulfat fraksi 50% mampu meningkatkan aktivitas spesifik enzim β-galaktosidase sebesar U/mg, jika dibandingkan dengan pengendapan ammonium sulfat pada fraksi lainnya. Pada prinsipnya, penambahan amonium sulfat sampai jenuh bertujuan untuk mengendapkan protein yang terdapat dalam larutan ekstrak kasar enzim. Enzim adalah protein, maka setelah pengendapan, konsentrasi β- galaktosidase dalam campuran akan meningkat. Dengan konsentrasi yang lebih besar, aktivitas enzim terhadap substrat yang sama juga akan meningkat. Hasil penelitian Chen et al (2008) menyebutkan bahwa pengendapan dengan amonium sulfat pada fraksi 65% mampu meningkatkan aktivitas spesifik β-galaktosidase dari Bacillus stearothermophilus sebesar 80.3 U/mg. Hasil penelitian Shaikh et al (1999) menyebutkan bahwa terjadi peningkatan aktivitas spesifik β-galaktosidase dari Rhizomucor sp pada pengendapan amonium sufat 90% sebesar 10.5 U/mg. Gambar 8 Aktivitas enzim β-galaktosidase pada penambahan ion logam. Aktivitas Spesifik β-galaktosidase Hasil Pengendapan Amonium Sulfat Pengendapan protein dengan amonium sulfat adalah metode yang sering digunakan karena memiliki daya larut tinggi di dalam air, dan relatif murah. Pemilihan amonium sulfat didasarkan pada kelarutan protein yang berinteraksi polar dengan molekul air, interaksi ionik protein dengan garam dan daya tolak Gambar 9 Aktivitas spesifik β-galaktosidase pada pengendapan ammonium sulfat berbagai konsentrasi.

20 10 Hasil Tahapan Pemurnian Enzim β-galaktosidase Fraksi-fraksi hasil pemekatan garam ammonium sulfat, kemudian didialisis untuk menghilangkan garam ammonium sulfat dan molekul kecil berberat molekul rendah. Pada tahap dialisis, garam yang berlebih di dalam sampel dapat dihilangkan dengan cara menempatkan sampel di dalam kantung (membran) dialisis semipermeabel yang direndam di dalam larutan buffer. Molekul yang berukuran kecil akan keluar melalui membran, sedangkan molekul yang besar akan tertahan di dalam membran dialisis (Harris 1989). Keberhasilan suatu tahap pemurnian, ditandai dengan semakin meningkatnya aktivitas spesifik enzim setelah mengalami pemurnian. Hasil tahapan pemurnian diperlihatkan pada Tabel 1, dimana aktivitas spesifik dan tingkat kemurnian pada pengendapan amonium sulfat 50% dan dialisis menunjukkan peningkatan sebesar U/mg dan U/mg dibandingkan ekstrak kasar. Hal ini menunjukkan bahwa semakin murni suatu enzim, sehingga dapat dijadikan ukuran besarnya kemurnian enzim hasil isolasi (Lehninger 2004). Hasil tersebut relatif besar dibandingkan tingkat kemurnian enzim β- galaktosidase dari Rhizomucor sp sebesar 3.18 kali (Shaikh et al.1999). Rendemen (%) merupakan hasil pembagian total aktivitas tahapan purifikasi dengan total aktivitas ekstrak kasar dikalikan 100%, pada pengendapan amonium sulfat 50% dan dialisis menunjukkan penurunan sebesar 87.21% dan 68.42% dibandingkan ekstrak kasar. Hal ini dikarenakan adanya protein yang hilang pada tiap tahapan pemurnian, dimana senyawasenyawa pengotor dan protein-protein lain sudah terpisahkan (Harris 1989). Tabel 1 Tahapan pemurnian enzim β-galaktosidase. Tahap Ekstrak kasar ammonium sulfat 50% Dialisis Volume enzim (ml) total protein (mg) Nilai K M dan V maks Enzim β-galaktosidase Penentuan nilai K M dan V maks berguna untuk menganalisis afinitas enzim dengan substrat spesifiknya, menentukan kecepatan reaksi enzim pada suatu tertentu. Persamaan garis pada kurva Lineweaver-Burk ekstrak kasar dan dialisis dibuat dengan menurunkan persamaan Michealis-Menten yang diperoleh dari hasil penentuan kinetika enzim (Gambar 10). Data pada Lampiran 17 dan 18. Penentuan K M dan V maks secara lebih tepat dan mudah dilakukan pemetaan data dengan memanfaatkan transformasi aljabar persamaan Lineweaver-Burk (Gambar 11). Persamaan Lineweaver-Burk untuk ekstrak kasar enzim β- galaktosidase adalah y = 0.034x dengan nilai r 2 sebesar sehingga V maks aktivitas β- galaktosidase sebesar mol/menit, dan nilai K M sebesar mm (Tabel 2). Pada dialisis, peningkatan konsentrasi substrat juga meningkatkan kecepatan reaksi. Persamaan Lineweaver-Burk untuk dialisis adalah y = 0.113x dengan nilai r 2 sebesar sehingga kecepatan maksimum aktivitas β- Total Aktivitas (U) Aktivitas spesifik (U/mg) Kemurnian Rendemen (%) galaktosidase sebesar µmol/menit dan nilai K M sebesar mm. Semakin rendah nilai K M maka semakin kuat ikatan antara enzim dan substrat. Dengan mengetahui nilai K M dan V maks maka kecepatan reaksi suatu enzim pada setiap konsentrasi dapat dihitung. Selain itu, dengan mengetahui nilai K M dapat mengetahui enzim tersebut berikatan kuat dengan substrat atau ikatannya lemah, yang berarti dapat diketahui kesesuaian enzim dengan substrat yang diberikan (Winarno 1999). Berdasarkan nilai diatas K M enzim β- galaktosidase pada dialisis lebih kecil dibandingkan K M pada ektrak kasar, sehingga β-galaktosidase dialisis lebih kuat berikatan dengan substrat membentuk kompleks enzimsubstra jika dibandingkan pada ekstrak kasar. Hasil penelitian Yuningtias (2008) menyebutkan bahwa nilai V maks dan K M β- galaktosidase dari isolat bakteri asam laktat masing-masing adalah µmol/menit dan mm. Hasil penelitian Chen et al (2008) menyebutkan bahwa nilai V maks dan K M β- galaktosidase dari Bacillus stearothermophilus masing-masing adalah 6.62 µmol/menit dan 2.96 mm. Hasil penelitian Chandra (2009)

21 11 menyatakan bahwa β-galaktosidase dari Lactobacillus bulgaricus mempunyai parameter kinetik V maks µmol/menit dan K M mm. Tabel 2 Nilai V maks dan K M β-galaktosidase pada ekstrak kasar dan dialisis. Tahapan V maks (µmol/menit) K M (mm) Ekstrak kasar Dialisis Enterobacter cloacae pada suhu 35 C, ph 7. Aktivitas spesifik enzim β-galaktosidase pada ekstrak kasar, presipitasi 50%, dan dialisis masing-masing sebesar U/mg, U/mg, dan U/mg. Kation divalen Mn 2+ dan Mg 2+ berperan sebagai aktivator enzim β- galaktosidase. Ion Hg + dan Cu 2+ berperan sebagai inhibitor enzim β-galaktosidase. Enzim β-galaktosidase dari Enterobacter cloace pada ekstrak kasar mempunyai parameter kinetik V maks sebesar µmol/menit dan K M sebesar mm. Enzim β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae pada dialisis pada parameter kinetik V maks sebesar µmol/menit dan K M sebesar mm. Gambar 10 Kurva Michaelis-Menten ekstrak kasar ( ) enzim β-galaktosidase dan dialisis ( ) Gambar 11 Kurva Lineweaver-Burk ekstrak kasar ( ) enzim β-galaktosidase dan dialisis ( ). SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Enzim β-galaktosidase dari bakteri Enterobacter cloacae mempunyai waktu produksi optimum pada 18 jam. Kondisi optimum enzim β-galaktosidase dari bakteri Saran Bakteri Enterobacter cloacae perlu dilakukan pemurnian enzim selanjutnya misalnya dengan kromatografi filtrasi gel dan elektroforesis. Selain itu, perlu dilakukan amobilisasi enzim β-galaktosidase dari Enterobacter cloacae agar enzim dapat digunakan berulang-ulang dan mereduksi biaya. Perlu juga dilakukan penelitian lanjut mengenai aplikasi β-galaktosidase terhadap berbagai produk pangan yang mengandung laktosa, misalnya produk susu. DAFTAR PUSTAKA Belitz HD, Grosch W Food Chemistry. Germany: Springer Verlag. Bergmaier D, Champagne CP, Lacroix C Growth and Exopolysaccharide Production During Free and Immobilized Cell Chemostat Culture of Lactobacillus rhamnosus RW-9595M. J Appl Microbiol 98: Boyer R Modern Experimental Biochemistry. San Fransisco: Adison Wesley Longman Inc. Boyer R Concepts in Biochemistry. United States: Brook Cole. Bradford M.M A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: Buchanan RE, Gibbons Bergey s Manual of Determinative Bacteriology. Baltimore: Woverly. Buckle KA, Edwards RA, Fleet GH, Wootton M Ilmu Pangan. Purnomo H,