IDENTIFIKASI STRUKTUR SENYAWA BIOAKTIF DARI AKAR KUNING (Fibraurea chloroleuca Miers.) (#03-SBK-029) KOLEKSI DARI HUTAN KALIMANTAN TENGAH

Transkripsi

1 IDENTIFIKASI STRUKTUR SENYAWA BIOAKTIF DARI AKAR KUNING (Fibraurea chloroleuca Miers.) (#03-SBK-029) KOLEKSI DARI HUTAN KALIMANTAN TENGAH STRUCTURE IDENTIFICATION OF BIOACTIVE COMPOUND ISOLATED FROM AKAR KUNING (Fibraurea chloroleuca Miers.) (#03-SBK-029) COLLECTED FROM CENTRAL KALIMANTAN FOREST Subagus Wahyuono 1), Jusain Setiadi 1), Djoko Santosa 1), Mae Sri Hartati W. 2), Soekotjo 3), Siti Muslimah W. 3), Widyati Prihatiningtias 1) 1) Fakultas Farmasi, 2) Fakultas Kedokteran, 3) Fakultas Kehutanan Universitas Gadjah Mada, YOGYAKARTA ABSTRAK Akar kuning (F. chloroleuca) telah dimanfaatkan secara tradisional oleh masyarakat Indonesia untuk mengatasi berbagai macam penyakit. Isolasi senyawa aktif dengan metoda Bioassay Guided Isolation telah dilaporkan. Senyawa bioaktif yang diperoleh (F-1) (500 µg/ml) mampu menghambat 20% pertumbuhan kanker in vitro (sel HeLa), namun struktur F-1 ini belum diidentifikasi. Oleh karena itu, perlu diltentukan struktur senyawa F-1. Elusidasi struktur F-1 dilakukan secara spektrometri (UV, IR, MS, NMR) dan dibandingkan dengan data yang telah dilaporkan. Berdasarkan atas data-data tersebut diatas, F-1 diidentifikasi sebagai 8-oksoprotoberberine Kata Kunci: Senyawa Bioaktif, Fibraurea chloroleuca, 8-Oksoprotoberberine ABSTRACT Akar kuning (F. chloroleuca) have been utilized traditionally by Indonesian people to treat various diseases. Isolation of bioactive compound (F-1) by Bioassay Guided Isolation has been reported, and this bioactive compound (F-1) (500 µg/ml) inhibited 20% cancer cells (HeLa Cells) proliferation in vitro. Now we report structure elucidation of F-1 by spectroscopic method (UV, IR, MS, NMR) and comparison with literatures. Based on those above data, F-1 is identified as 8-oxoprotoberberine Key words: Bioactive compound, Fibraurea chloroleuca, 8-oxoprotoberberine

2 PENDAHULUAN Isolasi senyawa bioaktif dari akar kuning (F.chloroleuca) koleksi hutan Kalimantan tengah (#03-SBK-029) telah dilakukan dengan metoda Bioassay Guided Isolation dan diperoleh senyawa tunggal (F-1) dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) (Wahyuono dkk., 2006). Senyawa F-1 (500 µg/ml) menghambat 20,08% pertumbuhan sel HeLa in vitro. Aktivitas penghambatan pertumbuhan sel ini relatif kecil pada dosis cukup besar ini, kemungkinan disebabkan karena F-1 tidak sensitif terhadap sel HeLa namun lebih sensitif terhadap sel kanker lain. Identitas suatu senyawa sangat penting dalam menentukan arah dan potensi aktivitas suatu senyawa, oleh karena itu struktur senyawa F-1 perlu ditentukan. Pada publikasi ini dilaporkan penentuan struktur F- 1 secara spektroskopi yaitu spektroskopi ultraviolet (UV) untuk melihat apakah F-1 mempunyai suatu kromofor, spektroskopi inframerah (IR) untuk melihat adanya gugus fungsional dan spektroskopi massa (MS) untuk mendapatkan informasi bobot molekul F-1. Struktur absolut F-1 dilakukan dengan spektroskopi Nuklir Magnetik Resonans (NMR) baik 13 C- maupun 1 H- NMR. METODOLOGI PENELITIAN B a h a n : Senyawa F-1 (mp. 182,4-183,0 0 C) hasil isolasi dari akar kuning (F. chloroleuca, #03-SBK-029) (Wahyuono dkk., 2006). A l a t : Spektrofotometer UV-vis (Milton Roy Spectronic 3000), IR (Shimadzu FTIR- 8201PC) dan MS (Shimadzu QP-500), NMR (Bruker DPX-600, 600 MHz). Cara Kerja : Spektrum UV diperoleh terhadap senyawa F-1 (2.1 mg) dilarutkan dalam CHCl 3 (4,0 ml); Spektrum IR diperoleh dengan pellet KBR. Spektrum Massa (MS) diperoleh melalui GC-NS, F-1 dilarutkan dalam CHCl 3. Spekra 13 C- dan 1 H-NMR F-1 diperoleh dari Bruker DPX-600 (University of Leiden, Leiden, the Netherlands). HASIL DAN PEMBAHASAN Senyawa F-1 mempunyai jarak lebur yang tajam pada 182,4-183,0 0 C, mempunyai panjang gelombang (λ) maksimal (CHCl 3 ) pada 345 (0,514); 241 (0,637); 210 (0,312) yang menginformasikan bahwa F-1 mempunyai kromofor (Gambar 1). Pada λ 345 nm mengindikasikan ikatan rangkap terkonjugasi panjang, mungkin juga merupakan suatu aromatik. Senyawa F-1 memberi reaksi positif dengan penampak bercak spesifik (Dragendorff) pada KLT yang mengindikasikan bahwa F-1 merupakan senyawa alkaloida (Wahyuono dkk., 2006). Gambar 1. Spektrum ultraviolet (UV)(CHCl 3 ) dari senyawa F-1

3 Gambar 2. Spektrum IR (KBr) dari senyawa F-1 m/z 351 [M +. ] Gambar 3. Spektrum massa resolusi rendah senyawa F-1 Spektrum inframerah (IR) (KBr) (Gambar 2) senyawa F-1 menunjukkan adanya vibrasi ulur (3433 cm -1 ) yang menunjukkan adanya gugus OH atau NH pada senyawa F-1. Vibrasi ulur dari suatu metin tidak jenuh (=CH) nampak pada 3010 cm -1 dan metilen CH 2, metin jenuh (-CH) pada cm -1 ( Silverstein dkk., 1981). Pita serapan C=O nampak pada 1645 cm -1 memberi indikasi bahwa C=O tersebut sebagai C=O terikat oleh suatu atom N- terikat sebagai gugus amida (-N-C=O). Keberadaan gugus aromatik seperti yang nampak pada data spektrum UV, dipertegas dengan adanya serapan pada dan cm -1 merupakan serapan ulur dari C=C- aromatik. Oleh karena itu, F-1 dapat dipastikan sebagai suatu senyawa aromatik, alkaloid yang mempunyai ikatan amida. Data GC-MS (Gas Chromatography Mass Spectrometry) menunjukkan bahwa senyawa F-1 merupakan senyawa murni dengan tingkat kemurnian 100% (GC) dengan waktu retensi (Rt.) 5,19 menit dan mempunyai puncak molekul ion pada m/z 351 (Gambar 3). Puncak ion molekul [M] +. ganjil (m/z 351) menginformasikan bahwa dalam struktur F-1 terdapat atom nitrogen (-N-) dalam hitungan ganjil (1, 3, 5, 7 dst.), pengertian ini dikenal dengan istilah Nitrogen Rules (Silverstein dan Websters, 1998). Perkiraan identitas sebagai alkaloid ini konsisten dengan hasil visualisasi F-1 pada kromatografi lapis tipis dengan penampak spesifik alkaloid Dragendorff memberi warna merah oranye (Wahyuono dkk., 2006).

4 Tabel 1. Pergeseran kimia karbon dan proton 8-oksorpotoberberin (F-1) berdasarkan atas data 1 H- dan 12 C-NMR (600 MHz, CDCl 3 ) No. C Pergeseran kimia δ (ppm) No. -H Pergeseran kimia δ (ppm), J (Hz) 1 105,6 1 6,75 (s) 2 133, , ,9 4 6,76 (s) 5 29,7 5 2,94 (t, 6,5) 6 40,3 6 4,34 (t, 6,0) , , , ,2 11 7,37 (d, 6,8) ,9 12 7, 32 (dd, 8,5 dan 4,5) ,2 13 7,26 (s) , , , , , O-CH 2 -O- 102,4 -O-CH 2 -O- 6,05 (s) -OCH 3 62,6 -OCH 3 4,06 -OCH 3 57,8 -OCH 3 3,99

5 -OCH 2 O- -N-CH 2 - -CH 2 -C=O -Ar-H -OCH 3 Gambar 4. Spektrum 13 C-NMR (600 MHz, CDCl 3 ) F-1 dengan teknik APT. -OCH 3 -O-CH 2 -O- -N-CH 2 -CH 2 - Gambar 5. Spektrum 1 H-NMR (600 MHz, CDCl 3 ) F-1 Spektrum 13 C-NMR (600 Mhz, CDCl 3 ) dari F- 1 menginformasikan adanya 20 atom karbon, dan berdasarkan atas data 13 C-NMR dengan teknik APT (Attached Proton Test) (Gambar 4) diketahui bahwa dalam F-1 terdapat 10 atom -C sebagai C-kuaterner aromatik (δ, 161,06; 152,38; 150,51; 149,40; 148,31; 136,60; 133,32; 131,00; 124,72; 120,36 ppm), 5 =CH aromatik (δ, 123,23; 119,98; 108,88; 105,65; 102,25 ppm), 1 -CH 2 dioksida (δ, 102,38 ppm), 2 metoksi (δ, 62,57; 57,84 ppm), dan 2 CH 2 (δ, 40,32 dan 29,68 ppm) yang salah satunya terikat oleh suatu elektronegatif atom (δ, 40,32 ppm) (Friebolin, 2005). Spektrum 1 H-NMR (600 MHz, CDCl 3 ) (Gambar 5) F-1 nampak sangat sederhana, berdasarkan atas perhitungan rasio integrasinya diketahui bahwa jumlah proton pada F-1 adalah 17 proton. Berdasarkan atas data 13 C-NMR dan spektrum massa tersebut diatas, elemen penyusun senyawa F-1 dapat ditentukan sebagai C 20 H 17 O 5 N. Berdasarkan atas data diatas dan literatur, identifikasi F-1 mengarah pada alkaloida protoberberine atau tetrahidroberberine dan letak gugus C=O berdampingan dengan atom Nmembentuk ikatan amida (Gambar 6). Spektrum 1 H-NMR F-1 menunjukkan adanya signal pada δ, 2,94 pp (t, J= 6.5 Hz, 2H) yang coupled dengan signal pada δ, 4,34 ppm (t, J=6.0 Hz, 2H) menurut data 2D-NMR (COSY, Corelation spectroscopy) (Gambar 7). Hal ini menjelaskan bahwa kedua gugus CH 2 berdampingan dan saling coupled (First order), dan pergeseran kimia yang down field gugus CH 2 (δ, 4.34 ppm) sebagai CH 2 -N-C=O. Sedangkan gugus CH 2 yang up filed (δ, 2,94 ppm) adalah

6 CH 2 pada posisi β dari atom N-. Signal singlet terintegrasi sebagai 2 proton pada δ, 6,05 ppm merupakan gugus CH 2 - dioksida (Wahyono, 2005; Friebolin, 2005) yang tidak ter-coupled oleh proton lain dari molekul. Posisi metilenedioksida (-O-CH 2 -O-) terbukti terletak pada ring-a dari pada ring-d, karena proton metilena tidak ter-coupled oleh proton lain (H-1 dan H-4) pada 2D-NMR dengan teknik NOESY (Nuclear overhauser effects spectroscopy). Demikian pula dengan posisi dua OCH 3 group, kedua gugus ini terletak pada ring-d yaitu pada C-9 dan C-10. Hal ini nampak pada 2D-NMR NOESY terjadi longrange coupling antara OCH 3 (C-10) dengan H-11, selain itu nampak adanya first order coupling antara H-11 dan H-12 (dublet, J= 7,0 Hz, ortho) yang menginformasikan lebih jauh bahwa posisi kedua gugus OCH 3. Gugus OCH 3 (C-9) lebih dowbfield dibandingkan dengan OCH 3 (C-10) karena pengaruh gugus C=O yang electron withdrawing memungkinkan OCH 3 (C-9) sedikit lebih dowbfield. Identifikasi dan hubungan antara carbon dan proton terkait dapat disusun seperti pada tabel 1 berdasarkan atas data 2D-NMR dengan teknik Het-Cor (Heteronuclear correlation) (Gambar 8). O O N 8 O OCH OCH 3 Gambar 6. Struktur senyawa F-1 (8-Oxoprotoberberine) -CH 2 -N- - CH 2 -CH 2 -N- Gambar 7. Spektrum 2D-NMR (600 MHz, CDCl 3 ) COSY dari F-1

7 -CH 2 (C-6) -CH 2 -N (C-5) (2-OCH 3 ) -O-CH 2 -O- (=C-H) Gambar 8. Spektrum 2D-NMR (600 MHz, CDCl 3 ) F-1 dengan teknik Het-Cor Senyawa F-1 diidentifikasi berdasarkan atas data spektroskopi dan dibandingkan dengan data spektroskopi dari literatur (Suau dkk., 2000) sebagai 8-oxoprotoberberine. Senyawa ini dilaporkan mempunyai kemampuan menginterkalasi DNA (Liu dkk., 2002). KESIMPULAN Berdasarkan atas data spektroskopi (UV, IR, MS, NMR) dan perbandingan dengan data dari literatur, struktur kimiawi senyawa bioaktif (F-1) dari akar kuning (F. chloroleuca) diidentifikasi sebagai 8-oxoprotoberberine UCAPAN TERIMA KASIH Ucapan terima kasih disampaikan kepada Menteri Kehutanan RI melalui Dir Jen PHKA atas dana penelitian yang diberikan, Dinas Kehutanan (PHKA) DIY yang telah membantu pelaksanaan eksplorasi dan PT Sari Bumi Kusuma, Kalimantan Barat atas semua fasilitas yang telah diberikan. DAFTAR PUSTAKA Friebolin, H., Basic One- and Two- Dimensional NMR Spectroscopy, 4 th completely Revised and Updated Edition, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KgaA, Weinheim Liu, L., Warrener, R. N., Russel, R. A., Synthesis of B-Ring Aromatised Protoberberine-8-one species as Potential DNA intercalation units. Electronic Conference on Heterocyclic Chemistry, June 29 - July 24. Silverstein, R. M., Bassler, G. C., and Morrill, T. C., Spectrometric Identification of Organic Compounds, 4 th ed., John Wiley & Sons, New York Silverstein, R. M., and Websters, F. X., Spectrometric Identification of Organic Compounds, 6 th ed., John Wiley & Sons, Inc., New York Suau, R., Lopez-Romero, J. M., Ruiz, A., Rico, R., Synthesis of Homoprotoberberines and 8-Oxoprotoberberines by Sequential Bicyclization of Phenylacetamides. Tetrahedron, vol. 56, pp Wahyono, Isolation and Structure Elucidation of Tracheospasmolytic Compounds from Piper cubeba L. F. Fruits and their possibility as antiinflammatory activity. Ph.D. dissertation, Fakultas Pasca Sardjana, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta Wahyuono, S., Setiadi, J., Santosa, Dj., Wahyuningsih, M. S. H., Soekotjo, Widyastuti, S. M., Potensi Senyawa Bioaktif dari Akar Kuning

8 (Fibraurea chloroleuca Miers.) Koleksi dari hutan Kalimantan tengah sebagai Antikanker. Majalah Obat Tradisional, vol. 11 (36), April-Juni, 22-8