BAB 3 METODE PENELITIAN

Transkripsi

1 BAB 3 METODE PENELITIAN 3.1 Alat-alat 1. Alat Destilasi 2. Batang Pengaduk 3. Beaker Glass Pyrex 4. Botol Vial 5. Chamber 6. Corong Kaca 7. Corong Pisah 500 ml Pyrex 8. Ekstraktor 5000 ml Schoot/ Duran Gelas Ukur Gelas Erlenmeyer Kolom Kromatografi Pyrex Pyrex Pyrex 12. Labu Rotarievaporator 1000 ml Schoot/ Duran 13. Labu Takar 250 ml Pyrex Lampu UV Neraca Analitis 254 nm/356 nm UVGL 58 Mettler AE Penangas air 17. Pipa Kapiler 18. Pipet Tetes 19. Rotarievaporator Buchi R Spatula 21. Spektrofotometer FT-IR 2Shimadzu 22. Spektofotometer 1 H-NMR Jeol/Delta2NMR 23. Spektrofotometer UV-VIS 24. Statif dan Klem 25. Tabung Reaksi Pyrex

2 3.2 Bahan-bahan 1. Daun Situlan 2. Metanol Destilasi 3. Etil asetat Teknis 4. Aquadest 5. N-heksana Teknis 6. Silika gel 40 ( mesh) ASTM E.Merck. KgA 7. FeCl 3 5% 8. NaOH 10% 9. Serbuk Mg 10. HCl (p) 11. H 2 SO 4(p) 12. Kapas 13. Kloroform p.a. E. Merck 14. Plat KLT silika gel 60 F Kloroform p.a. E. Merck 3.3 Prosedur Penelitian Penyediaan Sampel Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan Situlan yang diperoleh dari daerah Tarutung, kabupaten Tapanuli Utara, kecamatan Tarutung, Sumatera Utara. Daun tumbuhan Situlan dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun tumbuhan Situlan sebanyak 2000 g Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Situlan Serbuk daun tumbuhan Situlan diidentifikasi dengan menggunakan cara Skrining Fitokimia.

3 Untuk membuktikan adanya senyawa flavonoida yang terdapat dalam daun tumbuhan Situlan maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi warna sebagai berikut: 1. Dimasukkan 10 gram serbuk daun tumbuhan Situlan yang telah dikeringkan ke dalam dua gelas Erlenmeyer 2. Ditambahkan 100 ml metanol ke dalam gelas Erlenmeyer I dan 100 ml etil asetat ke dalam gelas Erlenmeyer II 3. Didiamkan selama 1 malam 4. Disaring 5. Dibagi masing-masing ekstrak sampel ke dalam 4 tabung reaksi 6. Ditambahkan masing-masing pereaksi a. Tabung I :dengan FeCl 3 5% menghasilkan larutan berwarna hitam b. Tabung II :dengan serbuk Mg, dan HCl (p) menghasilkan larutan merah muda c. Tabung III :dengan NaOH 10% menghasilkan larutan hijau kekuningan d. Tabung IV :dengan H 2 SO 4(p) menghasilkan larutan orange kekuningan Ekstraksi Daun Tumbuhan Situlan Serbuk daun tumbuhan Situlan ditimbang sebanyak 2000 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 10 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama 24 jam. Maserasi ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut metanol menguap. Lalu dilakukan pemisahan lemak dengan cara melarutkan fraksi pekat metanol dengan menggunakan aquadest, hingga negatif FeCl 3, dan disaring. Lalu filtrat aquadest dipartisi berulang-ulang dengan menggunakan etil asetat untuk memisahkan tanin, hingga lapisan aquadest negatif FeCl 3. lapisan etil asetat dipisahkan dari lapisan aquadest. Fraksi etil asetat kemudian di rotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap.

4 Lalu fraksi pekat etil asetat dilarutkan dengan metanol dan di ekstraksi partisi berulang-ulang dengan n-heksana sampai lapisan n-heksana hampir bening. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan kembali sehingga diperoleh ektrak pekat lapisan metanol Analisis Kromatografi Lapis Tipis Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak metanol dengan menggunakan fase diam silika gel 60F 254 Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari sistem dan perbandingan pelarut yang sesuai untuk kromatografi kolom. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran pelarut kloroform: metanol dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 (v/v). Dimasukkan 10 ml campuran larutan fase gerak kloroform: metanol 90:10 (v/v) ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Di totolkan ekstrak pekat metanol pada plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi campuran pelarut yang telah dijenuhkan, lalu di tutup dan di elusi. Plat yang telah di elusi, di keluarkan dari bejana, lalu di keringkan. Di amati noda yang terbentuk dibawah sinar UV, kemudian difiksasi dengan pereaksi FeCl 3 5%. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut kloroform: metanol dengan perbandingan 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 (v/v) Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat metanol yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 ( mesh) ASTM dan fasa gerak yaitu kloroform 100%, campuran pelarut kloroform: metanol dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 (v/v). Dirangkai alat kromatografi kolom.

5 Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 ( mesh) ASTM dengan menggunakan kloroform, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan kloroform 100% hingga silika gel padat dan homogen. Dibuburkan 4,0 g ekstrak pekat metanol dengan silika gel dengan pelarut metanol, kemudian dimasukkan ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak kloroform: metanol 90:10 (v/v) secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak kloroform: metanol dengan perbandingan 80:20 (v/v), 70:30 (v/v), dan 60:40 (v/v). Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap ± 10 ml, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl 3 5%. Kemudian diuapkan sampai terbentuk pasta Pemurnian Pasta yang diperoleh dari isolasi dengan kromatografi kolom dilarutkan kembali dengan kloroform lalu dianalisis KLT untuk mengetahui apakah senyawa yang diperoleh sudah murni atau belum. Kemudian dilakukan kembali kromatografi kolom dengan fase gerak Kloroform : etil asetat 50:50 (v/v). Hasil isolasi direkristalisasi dengan menggunakan etil asetat dan n-heksana hingga diperoleh senyawa murni yang dibuktikan dengan noda yang tunggal pada uji KLT Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis (KLT) Uji kemurnian pasta dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F 254 dengan fasa gerak kloroform: etil asetat 50:50 (v/v), dan kloroform:metanol 70:30 (v/v). Dimasukkan 10 ml larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi lapis tipis, lalu dijenuhkan. Ditotolkan pasta yang sebelumnya dilarutkan dengan

6 metanol pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi lapis tipis yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, diamati di bawah sinar UV, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl 3 5% dalam metanol menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoida Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi Analisis kemurnian senyawa hasil isolasi dilakukan uji dengan tiga jenis spektrofotometer yaitu spektrofotometer UV-Visible, spektrofotometer Inframerah (FT-IR), spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton ( 1 H- NMR) Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Pusat Peneltian LPPT UGM, Yogyakarta dengan menggunakan pelarut metanol dan diperoleh data yang dapat dilihat pada Gambar Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah (FT-IR) Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Pusat Peneltian LPPT UGM, Yogyakarta dengan menggunakan KBr dan diperoleh data yang dapat dilihat pada Gambar Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton ( 1 H-NMR) Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Pusat Peneltian LPPT UGM, Yogyakarta dengan menggunakan pelarut aseton dan diperoleh data yang dapat dilihat pada Gambar 4.3.

7 3.4 Bagan Uji Flavonoida Ekstraksi dengan pelarut metanol

8 3.4.2 Ekstraksi dengan pelarut etil asetat

9 3.5 Bagan Penelitian

10 BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Peneltian Berdasarkan hasil skrining fitokimia terhadap ekstrak metanol dan etil asetat dari daun tumbuhan situlan ( Macaranga dipterocarpifolia Merril) dengan adanya penambahan pereaksi-pereaksi warna, menunjukkan bahwa ekstrak metanol dan ekstrak etil asetat sampel positif flavonoida. Hasil elusi dari perbandingan pelarut kloroform: metanol 90:10 (v/v) pada fraksi 51-58, dipisahkan kembali pada alat kolom dengan eluen kloroform: etil asetat 50:50 (v/v) dan direkristalisasi dengan etil asetat dan n-heksan umtuk mendapatkan senyawa murni. Sehingga diperoleh senyawa murni berupa pasta berwarna kuning orange, seberat 21 mg, dan nilai Rf = 0,33 Spektrum UV-Visible senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut metanol ditunjukkan pada gambar 4.1 dibawah ini :

11 Gambar 4.1 Spektrum UV-Visible Senyawa Hasil Isolasi Tabel 4.1 Serapan panjang gelombang Ultraviolet-Visible (UV-Vis) senyawa hasil isolasi No Panjang Gelombang (nm) Absorbansi ,000 1, ,000 2,869 Hasil analisis spektrofotometer FT-IR dari senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pellet KBr dapat dilihat pada gambar 4.2. sebagai berikut: Gambar 4.2. Spektrum Inframerah (FT-IR) senyawa hasil isolasi Dari analisis Spektrofotometer Inframerah (FT-IR) memberikan pita-pita serapan pada daerah bilangan gelombang (cm -1 ) seperti pada tabel 4.2.

12 Tabel 4.2 Interpretasi Spektrum FT-IR Senyawa Hasil Isolasi Bilangan Gelombang Intensitas Gugus Fungsi (cm -1 ) 3425,58 Sedang Vibrasi ulur OH 2931,80 Rendah Vibrasi ulur C-H Aromatis 1705,07 Sedang Vibrasi ulur C=O 1512, ,75 Sedang Vibrasi ulur C=C Aromatis 1203,58 Sedang Vibrasi ulur C-O-C Berikut adalah hasil analisis Spektrofotometri Resonansi Magnetik Inti Proton ( 1 H-NMR) senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut aseton-d6 dan TMS sebagai standar pada senyawa hasil isolasi: Gambar 4.3. Spektrum 1 H-NMR senyawa hasil isolasi

13 Hasil analisis Spektrofotmeter Resonansi Magnetik Inti Proton ( 1 H-NMR) senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut Aseton-d6 dan TMS sebagai standar yang memberikan signal-signal pergeseran kimia dengan penjelasan pada tabel 4.3. berikut: Tabel 4.3. Pergeseran Kimia 1 H-NMR Senyawa Hasil Isolasi Atom H δ H Senyawa Hasil Isolasi H-2 & H-6 7,707-7,691 (d) H-3 & H-5 7,113-7,097 (d) H dari OCH 3 3,836-3,809 (t)

14 4.2 Pembahasan Dari hasil isolasi senyawa flavonoida dari daun tumbuhan situlan (Macaranga dipterocarpifolia Merrill) mulai dari proses ekstraksi maserasi diperoleh ekstrak pekat sebanyak 376,17 g, kemudian dilarutkan dengan menggunakan aquadest untuk pemisahan lemak, lalu diekstraksi partisi menggunakan etil asetat untuk memisahkan senyawa yang diduga merupakan tanin dan diperoleh ekstrak pekat etil asetat sebanyak 28,34 g. Ekstrak pekat yang diperoleh dilarutkan dengan metanol kemudian diekstraksi partisi dengan menggunakan pelarut n-heksan hingga diperoleh ekstrak pekat metanol sebanyak 4 g.. Dianalisis kromatografi lapis tipis sebelum kromatografi kolom dan didpat perbandingan pelarut yang sesuai untuk mengisolasi senyawa flavonoida dari daun tumbuhan situlan adalah kloroform: metanol 90:10 v/v yang menunjukkan pemisahan yang lebih baik dari noda yang dihasilkan (Lampiran 3). Hasil analisis kromatografi lapis tipis terhadap eluat hasil kolom kromatografi dengan eluen kloroform: etil asetat 50:50 v/v yang menunjukkan masih terdapat beberapa noda pada fraksi yang digabungkan (Lampiran 4). Ditunjukkan bahwa noda yang dihasilkan pada plat kromatografi lapis tipis pada fraksi dengan pereaksi FeCl 3 5% yang paling baik maka dilakukan pemurnian hasil isolasi dengan kolom kromatografi kembali dengan eluen kloroform:etil asetat 50:50 v/v. Hasil analisa kromatografi lapis tipis terhadap eluat hasil kromatografi kolom yang kedua kali dengan eluen yang seragam kloroform:etil asetat 50:50 v/v yang menunjukkan masih terdapat beberapa noda yang dihasilkan pada plat kromatografi lapis tipis pada fraksi dengan pereaksi FeCl 3 5% dan merupakan sangat baik untuk dilanjutkan (Lampiran 5), maka dilakukan kembali pemurnian hasil isolasi dengan rekristalisasi menggunakan pelarut etil asetat dan n heksan, kemudian dikromatografi lapis tipis kembali untuk menentukan harga Rf hasil isolasi dengan dua eluen yang berbeda, yaitu kloroform: etil asetat 50:50 v/v diperoleh harga Rf= 0,33 dan kloroform metanol 70:30 v/v diperoleh harga Rf = 0,71.

15 Dari hasil interpretasi spektrum UV-Vis memberikan serapan pada pita II dengan panjang gelombang 358 nm dan pita I 260 nm yang menunjukkan panjang gelombang senyawa hasil isolasi berada pada rentang panjang gelombang senyawa flavonoida golongan flavonol dengan 3 OH bebas ( pita I sekitar nm dan pita II sekitar nm) (Lampiran 7). Hasil interpretasi Spekturm Inframerah (FT-IR) dan Spektrum Resonansi Magnetik Inti Proton ( 1 H-NMR) dalam standar TMS diperoleh: Pergeseran kimia pada daerah δ = 7,707-7,691 ppm puncak doblet menunjukkan dua proton dari H- 2 dan H-6 sedangkan pada daerah δ = 7,113-7,097 ppm puncak doblet yang lebih rendah menunjukkan adanya dua proton dari H-3 dan H-5 pada cincin B senyawa flavonoida yang sesuai dengan peak spektrum pembanding pada lampiran 11. Hal ini juga didukung oleh spektrum Inframerah pada daerah bilangan gelombang 1442, ,49 cm -1 dengan puncak sedang menandakan adanya vibrasi ulur ikatan rangkap C=C pada sistem aromatis dan pada bilangan gelombang 2931,80 cm -1 dengan puncak rendah menunjukkan adanya vibrasi ulur C-H pada sistem aromatis. Pergeseran kimia pada daerah δ = 3,836-3,809 ppm dengan puncak triplet menunjukkan adanya proton dari gugus metoksi H-6, H-7 dan H-8 pada cincin A senyawa flavonoida. Hal ini didukung oleh peak spektrum standar pembanding pada lampiran 12, dimana gugus metoksi terdapat pada daerah δ = 3,5-4,0 ppm dengan puncak triplet. Berdasarkan analisis data dan interpretasi yang dilakukan pada spektrum UV- Visible, spektrum inframerah (FT-IR), spektrum 1 H-NMR disimpulkan bahwa besar kemungkinan senyawa yang diisolasi dari daun tumbuhan situlan (Macaranga dipterocarpifolia Merrill) adalah senyawa flavonoida golongan flavonol.

16 Meskipun demikian, penulis mengakui bahwa data hasil 1 H-NMR masih kurang murni karena adanya campuran dari senyawa hasil isolasi. Gambar 4.4 berikut ini merupakan struktur flavonol yang diperoleh dari senyawa hasil isolasi: Gambar 4.4 Senyawa Hasil Isolasi (Flavonol)

17 BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN 5.1 Kesimpulan 1. Hasil isolasi yang diperoleh dari 2000 g daun tumbuhan situlan (Macaranga dipterocarpifolia Merrill) merupakan pasta orange kekuningan sebanyak 21 mg dengan harga Rf = 0,33 2. Hasil analisis dengan Spektrofotometri UV-Visible, Spektrofotometri Inframerah (FT-IR) dan Spektrofotometri Magnetik Inti Proton ( 1 H-NMR) menunjukkan bahwa senyawa hasil isolasi dari daun tumbuhan situlan (Macaranga dipterocarpifolia Merrill) diduga adalah senyawa flavonoida golongan flavonol. 5.2 Saran Untuk lebih mendukung struktur senyawa flavonoida hasil isolasi, maka sebaiknya perlu dilakukan analisis Spektrometer Karbon ( 13 C-NMR), Spektrometer Massa (MS), dan analisis HPLC.