BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian dilakukan di Laboratorium Biologi Sel dan Jaringan (BSJ) dan Laboratorium Mikrobiologi Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian (BB-Biogen), Cimanggu, Bogor. Penelitian dilaksanakan pada Februari 2008 - November 2008. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah 1) tanaman nilam Aceh (Pogostemon cablin, Benth.), 2) isolat Methylobacterium spp. strain TD-L 2, TD-J 2, TD-J 7, dan TD-J 10. TD-L 2 adalah isolat no 2 yang diisolasi dari filosfer daun tanaman Labu siam dari Kecamatan Teluk Dalam Kabupaten Tenggarong, Kutai Kertanegara, Kalimantan Timur. TD-J 2 adalah isolat no 2 yang diisolasi dari filosfer daun tanaman Jagung dari Kecamatan Teluk Dalam Kabupaten Tenggarong, Kutai Kertanegara, Kalimantan Timur. TD-J 7 adalah isolat no 7 yang diisolasi dari filosfer daun tanaman Jagung dari Kecamatan Teluk Dalam Kabupaten Tenggarong, Kutai Kertanegara, Kalimantan Timur. TD-J 10 adalah isolat no 10 yang diisolasi dari filosfer daun tanaman Jagung dari Kecamatan Teluk Dalam Kabupaten Tenggarong, Kutai Kertanegara, Kalimantan Timur., 3) media Murrashige & Skoog (MS) yaitu media yang banyak digunakan dalam kultur in vitro. Komposisi media MS disajikan pada Lampiran 3., 4) media Amonium Mineral Salt (AMS) yaitu media yang biasa digunakan untuk perbanyakan Methylobacterium spp. Komposisi media AMS disajikan pada Lampiran 4. Alat yang digunakan diantaranya laminar air flow cabinet, alat-alat tanam seperti pinset, gunting, scalpel, bunsen, cawan petri, dan sealer., alat-alat sterilisasi seperti oven untuk sterilisasi botol kultur, alat tanam, aluminium foil, dan cawan petri., otoklaf untuk sterilisasi media, dan botol kultur., alat-alat pembuatan media seperti tabung erlenmayer, pipet, bulb, timbangan digital, magnetic stirrer, ph meter, labu ukur, corong, dan hot plate.
19 Metode Percobaan I. Uji Efektivitas Teknik Sterilisasi Isolat Methylobacterium spp. untuk Kultur In Vitro Tanaman Nilam Percobaan I bertujuan untuk menentukan teknik sterilisasi yang efektif digunakan untuk mensterilisasi crude Methylobacterium spp. yang akan dimanfaatkan untuk memacu pertumbuhan bibit tanaman nilam dalam kultur in vitro. Isolat yang digunakan adalah Methylobacterium strain TD-L 2 dengan konsentrasi 0%, 10%, 20%, 30%, 40%, dan 50% (v/v media). Isolat ini selanjutnya di sterilisasi sesuai dengan perlakuan, kemudian diujikan pada bibit tanaman nilam dalam kultur in vitro. Bibit tanaman nilam yang digunakan pada Percobaan 1 ini adalah eksplan steril koleksi Laboratorium Biologi Sel dan Jaringan (BSJ) BB-Biogen, Cimanggu Bogor. Eksplan ini merupakan hasil mutasi radiasi sinar gamma (γ). Eksplan mutan ini telah distabilkan dengan cara disubkultur (pindah tanam) secara terus-menerus setiap 3 bulan sekali ke dalam media tanam MS. Eksplan yang digunakan pada percobaan ini berupa batang satu buku sepanjang 2 cm dengan dua daun yang tidak dipotong. Gambar eksplan bibit tanaman nilam yang digunakan pada Percobaan I disajikan pada Lampiran 6. Percobaan ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) satu faktor perlakuan. Faktor perlakuan berupa teknik sterilisasi yang terdiri dari 3 taraf. Taraf pertama yaitu sterilisasi menggunakan filter. Taraf ini selanjutnya akan dinotasikan dengan huruf F. Taraf kedua yaitu sterilisasi menggunakan filter kemudian menggunakan otoklaf. Taraf ini selanjutnya akan dinotasikan dengan huruf F+O. Taraf ketiga yaitu sterilisasi hanya menggunakan otoklaf. Taraf ini selanjutnya akan dinotasikan dengan huruf O. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 20 ulangan (20 botol). Sterilisasi menggunakan filter pada prinsipnya merupakan proses filtrasi (penyaringan) menggunakan milipore ukuran 0,22 µm. Sterilisasi menggunakan otoklaf merupakan teknik sterilisasi yang memanfaatkan panas dan tekanan yang berasal dari uap air. Temperatur sterilisasi yang digunakan adalah 121 O C, tekanan 17,5 psi (pound per square inch), serta lama sterilisasi 20 menit. Teknik sterilisasi terbaik hasil dari percobaan I selanjutnya digunakan pada Percobaan II dan III.
20 Y ij Model rancangan acak lengkap yang digunakan adalah sebagai berikut: Y ij = µ + α i + ε ij = Respon perlakuan faktor media ke-i ulangan ke-j µ = Nilai rataan umum α i = Pengaruh faktor teknik sterilisasi ke-i (i = 1,2,3,...,6) ε ij = Pengaruh galat percobaan oleh faktor perlakuan teknik sterilisasi ke-i ulangan ke-j. Percobaan II. Pengujian Strain Methylobacterium spp. Penghasil Sitokinin (TD-J 2 dan TD-J 7 ) untuk Meningkatkan Multiplikasi Tunas Tanaman Nilam dalam Kultur In Vitro Percobaan II bertujuan untuk melihat pengaruh Methylobacterium spp. penghasil fitohormon sitokinin trans-zeatin dalam meningkatkan multiplikasi tunas bibit tanaman nilam dalam kultur in vitro. Isolat yang digunakan adalah strain TD-J 2 dan TD-J 7. Isolat ini diujikan pada bibit tanaman nilam dalam kultur in vitro secara terpisah. Strain TD-J 2 disterilisasi menggunakan teknik sterilisasi menggunakan otoklaf, sedangkan strain TD-J 7 disterilisasi menggunakan filter milipore 0,22 µm karena strain TD-J 7 ini akan dibandingkan terhadap media kontrol zeatin. Zeatin sintetik ini akan mengalami kerusakan jika disterilisasi menggunakan otoklaf, maka dari itu untuk menjaga keseragaman dalam satu set perlakuan, strain TD-J 7 otoklaf. disterilisasi menggunakan filter tidak menggunakan Bibit tanaman nilam yang digunakan pada percobaan II adalah eksplan steril koleksi Laboratorium Biologi Sel dan Jaringan (BSJ) BB-Biogen, Cimanggu Bogor. Eksplan ini merupakan hasil mutasi radiasi sinar gamma (γ). Eksplan mutan ini telah distabilkan dengan cara disubkultur (pindah tanam) secara terus-menerus setiap 3 bulan sekali ke dalam media tanam MS. Eksplan yang digunakan pada percobaan ini berupa batang satu buku sepanjang 2 cm dengan dua daun yang tidak dipotong. Gambar eksplan bibit tanaman nilam yang digunakan pada Percobaan II disajikan pada Lampiran 6. Pengujian strain TD-J 2 dinamakan sebagai percobaan IIA, dan pengujian isolat TD-J 7 dinamakan sebagai percobaan IIB.
21 Percobaan IIA menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) satu faktor perlakuan. Faktor perlakuan berupa media yang terdiri dari 6 taraf yaitu 1) media MS+0% TD-J 2, 2) MS+10% TD-J 2, 3) MS+20% TD-J 2, 4) MS+30% TD-J 2, 5) MS+0,1 mg/l BAP, dan 6) AMS. Media AMS adalah media Ammonium Mineral Salt, media yang biasa digunakan untuk perbanyakan Methylobacterium spp. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 6 ulangan (6 botol). Masing-masing ulangan terdiri dari 4 eksplan tanaman nilam. Model rancangan acak lengkap yang digunakan adalah sebagai berikut: Y ij = µ + α i + ε ij Y ij = Respon perlakuan faktor media ke-i ulangan ke-j µ = Nilai rataan umum α i = Pengaruh faktor media ke-i (i = 1,2,3,...,6) ε ij = Pengaruh galat percobaan oleh faktor perlakuan media ke-i ulangan ke-j Percobaan IIB menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) satu faktor perlakuan. Faktor perlakuan berupa media yang terdiri dari 6 taraf yaitu 1) media MS+0% TD-J 7, 2) MS+10% TD-J 7, 3) MS+20% TD-J 7, 4) MS+30% TD-J 7, 5) MS+0,1 mg/l Zeatin, dan 6) AMS. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 6 ulangan (6 botol). Masing-masing ulangan terdiri dari 4 eksplan tanaman nilam. Model rancangan acak lengkap yang digunakan adalah sebagai berikut: Y ij = µ + α i + ε ij Y ij = Respon perlakuan faktor media ke-i ulangan ke-j µ = Nilai rataan umum α i = Pengaruh faktor media ke-i (i = 1,2,3,...,6) ε ij = Pengaruh galat percobaan oleh faktor perlakuan media ke-i ulangan ke-j Percobaan III. Pengujian Strain Methylobacterium spp. Penghasil Auksin (TD-J 10 ) untuk Menginduksi Perakaran Tanaman Nilam dalam Kultur In Vitro Percobaan III bertujuan untuk melihat pengaruh Methylobacterium spp. penghasil auksin IAA dalam menginduksi perakaran bibit tanaman nilam dalam kultur in vitro. Isolat yang digunakan adalah strain TD-J 10. Isolat ini diujikan pada bibit tanaman nilam dalam kultur in vitro. Bibit tanaman nilam yang digunakan
22 pada percobaan II adalah eksplan steril koleksi Laboratorium Biologi Sel dan Jaringan (BSJ) BB-Biogen, Cimanggu Bogor. Eksplan ini merupakan hasil mutasi radiasi sinar gamma (γ). Eksplan mutan ini telah distabilkan dengan cara disubkultur (pindah tanam) secara terus-menerus setiap 3 bulan sekali ke dalam media tanam MS. Eksplan yang digunakan pada percobaan ini berupa batang tiga buku sepanjang 4 cm dengan daun yang tidak dipotong. Gambar eksplan yang digunakan pada Percobaan III disajikan pada Lampiran 6. Percobaan III menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) satu faktor perlakuan. Faktor perlakuan berupa media yang terdiri dari 7 taraf yaitu 1) MS+0% TD-J 10, 2) MS+10% TD-J 10, 3) MS+20% TD-J 10, 4) MS+30% TD-J 10, 5) MS+0,1 mg/l IAA, 6) MS+0,1 mg/l NAA, dan 7) AMS. Masing-masing perlakuan diulang sebanyak 6 ulangan (6 botol). Masing-masing ulangan terdiri dari 3 eksplan tanaman nilam. Model rancangan acak lengkap yang digunakan adalah sebagai berikut: Y ij = µ + α i + ε ij Y ij = Respon perlakuan faktor media ke-i, dan ulangan ke-j µ = Nilai rataan umum α i = Pengaruh faktor media ke-i (i = 1,2,3,...7) ε ij = Pengaruh galat percobaan oleh faktor perlakuan media ke-i ulangan ke-j Pelaksanaan Penelitian Sterilisasi Alat Alat-alat yang akan digunakan dicuci bersih dengan menggunakan detergen, kemudian disterilisasi menggunakan oven pada suhu 150 0 C selama 2-3 jam. Alat-alat yang disterilisasi antara lain botol kultur, alat-alat tanam (pinset, gunting, scalpel), cawan petri, erlenmeyer, dll. Inokulasi Bakteri Methylobacterium spp. Inokulasi bakteri Methylobacterium spp. ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi Bakteri BB-Biogen, Cimanggu Bogor. Kegiatan ini dilakukan
23 dengan cara memindahkan 1 ose biakan dari media agar miring (AMS padat) kedalam media AMS cair. Gambar biakan murni Methylobacterium spp. dalam media agar miring disajikan pada Lampiran 7. Langkah pertama adalah pembuatan media AMS cair. Komposisi serta dosis bahan-bahan media AMS disajikan pada Lampiran 4. Pembuatan media AMS cair dilakukan dengan menimbang bahan I pada Lampiran 3 dan memasukkannya kedalam gelas kimia. Sebanyak 500 ml aqudes steril dituangkan kedalamnya. Media dikocok menggunakan magnetik stirer sampai semua bahan larut. Larutan media AMS dari gelas kimia dituangkan kedalam labu ukur, kemudian ditambahkan aquades steril dan ditera sampai 1 liter. Langkah kedua adalah mensterilisasi media AMS cair menggunakan otoklaf pada suhu 121 0 C dan tekanan 17,5 psi selama 40 menit. Larutan media AMS yang telah diencerkan sampai 1 liter tadi kemudian dibagi menjadi 4 bagian kedalam labu erlenmeyer 300 ml masing-masing sebanyak 250 ml. Menutupnya dengan memampatkan gumpalan kapas kedalam mulut labu erlenmeyer, kemudian menutupnya menggunakan aluminium foil dan memasukkannya kedalam otoklaf untuk disterilisasi. Langkah ketiga adalah inokulasi bakteri secara aseptik didalam laminar air flow cabinet. Inokulasi dilakukan dengan cara menambahkan methanol sebanyak 1% kedalam media AMS cair yang telah disterilisasi pada langkah kedua. Selama penamabahan methanol, sebaiknya tidak menyalakan api bunsen didalam laminar karena methanol mudah terbakar. Api bunsen baru dinyalakan pada saat penambahan tryptofan sebanyak 0,1% sampai akhir kegiatan. Setelah penambahan tryptofan sebanyak 0,1% dilakukan setelah penambahan methanol. Stok bakteri diambil dari media agar miring (stok biakan bakteri) menggunakan ose sebanyak 1 ose, kemudian memindahkannya kedalam media AMS cair yang telah ditambahkan methanol dan tryptofan. Biakan yang berada didalam media AMS cair ini kemudian diinkubasi selama 7 hari. Selama masa inkubasi, biakan diletakkan pada mesin pengocok (shaker) yang diseting dengan kecepatan putaran 140 rpm (rotasi per menit). Pengocokan ini dilakukan untuk menghindari terbentuknya mat atau lapisan lengket pada permukaan biakan. Jika terbentuk mat, maka biakan akan sulit difilter. Gambar crude bakteri
24 Methylobacterium spp. yang dipanen setelah 7 hari masa inkubasi disajikan pada Lampiran 7. Pembuatan Media Perlakuan Percobaan I. Uji Efektivitas Teknik Sterilisasi Isolat Methylobacterium spp. untuk Kultur In Vitro Tanaman Nilam Perlakuan pada percobaan I yaitu berupa teknik sterilisasi yang terdiri dari 3 taraf. Taraf yang pertama yaitu teknik sterilisasi menggunakan filter. Taraf yang kedua yaitu teknik sterilisasi menggunakan filter kemudian otoklaf. Taraf yang ketiga yaitu teknik sterilisasi menggunakan otoklaf. 1. Teknik sterilisasi dengan filter Langkah pertama adalah filterisasi (penyaringan) bakteri. Filterisasi ini dilakukan secara aseptik didalam laminar air flow cabinet. Biakan yang telah selesai diinkubasi selama 7 hari kemudian difilter (disaring) menggunakan filter milipore ukuran 0,22 µm. Bakteri Methylobacterium spp. memiliki ukuran tubuh maksimum 0,8-1,0 x 1,0-10,0 µm (Aken et al. 2004a), maka dari itu digunakan filter milipore ukuran 0,22 µm untuk menyaringnya. Biakan bakteri diambil sekitar 2-3 ml menggunakan suntikan steril, kemudian disuntikkan kedalam filter milipore yang diletakkan tepat dimulut labu erlenmeyer. Hasilnya akan menetes dari dalam filter milipore masuk kedalam labu erlenmeyer. Proses ini dilakukan terus berulang-ulang sampai biakan habis. Filter milipore dan suntikan diganti setiap 100 ml biakan demi menjaga sterilitas dan memudahkan peneliti dalam melakukan proses ini. Hasil dari filterisasi ini berupa larutan bening berwarna kekuningan yang disebut filtrat. Filtrat hasil dari proses filterisasi disajikan pada Lampiran 7. Filtrat ini mengandung auksin, sitokinin, dan bahan lainnya yang disintesis oleh bakteri. Filtrat ini yang ditambahkan kedalam media MS untuk kemudian ditanami eksplan nilam. Langkah kedua adalah pembuatan media MS. Komposisi media MS disajikan pada Lampiran 3. Media MS dibuat sebanyak 500 ml dengan penambahan filtrat sebanyak 10%. Artinya, pada 450 ml media MS ditambahkan
25 sebanyak 50 ml filtrat. Media MS dibuat dengan cara memipet bahan-bahan media MS yang telah dibuat dalam larutan-larutan stok sesuai konsentrasinya dan memasukkannya kedalam gelas kimia volume 1 liter. Sebanyak 15 gram gula pasir dan aquades steril sebanyak 300 ml dituangkan kedalamnya. Larutan dikocok menggunakan magnetik stirer sampai benar-benar larut, kemudian dilakukan pengukuran ph menggunakan digital ph meter. ph media yang sesuai untuk kultur nilam adalah ph netral yaitu 5,8-6. Jika larutan media terlalu basa (angka ph tinggi, diatas 6), maka dilakukan penurunan ph dengan menambahkan larutan HCl setetes demi setetes menggunakan pipet sampai mencapai ph 5,8-6. Jika larutan terlalu asam (angka ph rendah, dibawah 5,8), maka dilakukan penambahan larutan KOH setetes demi setetes untuk meningkatkan ph sampai 5,8-6. Larutan media MS dituangkan kedalam gelas ukur untuk ditera dengan ditambahkan aquades steril sampai tepat 450 ml. Larutan media dituangkan kedalam labu erlenmeyer. Sebagai bahan pemadat, sebanyak 2,5 gram pytagel ditambahkan kedalam larutan media, kemudian menutupnya dengan aluminium foil. Larutan media disterilisasi mengunakan otoklaf selama 25-30 menit. Langkah ketiga adalah menambahkan filtrat kedalam media MS steril. Kegiatan ini dilakukan secara aseptik didalam laminar air flow cabinet segera setelah larutan media MS selesai disterilisasi dalam otoklaf. Kegiatan ini harus dilakukan dengan cepat sebelum media MS dingin dan memadat dalam labu erlenmeyer. Sebanyak 50 ml filtrat ditambahkan kedalam labu erlenmeyer yang berisi 450 ml media MS untuk membuat media MS+10% filtrat bakteri. Larutan dikocok sebentar sampai larut, kemudian dituangkan kedalam 20 botol kultur dengan volume yang sama yaitu sekitar 25 ml per botol kultur. Botol kultur yang sudah diisi media MS+10% filtrat ini kemudian ditutup menggunakan aluminium foil dan disimpan diruang media sampai media menjadi padat dan siap ditanami eksplan. Langkah yang sama dilakukan untuk pembuatan media MS+20% filtrat, dan seterusnya sampai media MS+50% filtrat. Perbedaannya hanya pada jumlah aquades yang dikurangi dan volume filtrat yang dinaikkan sampai mencapai persentase yang diinginkan.
26 2. Teknik sterilisasi dengan filter kemudian otoklaf Langkah pertama adalah filterisasi (penyaringan) bakteri. Filterisasi ini dilakukan secara aseptik didalam laminar air flow cabinet. Biakan yang telah selesai diinkubasi selama 7 hari kemudian difilter (disaring) menggunakan filter milipore ukuran 0,22 µm. Biakan bakteri diambil sekitar 2-3 ml menggunakan suntikan steril, kemudian disuntikkan kedalam filter milipore yang diletakkan tepat dimulut labu erlenmeyer. Filtrat akan menetes dari dalam filter milipore masuk kedalam labu erlenmeyer. Proses ini dilakukan terus berulang-ulang sampai biakan habis. Filter milipore dan suntikan diganti setiap 100 ml biakan demi menjaga sterilitas dan memudahkan peneliti dalam melakukan proses ini. Langkah kedua adalah pembuatan media MS+10% filtrat yaitu dengan cara menambahkan sebanyak 50 ml filtrat kedalam 450 ml larutan media MS. Bahan-bahan media MS disajikan pada Lampiran 3. Media MS dibuat dengan cara memipet bahan-bahan media MS yang telah dibuat dalam larutan-larutan stok sesuai konsentrasinya dan memasukkannya kedalam gelas kimia volume 1 liter. Sebanyak 15 gram gula pasir dan aquades steril sebanyak 300 ml dituangkan kedalamnya. Sebanyak 50 ml filtrat ditambahkan kedalam larutan media. Larutan dikocok menggunakan magnetik stirer sampai benar-benar larut, kemudian dilakukan pengukuran ph menggunakan digital ph meter sampai 5,8-6. Larutan media dituangkan kedalam labu ukur untuk ditera dengan ditambahkan aquades steril sampai tepat 500 ml. Sebagai bahan pemadat, sebanyak 2,5 gram pytagel ditambahkan kedalam larutan media. Larutan media dididihkan menggunakan hotplate sampai mendidih, kemudian menuangkannya kedalam 20 botol kultur dengan volume yang sama setiap botolnya yaitu sekitar 25 ml media. Botol kultur yang sudah berisi media kemudian ditutup dengan menggunakan aluminium foil. Media disterilisasi mengunakan otoklaf selama 25-30 menit, kemudian disimpan sampai media memadat. 3. Teknik sterilisasi dengan otoklaf Langkah pertama adalah pembuatan media MS+10% crude bakteri yaitu dengan cara menambahkan sebanyak 50 ml filtrat kedalam 450 ml larutan media MS. Crude disini artinya adalah larutan atau biakan bakteri yang masih lengkap
27 dengan koloni bakteri dan bahan-bahan lainnya tanpa melalui proses penyaringan (filterisasi) sebagaimana dilakukan pada taraf perlakuan 1 dan 2. Crude ini merupakan hasil pemanenan biakan setelah diinkubasi selama 7 hari. Komposisi media MS disajikan pada Lampiran 3. Media MS dibuat dengan cara memipet bahan-bahan media MS yang telah dibuat dalam larutan-larutan stok sesuai konsentrasinya dan memasukkannya kedalam gelas kimia volume 1 liter. Sebanyak 15 gram gula pasir dan aquades steril sebanyak 300 ml dituangkan kedalamnya. Sebanyak 50 ml crude bakteri ditambahkan kedalam larutan media. Larutan dikocok menggunakan magnetik stirer sampai benar-benar larut, kemudian dilakukan pengukuran ph menggunakan digital ph meter sampai 5,8-6. Langkah selanjutnya, larutan media dituangkan kedalam labu ukur untuk ditera dengan ditambahkan aquades steril sampai tepat 500 ml. Sebagai bahan pemadat, sebanyak 2,5 gram pytagel ditambahkan kedalam larutan media. Larutan media dididihkan menggunakan hotplate sampai mendidih, kemudian menuangkannya kedalam 20 botol kultur dengan volume yang sama setiap botolnya yaitu sekitar 25 ml media. Botol kultur yang sudah berisi media kemudian ditutup dengan menggunakan aluminium foil. Media disterilisasi mengunakan otoklaf selama 25-30 menit, kemudian disimpan sampai media memadat. Percobaan II. Pengujian Strain Methylobacterium spp. Penghasil Sitokinin (TD-J 2 dan TD-J 7 ) untuk Meningkatkan Multiplikasi Tunas Tanaman Nilam dalam Kultur In Vitro A. Strain TD-J 2 Media perlakuan terdiri dari media MS+10% TD-J 2, MS+20% TD-J 2, MS+30% TD-J 2. Cara pembuatan media yang akan dijelaskan adalah cara pembuatan media MS+10% TD-J 2. Cara pembuatan MS+20% TD-J 2 MS+30% TD-J 2 dilakukan dengan cara yang sama dengan cara pembuatan media MS+10% TD-J 2. Perbedaannya hanya pada jumlah aquades yang dikurangi dan volume filtrat yang dinaikkan sampai mencapai persentase yang diinginkan. Langkah pertama pembuatan media MS+10% crude bakteri adalah dengan cara menambahkan sebanyak 50 ml crude kedalam 450 ml larutan media MS. Komposisi media MS disajikan dalam Tabel Lampiran 3. Media MS dibuat dan
28 dengan cara memipet bahan-bahan media MS yang telah dibuat dalam larutan-larutan stok sesuai konsentrasinya dan memasukkannya kedalam gelas kimia volume 1 liter. Sebanyak 15 gram gula pasir dan aquades steril sebanyak 300 ml dituangkan kedalamnya. Sebanyak 50 ml crude bakteri ditambahkan kedalam larutan media. Larutan dikocok menggunakan magnetik stirer sampai benar-benar larut, kemudian dilakukan pengukuran ph menggunakan digital ph meter sampai 5,8-6. Langkah selanjutnya, larutan media dituangkan kedalam labu ukur untuk di tera dengan ditambahkan aquades steril sampai tepat 500 ml. Sebagai bahan pemadat, sebanyak 2,5 gram pytagel ditambahkan kedalam larutan media. Larutan media dididihkan menggunakan hotplate sampai mendidih, kemudian menuangkannya kedalam 20 botol kultur dengan volume yang sama setiap botolnya yaitu sekitar 25 ml media. Botol kultur yang sudah berisi media kemudian ditutup dengan menggunakan aluminium foil. Media disterilisasi mengunakan otoklaf selama 25-30 menit, kemudian disimpan sampai media memadat. B. Strain TD-J 7 Media perlakuan terdiri dari media MS+10% TD-J 7, MS+20% TD-J 7, MS+30% TD-J 7. Cara pembuatan media yang akan dijelaskan adalah cara pembuatan media MS+10% TD-J 7. Cara pembuatan MS+20% TD-J 7 dan MS+30% TD-J 7 dilakukan dengan cara yang sama dengan cara pembuatan media MS+10% TD-J 7. Perbedaannya hanya pada jumlah aquades yang dikurangi dan volume filtrat yang dinaikkan sampai mencapai persentase yang diinginkan. Langkah pertama adalah filterisasi (penyaringan) bakteri. Filterisasi ini dilakukan secara aseptik didalam laminar air flow cabinet. Biakan yang telah selesai diinkubasi selama 7 hari kemudian difilter (disaring) menggunakan filter milipore ukuran 0,22 µm. Biakan bakteri diambil sekitar 2-3 ml menggunakan suntikan steril, kemudian disuntikkan kedalam filter milipore yang diletakkan tepat dimulut labu erlenmeyer. Filtrat akan menetes dari dalam filter milipore masuk kedalam labu erlenmeyer. Proses ini dilakukan terus berulang-ulang sampai biakan habis. Filter milipore dan suntikan diganti setiap 100 ml biakan demi menjaga sterilitas dan
29 memudahkan peneliti dalam melakukan proses ini. Hasil dari filterisasi ini berupa filtrat yang selanjutnya ditambahkan kedalam media MS untuk kemudian ditanami eksplan nilam. Langkah kedua adalah pembuatan media MS+10% TD-J 7. Komposisi media MS disajikan dalam Tabel Lampiran 3. Media MS+10% TD-J 7 dibuat sebanyak 500 ml dengan penambahan filtrat sebanyak 10%. Artinya, pada 450 ml media MS ditambahkan sebanyak 50 ml filtrat. Komposisi media MS disajikan pada Lampiran 3. Media MS dibuat dengan cara memipet bahan-bahan media MS yang telah dibuat dalam larutan-larutan stok sesuai konsentrasinya dan memasukkannya kedalam gelas kimia volume 1 liter. Sebanyak 15 gram gula pasir ditambahkan kedalamnya. Aquades steril sebanyak 300 ml dituangkan kedalamnya. Larutan dikocok menggunakan magnetik stirer sampai benar-benar larut, kemudian dilakukan pengukuran ph menggunakan digital ph meter sampai mencapai ph 5,8-6. Larutan media dituangkan kedalam gelas ukur untuk ditera dengan ditambahkan aquades steril sampai tepat 450 ml. Larutan media dituangkan kembali kedalam labu erlenmeyer. Sebagai bahan pemadat, sebanyak 2,5 gram pytagel ditambahkan kedalam larutan media, kemudian menutupnya dengan aluminium foil. Larutan media disterilisasi mengunakan otoklaf selama 25-30 menit. Langkah ketiga adalah menambahkan filtrat kedalam media MS steril. Kegiatan ini dilakukan secara aseptik didalam laminar air flow cabinet segera setelah larutan media MS selesai disterilisasi dalam otoklaf. Kegiatan ini harus dilakukan dengan cepat sebelum media MS dingin dan memadat dalam labu erlenmeyer. Sebanyak 50 ml filtrat ditambahkan kedalam labu erlenmeyer yang berisi 450 ml media MS untuk pembuatan media MS+10% TD-J 7. Larutan media dikocok sebentar sampai larut, kemudian dituangkan kedalam 20 botol kultur dengan volume yang sama yaitu sekitar 25 ml per botol kultur. Botol kultur yang sudah diisi media MS+10% TD-J 7 ini kemudian ditutup menggunakan aluminium foil dan disimpan diruang media sampai media menjadi padat dan siap ditanami eksplan.
30 Percobaan III. Pengujian Strain Methylobacterium spp. Penghasil Auksin (TD-J 10 ) untuk Menginduksi Perakaran Tanaman Nilam dalam Kultur In Vitro Media perlakuan pada Percobaan III terdiri dari media MS+10% TD-J 10, MS+20% TD-J 10, MS+30% TD-J 10. Cara pembuatan media yang akan dijelaskan adalah cara pembuatan media MS+10% TD-J 10. Cara pembuatan MS+20% TD-J 10 dan MS+30% TD-J 10 dilakukan dengan cara yang sama dengan cara pembuatan media MS+10% TD-J 10. Perbedaannya hanya pada jumlah aquades yang dikurangi dan volume crude bakteri yang dinaikkan sampai mencapai persentase yang diinginkan. Langkah pertama pembuatan media MS+10% TD-J 10 adalah dengan cara menambahkan sebanyak 50 ml crude TD-J 10 kedalam 450 ml larutan media MS. Komposisi media MS disajikan pada Lampiran 3. Media MS dibuat dengan cara memipet bahan-bahan media MS yang telah dibuat dalam larutan-larutan stok sesuai konsentrasinya dan memasukkannya kedalam gelas kimia volume 1 liter. Sebanyak 15 gram gula pasir ditambahkan kedalamnya. Aquades steril sebanyak 300 ml dituangkan kedalamnya. Sebanyak 50 ml crude bakteri ditambahkan kedalam larutan media. Larutan dikocok menggunakan magnetik stirer sampai benar-benar larut, kemudian dilakukan pengukuran ph menggunakan digital ph meter sampai 5,8-6. Langkah selanjutnya, larutan media dituangkan kedalam labu ukur untuk ditera dengan ditambahkan aquades steril sampai tepat 500 ml. Sebagai bahan pemadat, sebanyak 2,5 gram pytagel ditambahkan kedalam larutan media. Larutan media dididihkan menggunakan hotplate sampai mendidih, kemudian menuangkannya kedalam 20 botol kultur dengan volume yang sama setiap botolnya yaitu sekitar 25 ml media. Botol kultur yang sudah berisi media kemudian ditutup dengan menggunakan aluminium foil. Media disterilisasi mengunakan otoklaf selama 25-30 menit, kemudian disimpan sampai media memadat.
31 Pembuatan Media Kontrol Percobaan I. Uji Efektivitas Teknik Sterilisasi Isolat Methylobacterium spp. untuk Kultur In Vitro Tanaman Nilam Media kontrol pada Percobaan I terdiri dari media MS, MS+BAP 0,1 mg/l, media MS+IAA 0,1 mg/l, dan MS+NAA 0,1 mg/l. Cara pembuatan media yang akan dijelaskan adalah cara pembuatan media MS dan media MS+BAP 0,1 mg/l. Cara pembuatan media MS+IAA 0,1 mg/l, dan MS+NAA 0,1 mg/l dilakukan dengan cara yang sama dengan cara pembuatan media MS+BAP 0,1 mg/l. Perbedaannya hanya pada jenis ZPT yang ditambahkan saja yaitu IAA dan NAA. A. Pembuatan media MS Langkah-langkah pembuatan media MS adalah dengan cara memipet bahan-bahan media MS yang telah dibuat dalam larutan-larutan stok sesuai konsentrasinya dan memasukkannya kedalam gelas kimia volume 1 liter. Komposisi media MS disajikan pada Lampiran 3. Sebanyak 15 gram gula pasir dan aquades steril sebanyak 300 ml ditambahkan kedalamnya. Larutan dikocok menggunakan magnetik stirer sampai benar-benar larut, kemudian dilakukan pengukuran ph menggunakan digital ph meter sampai 5,8-6. Larutan media dituangkan kedalam labu ukur untuk ditera dengan ditambahkan aquades steril sampai tepat 500 ml. Sebagai bahan pemadat, sebanyak 2,5 gram pytagel ditambahkan kedalam larutan media. Larutan media dididihkan menggunakan hotplate sampai mendidih, kemudian menuangkannya kedalam 20 botol kultur dengan volume yang sama setiap botolnya yaitu sekitar 25 ml media. Botol kultur yang sudah berisi media kemudian ditutup dengan menggunakan aluminium foil. Media disterilisasi mengunakan otoklaf selama 25-30 menit, kemudian disimpan sampai media memadat. B. Pembuatan media MS+BAP 0,1 mg/l Langkah-langkah pembuatan media MS+BAP 0,1 mg/l adalah dengan cara memipet bahan-bahan media MS yang telah dibuat dalam larutan-larutan stok sesuai konsentrasinya dan memasukkannya kedalam gelas kimia volume 1 liter. Komposisi media MS disajikan pada Lampiran 3. Sebanyak 30 gram gula pasir dan aquades steril sebanyak 700 ml ditambahkan kedalamnya. Larutan dikocok menggunakan magnetik stirer sampai benar-benar larut. Sebanyak 0,1 mg/l BAP
32 dilarutkan kemudian ditambahkan kedalam larutan media., kemudian dilakukan pengukuran ph menggunakan digital ph meter sampai 5,8-6. Larutan media dituangkan kedalam labu ukur untuk di tera dengan ditambahkan aquades steril sampai tepat 1000 ml atau 1 liter. Sebagai bahan pemadat, sebanyak 5 gram pytagel ditambahkan kedalam larutan media. Larutan media dididihkan menggunakan hotplate sampai mendidih, kemudian menuangkannya kedalam 40 botol kultur dengan volume yang sama setiap botolnya yaitu sekitar 25 ml media. Botol kultur yang sudah berisi media kemudian ditutup dengan menggunakan aluminium foil. Media disterilisasi menggunakan otoklaf selama 25-30 menit, kemudian disimpan sampai media memadat. Percobaan II. Pengujian Strain Methylobacterium spp. Penghasil Sitokinin (TD-J 2 dan TD-J 7 ) untuk Meningkatkan Multiplikasi Tunas Tanaman Nilam dalam Kultur In Vitro Media kontrol pada Percobaan II terdiri dari media MS, MS+BAP 0,1 mg/l, media MS+Zeatin 0,1 mg/l, dan media AMS padat. A. Pembuatan Media MS Langkah-langkah pembuatan media MS dijelaskan pada sub judul Pembuatan Media Kontrol Percobaan I poin A. B. Pembuatan media MS+BAP 0,1 mg/l Langkah-langkah pembuatan media MS+BAP 0,1 mg/l dijelaskan pada sub judul Pembuatan Media Kontrol Percobaan I poin B. C. Pembuatan media MS+Zeatin 0,1 mg/l Langkah-langkah pembuatan media MS+Zeatin 0,1 mg/l adalah dengan diawali pembuatan media MS terlebih dahulu. Pembuatan media MS dibuat dengan cara memipet bahan-bahan media MS yang telah dibuat dalam larutan-larutan stok sesuai konsentrasinya dan memasukkannya kedalam gelas kimia volume 1 liter. Komposisi media MS disajikan pada Lampiran 3. Sebanyak 30 gram gula pasir dan aquades steril sebanyak 700 ml ditambahkan kedalamnya. Langkah selanjutnya, larutan dikocok menggunakan magnetik stirer sampai benar-benar larut, kemudian dilakukan pengukuran ph menggunakan
33 digital ph meter sampai mencapai ph 5,8-6. Larutan media dituangkan kedalam gelas ukur untuk ditera dengan ditambahkan aquades steril sampai tepat 999 ml. Larutan media dituangkan kembali kedalam labu erlenmeyer. Sebagai bahan pemadat, sebanyak 5 gram pytagel ditambahkan kedalam larutan media, kemudian menutupnya dengan aluminium foil. Larutan media disterilisasi mengunakan otoklaf selama 25-30 menit. Langkah ketiga adalah menambahkan zeatin yang sudah dilarutkan dan dibuat stok dengan dosis uptake 1 ml/liter serta sudah disterilisasi sebanyak 1 ml kedalam media MS steril. Kegiatan ini dilakukan secara aseptik didalam laminar air flow cabinet segera setelah larutan media MS selesai disterilisasi dalam otoklaf. Kegiatan ini harus dilakukan dengan cepat sebelum media MS dingin dan memadat dalam labu erlenmeyer. Larutan media dikocok sebentar sampai larut, kemudian dituangkan kedalam 40 botol kultur dengan volume yang sama yaitu sekitar 25 ml per botol kultur. Botol kultur yang sudah diisi media MS+10% TD-J 7 ini kemudian ditutup menggunakan aluminium foil dan disimpan diruang media sampai media menjadi padat. D. Pembuatan media AMS Padat Langkah-langkah pembuatan media AMS padat adalah dengan cara menimbang bahan-bahan media AMS dan memasukkannya kedalam gelas kimia volume 1 liter. Komposisi media AMS disajikan pada Lampiran 4. Bahan-bahan ini dilarutkan dengan menggunakan pelarut berupa aquades steril sebanyak 700 ml. Larutan dikocok menggunakan magnetik stirer sampai semua bahan benar-benar larut, kemudian dilakukan pengukuran ph menggunakan digital ph meter sampai mencapai ph 7. Larutan media dituangkan kedalam labu ukur untuk ditera dengan ditambahkan aquades steril sampai tepat 1000 ml. Larutan media dituangkan kembali kedalam labu erlenmeyer. Sebagai bahan pemadat, sebanyak 5 gram pytagel ditambahkan kedalam larutan media. Larutan media dididihkan menggunakan hotplate sampai mendidih, kemudian menuangkannya kedalam 40 botol kultur dengan volume yang sama setiap botolnya yaitu sekitar 25 ml media. Botol kultur yang telah berisi media kemudian ditutup dengan menggunakan
34 aluminium foil. Media disterilisasi menggunakan otoklaf selama 25-30 menit, kemudian disimpan sampai media memadat. Percobaan III. Pengujian Strain Methylobacterium spp. Penghasil Auksin (TD-J 10 ) untuk Menginduksi Perakaran Tanaman Nilam dalam Kultur In Vitro Media kontrol pada Percobaan III terdiri dari media MS, MS+IAA 0,1 mg/l, media MS+NAA 0,1 mg/l, dan media AMS padat. Langkah-langkah pembuatan media MS dijelaskan pada sub judul Pembuatan Media Kontrol Percobaan I poin A. Langkah-langkah pembuatan media MS+IAA 0,1 mg/l dan media MS+NAA 0,1 mg/l dijelaskan pada sub judul Pembuatan Media Kontrol Percobaan I poin B. Langkah-langkah pembuatan media AMS padat dijelaskan pada sub judul Pembuatan Media Kontrol Percobaan II poin D. Penanaman Eksplan Penanaman dilakukan didalam laminar air flow cabinet steril, eksplan ditanam ke dalam botol yang berisi media perlakuan, kemudian tepi botol dipanaskan pada api bunsen dan ditutup dengan aluminium foil dan di seal dengan plastik wrap. Botol kultur yang berisi eksplan perlakuan disimpan dalam rak kultur yang kondisi lingkungannya homogen sehingga diharapkan keragaman yang muncul benar-benar disebabkan oleh faktor perlakuan. Pemeliharaan Inkubasi diruang kultur pada kondisi terang dengan cahaya lampu TL 40 watt 1000 lux 16 jam per hari, temperatur 21-25 o C. Eksplan yang terkontaminasi langsung dikeluarkan agar tidak menyebar. Penyemprotan alkohol 70% dilakukan secara rutin pada botol kultur setiap hari untuk mencegah kontaminasi.
35 Pengamatan Pengamatan akan dilakukan setiap minggu mulai dari 0 MST sampai 8 MST dengan parameter yang diamati sebagai berikut : 1. Jumlah tunas 2. Jumlah buku 3. Jumlah daun 4. Tinggi tunas 5. Waktu inisiasi tunas 6. Waktu inisiasi akar 7. Panjang akar 8. Jumlah akar 9. Ada atau tidak ada kalus terbentuk 10. Tingkat kontaminasi.