BAB III METODE PENELITIAN. Rancangan Penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah RAL

Transkripsi

1 BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Rancangan Penelitian Rancangan Penelitian yang digunakan dalam penelitian ini adalah RAL faktorial dengan 15 perlakuan dan 3 kali ulangan. Desain perlakuan pada penelitian ini disajikan pada tabel 3.1 Jenis Medium Lama Fermentasi 38 Ulangan K1 K2 K3 P1 R1 B1P1R1K1 B1P1R1K2 B1P1R1K3 R2 B1P1R2K1 B1P1R2K2 B1P1R2K3 R3 B1P1R3K1 B1P1R3K2 B1P1R3K3 R4 B1P1R4K1 B1P1R4K2 B1P1R4K3 R5 B1P1R5K1 B1P1R5K2 B1P1R5K3 P2 R1 B1P2R1K1 B1P2R1K2 B1P2R1K3 R2 B1P2R2K1 B1P2R2K2 B1P2R2K3 R3 B1P2R3K1 B1P2R3K2 B1P2R3K3 R4 B1P2R4K1 B1P2R4K2 B1P2R4K3 R5 B1P2R5K1 B1P2R5K2 B1P2R5K3 P3 RI B1P3R1K1 B1P3R1K2 B1P3R1K3 R2 B1P3R2K1 B1P3R2K2 B1P3R2K3 R3 B1P3R3K1 B1P3R3K2 B1P3R3K3 R4 B1P3R4K1 B1P3R4K2 B1P3R4K3 R5 B1P3R5K1 B1P3R5K2 B1P3R5K3 P1 R1 B2P1R1K1 B2P1R1K2 B2P1R1K3 R2 B2P1R2K1 B2P1R2K2 B2P1R2K3 R3 B2P1R3K1 B2P1R3K2 B2P1R3K3 R4 B2P1R4K1 B2P1R4K2 B2P1R4K3 R5 B2P1R5K1 B2P1R5K2 B2P1R5K3 P2 R1 B2P2R1K1 B2P2R1K2 B2P2R1K3 R2 B2P2R2K1 B2P2R2K2 B2P2R2K3 R3 B2P2R3K1 B2P2R3K2 B2P2R3K3 R4 B2P2R4K1 B2P2R4K2 B2P2R4K3 R5 B2P2R5K1 B2P2R5K2 B2P2R5K3 P3 R1 B2P3R1K1 B2P3R1K2 B2P3R1K3 R2 B2P3R2K1 B2P3R2K2 B2P3R2K3 R3 B2P3R3K1 B2P3R3K2 B2P3R3K3 R4 B2P3R4K1 B2PER4K2 B2P3R4K3 R5 B2P3R5K1 B2P3R5K2 B2P3R5K3

2 39 Keterangan : B1 : Bakteri Vibrio cholerae B2 : Bakteri Bacillus cereus PI : Mediun Teh P2 : Medium Kopi P3 : Medium Rosela R1 : kontrol R2 : Lama fermentasi 3 hari R3 : Lama fermentasi 6 hari R4 : Lama fermentasi 9 hari R5 : Lama fermentasi 12 hari K1 : Ulangan 1 K2 : Ulangan 2 K3 : Ulangan Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan pada bulan November-Desember 2009 di Laboratoriun Mikrobiologi Jurusan Biologi Fakultas Sains Dan Teknologi Universitas Islam Negeri Maulana Malik Ibrahim Malang 3.3 Variabel Penelitian Pada penelitian ini terdapat tiga macam variabel yaitu : 1. Variabel Bebas : Medium fermentasi Kombucha (teh, kopi, rosela) dengan lama fermentasi 3 hari, 6 hari, 9 hari dan 12 hari 2. Variabel terikat : ph medium, Ketebalan Nata, Total Asam medium, Total padatan terlarut medium dan Diameter zona hambat medium fermentasi Kombucha (teh, kopi, rosela) dengan lama fermentasi 3 hari, 6 hari, 9 hari dan 12 hari

3 40 3. Variabel terkendali : Suhu medium, Konsentrasi (teh, kopi, rosela), Kadar sukrosa medium dan inokulum kombucha 3.4 Alat dan Bahan Alat Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah : Tabung reaksi, beaker glass, hot plate, pengaduk, cawan petri, lampu spiritus, kertas saring, perforator, jarum ose, ph meter, laminar flow, pinset, kapas, kertas alumunium foil, gelas ukur, jangka sorong, autoklaf, timbangan Bahan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah kultur Kombucha (diperoleh dari Pengelolahan dan Pembudidayaan Kultur Teh Kombucha di Jl. Kauman No.50 Peterongan Jombang), Gula Pasir (Merk Gulaku), Teh (Merk Sariwangi), Kopi (diperoleh dari Perkebunan Rakyat desa Tlogosari Kecamatan Tutur Pasuruan), Kelopak Rosela (Balai Mediterania Medica Malang), Bakteri Vibrio cholerae dan Bacillus cereus (diperoleh dari Laboratoriun Kedokteran Universitas Brawijaya Malang), Medium TSA dan TSB. 3.5 Prosedur Penelitian Sterilisasi Alat dan Bahan Semua alat dan bahan yang akan digunakan dalam proses pembuatan kultur kombucha maupun analisa sampel (Uji aktifitas antibakteri) disterilkan terlebih dahulu dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit.

4 Persiapan Bakteri Indikator Persiapan Medium Medium yang digunakan dalam penelitian ini adalah medium TSA dan TSB. Medium TSA digunakan untuk pembiakan bakteri Vibrio cholerae dan Bacillus cereus. Adapun caranya sebagai berikut : 1. Disiapkan media TSA dan TSB sintetik 2. Dimasukkan masing-masing bahan media tersebut kedalam labu erlenmeyer kemudian dipanaskan dan diaduk sampai larutan homogen 3. Dituangkan masing-masing larutan medium pada tabung reaksi sebanyak 10 ml pada medium tegak dan 8 ml pada medium miring kemudian ditutup dengan kapas 4. Medium tegak dan medium miring disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit Medium Cair TSB digunakan untuk pembiakan murni bakteri yang akan diinokulasikan pada medium lempeng. Adapun caranya adalah sebagai berikut : 1. Disiapkan bahan yang akan digunakan untuk membuat medium cair 2. Dimasukkan bahan kedalam labu erlenmeyer kemudian dipanaskan dan diaduk hingga larutan homogen 3. Dituangkan larutan mediun kedalam tabung reaksi sebanyak 10 ml, kemudian ditutup dengan kapas atau alumunium foil 4. Tabung reaksi disterilkan dalam autoklaf dengan tekanan 15 psi selama 15 menit. Setelah itu medium diinkubasi selama 24 jam sebelum digunakan untuk pengujian

5 Persiapan bakteri Perbanyakan bakteri secara akseptik diinokulasikan dengan jarum inokulasi pada permukaan medium miring (TSA) dengan menggunakan jarum inokulum. Kemudian bakteri dipindahkan dari medium miring ke medium cair (TSB), kemudian bakteri dalam medium cair dihomogenkan dan biakan tersebut diinkubasi dalam inkubator pada suhu 30 C selama 24 jam sebelum dilakukan pengujian Peremajaan kultur kombucha Tahap ini bertujuan untuk mengembangkan kultur kombucha yang akan diinokulasikan kedalam medium fermentasi. Proses peremajaan kultur kombucha dilaksanakan sebagai berikut : 1. Tahap Persiapan medium Aquades dipanaskan dalam wadah kaca steril sampai suhu 100 C selama 10 menit, kemudian diukur volumenya masing-masing sebanyak 600 ml dan ditambahkan masing-masing 0,5% (b/v) teh, kopi dan rosela, kemudian ditambahkan gula 10 % (b/v) pada setiap larutan yang telah diseduh kemudian disaring. Medium didinginkan sampai suhu ruang. 2. Tahap Inokulasi Inokulasi dilakukan dengan menambahkan kultur kombucha sebanyak 10% (b/v) kedalam masing-masing seduhan medium yang ditempatkan kedalam wadah kaca steril dan ditutup dengan kain bersih kemudian diikat dengan karet gelang.

6 43 3. Tahap Inkubasi (fermentasi) Hasil peremajaan kultur kombucha (teh, kopi dan rosela) difermentasi selama 14 hari Pembuatan Medium Adapun metode pembuatan medium kombucha (teh, kopi, rosela) adalah sebagai berikut : Pembuatan teh Kombucha 1. Dididihkan 100 ml aquades selama 10 menit, ditambahkan sukrosa (10% b/v) diaduk hingga sukrosa benar-benar larut, kemudian ditambahkan teh (5% b/v). Teh kemudian disaring, dipisahkan dari ampasnya dan didinginkan sampai suhu ruang. 2. Ditempatkan larutan teh dalam gelas ukur. 3. Ditambahkan kultur kombucha (10% b/v) kedalam larutan teh. 4. Wadah larutan teh yang sudah ditambahkan kultur kombucha ditutup rapat dengan kain bersih (digunakan kain untuk mencegah kontaminasi bahanbahan asing kedalam larutan teh, namun udara tetap bisa masuk kedalam larutan teh). 5. Larutan teh difermentasikan selama 3, 6, 9, 12 hari Pembuatan Kombucha Kopi 1. Dididihkan 100 ml aquades selama 10 menit, ditambahkan sukrosa (10% b/v) diaduk hingga sukrosa benar-benar larut, kemudian

7 44 ditambahkan kopi bubuk (5% b/v). Larutan kopi kemudian disaring, dipisahkan dari ampasnya dan didinginkan sampai suhu ruang. 2. Larutan kopi ditempatkan dalam gelas ukur. 3. Ditambahkan kultur kombucha (10% b/v) kedalam larutan kopi. 4. Wadah larutan kopi yang sudah ditambahkan kultur kombucha ditutup rapat dengan kain bersih (digunakan kain untuk mencegah kontaminasi bahan-bahan asing kedalam larutan kopi, namun udara tetap bisa masuk kedalam larutan kopi). 5. Larutan kopi difermentasikan selama 3, 6, 9, 12 hari Pembuatan kombucha Rosela 1. Dididihkan 100 ml aquades selama 10 menit, ditambahkan sukrosa (10% b/v) diaduk hingga sukrosa benar-benar larut, kemudian ditambahkan kelopak rosela kering (5% b/v). Larutan rosela kemudian disaring, dipisahkan dari ampasnya dan didinginkan sampai suhu ruang. 2. Larutan rosela ditempatkan dalam gelas ukur. 3. Ditambahkan kultur kombucha (10% b/v) ditambahkan kedalam larutan rosela. 4. Wadah larutan kopi yang sudah ditambahkan kultur kombucha ditutup rapat dengan kain bersih (digunakan kain untuk mencegah kontaminasi bahan-bahan asing kedalam larutan kopi, namun udara tetap bisa masuk kedalam larutan kopi). 5. Larutan rosela difermentasikan selama 3, 6, 9, 12 hari

8 Pembuatan Paper disk 1. Disiapkan kertas saring 2. Dibuat paper disk dengan pelobang kertas (perforator) kemudian disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121 C selama 15 menit. 3. Paper disk dimasukkan kedalam medium kombucha (teh, kopi, rosela) dengan lama fermentasi yang berbeda. 4. Paper disk direndam dalam medium kombucha (teh, kopi, rosela) selama 30 menit Analisis Ketebalan Nata 1. Ditiriskan nata selama 10 menit 2. Diukur ketebalan nata pada beberapa sisi menggunakan jangka sorong 3. Dihitung rata-rata hasil pengukuran Analisis ph Medium 1. ph meter dinyalakan 2. Dimasukkan elektroda kedalam larutan buffer 4 kemudian dibiarkan sampai stabil 3. Elektroda dibilas dengan aquades kemudian dikeringkan 4. Dimasukkan elektroda kedalam larutan buffer 7 dan dibiarkan sampai stabil 5. Elektroda dibilas dengan aquades kemudian dikeringkan 6. Dimasukkan elektroda kedalam larutan sampel dan dibiarkan sampai stabil 7. Dicatat nilai ph yang ditunjukkan oleh layar

9 Analisis Total Asam Medium 1. Dimasukkan 10 ml sampel kedalam labu ukur 100 ml 2. Ditambahkan aquades hingga tanda batas kemudian disaring 3. Diambil 10 ml filtrat dan dimasukkan ke erlenmeyer 4. Ditambahkan indikator pp 3 tetes 5. Ditritasi dengan larutan NaOH 0,1 N sampai berwarna merah jambu Perhitungan TA = V NaOH x N NaOH x Px BM x 100% Berat sampel x Analisis Total Padatan Terlarut 1. Diambil sampel dengan menggunakan pipet tetes 2. Diletakkan sampel pada prisma refraktometer 3. Ditentukan nilai hasil pengukuran dengan melihat skala yang tertera pada refraktometer Analisis Daya Antibakteri Adapun metode pengujian daya antibakteri medium kombucha adalah sebagai berikut : 1. Disiapkan alat dan bahan yang akan digunakan kedalam laminar flow 2. Dipanaskan media tegak padat pada tabung reaksi hingga mencair kemudian didinginkan sampai suhu 40 C-50 C. 3. Dituangkan media yang telah didinginkan pada cawan petri kemudian ditambahkan bakteri biakan aktif Vibrio cholerae dan Bacillus cereus.

10 47 4. Didiamkan media yang telah ditambahkan biakan bakteri sampai membeku. 5. Diletakkan paper disk yang telah direndam dalam larutan medium kombucha sebanyak 3 buah dengan jarak 1,5 cm dari tepi cawan petri menggunakan pinset steril secara aseptik. 6. Medium lempeng yang telah diberi perlakuan diinkubasi pada suhu kamar selama 1 x 24 jam Pengumpulan Data Data diperoleh dengan mengukur ketebalan nata, analisa ph medium, analisa total asam medium dan diameter zona hambat yang terbentuk, yaitu mengukur diameter zona hambat dengan menggunakan jangka sorong. Diameter zona hambat adalah diameter yang tidak ditumbuhi bakteri disekitar paper disk dikurangi diameter paper disk Analisis Data Data yang diperoleh dianalisis dengan menggunakan uji Anava berganda untuk membuktikan hipotesa yaitu mengetahui potensi medium (teh, kopi, rosela) fermentasi kombucha terhadap bakteri Vibrio cholerae dan jika Bacillus cereus F hitung > F tabel maka dilanjutkan dengan Uji Jarak Duncan (UJD) pada signifikansi 0,05 dan 0.01.

11 Diagram Alir Peremajaan Kultur Kombucha Aquades Direbus hingga mendidih (100 C) selama tiga menit Diambil 100 ml Diseduh 15 menit Dimasukkan 0,5 gr teh, kopi, rosela Disaring Ampas teh, kopi, rosela Ditambahkan gula (sukrosa) 10 % (b/v) Dilarutkan sampai homogen Didinginkan sampai suhu ruang (27 C ±2 C ) Dimasukkan dalam wadah fermentasi (kaca) Diinokulasi kultur kombucha 10 % (b/v) Ditutup kain dan diikat dengan karet gelang Difermentasi selama 2 minggu Kultur kombucha hasil peremajaan Diagram 3.1 Alur Peremajaan Kultur Kombucha

12 Diagram Alir Penelitian Aquades Direbus hingga mendidih (100 C) selama tiga menit Diambil 100 ml Diseduh 15 menit Disaring Dimasukkan 0,5 gr teh, kopi, rosela Ampas teh, kopi, rosela Ditambahkan gula (sukrosa) 10 % (b/v) Dilarutkan sampai homogen Didinginkan sampai suhu ruang (27 C ±2 C ) Dimasukkan dalam wadah fermentasi (kaca) Diinokulasi kultur kombucha 10 % (b/v) Ditutup kain dan diikat dengan karet gelang Difermentasi selama (3,6,9,12) hari Analisa ph, ketebalan nata, total asam,total padatan terlarut, antibakteri Hasil Diagram 3.2 Alur Metode Penelitian