BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Bahan dan Alat Metode Penelitian

Transkripsi

1 14 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian dilakukan pada bulan Oktober 2009 sampai dengan bulan Juni 2011 di Laboratorium Kultur Jaringan Kelompok Peneliti Biologi Sel dan Jaringan, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian Bogor (BB-Biogen Bogor) dan Laboratorium Kultur Jaringan, Departemen Agronomi dan Hortikultura Fakultas Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Bahan dan Alat Bahan tanam (eksplan) yang digunakan dalam penelitian ini adalah janggle bunga terubuk, buku batang setek tanaman terubuk, daun muda yang masih menggulung, dan akar. Tanaman terubuk diambil dari Kampung Banyuwangi, Cigudeg, Bogor, yang telah diperbanyak dengan menggunakan setek di dalam polybag selama 4 bulan, sedangkan bunga terubuk didapat dari beberapa pasar tradisional di sekitar Bogor. Media yang digunakan untuk perlakuan dalam penelitian ini adalah media dasar Murashige dan Skoog (MS). Bahan-bahan kimia yang digunakan adalah aquades, komponen dari media dasar MS, 30 g l -1 sukrosa, dan bahan pemadat berupa 2 g l -1 phytagel. Zat pengatur tumbuh (ZPT) yang digunakan ke dalam media sebagai perlakuan berupa 2,4-D, Kinetin, Thidiazuron, NAA, BAP dan GA 3. Bahan untuk sterilisasi eksplan adalah Agrept, Dithane-45, Alkohol, Bayclin dan Betadin. Peralatan yang digunakan adalah Laminar Air Flow Cabinet (LAFC), autoklaf, mikropipet, alat-alat diseksi (pinset, gunting, dan skalpel), ph meter, botol kultur, peralatan gelas, bunsen dan sprayer. Metode Penelitian Penelitian ini terdiri atas lima tahapan, yaitu: 1. Eksplorasi eksplan terubuk dan sterilisasi ekplan 2. Induksi kalus 3. Induksi tunas

2 15 4. Elongasi dan induksi akar 5. Aklimatisasi Persiapan Bahan Tanam Dilakukan persiapan bahan tanam sebagai sumber eksplan yaitu penanaman setek tanaman terubuk di dalam polibag (Gambar 4) yang dilaksanakan pada bulan Oktober Sekitar 3 ruas batang digunakan sebagai sumber eksplan in vivo. Tunas yang tumbuh dari ruas batang kemudian disterilisasi dan ditumbuhkan secara in vitro pada media prekondisi untuk mendapatkan sumber eksplan in vitro. Gambar 4 Setek tanaman terubuk dalam polibag Sterilisasi Eksplan Proses sterilisasi awal dilakukan di luar laminar air flow cabinet, dengan mencuci dan menyikat lembut bunga, tunas, daun tua, daun muda yang masih menggulung dan akar terubuk menggunakan air yang mengalir dan direndam dalam larutan sabun selama 10 menit, kemudian direndam dengan larutan Agrept dan Dithane-45 masing-masing 0,2% selama ± 1 jam. Kegiatan sterilisasi di dalam laminar berbeda untuk setiap bahan tanam.

3 16 Tahapan sterilisasi pada bunga terubuk di dalam laminar adalah dengan menyemprotkan alkohol 96% ke seluruh bagian bunga. Bunga kemudian dibakar di atas bunsen beberapa kali. Penanaman dilakukan dengan membuka atau mengupas kelobot bunga sampai habis (Gambar 5A). Bagian janggle bunga terubuk (Gambar 5B) dipotong menjadi beberapa bagian berukuran ± 1 cm. A B Gambar 5 Potongan bunga terubuk: A. potongan melintang bunga terubuk; B. bagian janggle bunga Tahapan sterilisasi pada tunas di dalam laminar adalah dengan merendam eksplan dalam Bayclin 30% selama 15 menit, membilas ke dalam aquades steril sebanyak 3 kali, dilanjutkan dengan merendam eksplan ke dalam Bayclin 10% selama 30 menit, kemudian membilas ke dalam aquades steril sebanyak 3 kali, dan terakhir dengan merendam ke dalam larutan Betadine selama 30 menit (Gambar 6A). Penanaman dilakukan dengan membuka atau mengupas beberapa lapis tunas (Gambar 6B). Tunas terubuk dipotong menjadi beberapa bagian berukuran ± 1 cm.

4 17 A B Gambar 6 Tunas terubuk: A. tahap sterilisasi; B. dalam botol kultur Tahapan sterilisasi pada daun yang masih menggulung dalam tunas di dalam laminar adalah dengan merendam eksplan dalam Bayclin 30% selama 10 menit, membilas ke dalam aquades steril sebanyak 3 kali, dilanjutkan dengan merendam eksplan ke dalam Bayclin 20% selama 5 menit, kemudian membilas ke dalam aquades steril sebanyak 3 kali. Daun terubuk dipotong menjadi beberapa bagian berukuran ± 1 cm. Tahapan sterilisasi pada akar terubuk di dalam laminar adalah dengan merendam eksplan dalam alkohol 96% selama 3 menit, membilas ke dalam aquades steril sebanyak 3 kali, dilanjutkan dengan merendam eksplan ke dalam alkohol 70% selama 3 menit, kemudian membilas ke dalam aquades steril sebanyak 3 kali, dan terakhir dengan merendam ke dalam larutan Betadin selama 5 menit. Masing-masing media terdiri atas 4 botol, 1 botol berisi 2 eksplan. Kultur diinkubasi pada suhu 22±3 0 C dalam ruang gelap untuk induksi kalus dan dalam kondisi terang untuk induksi tunas dan akar.

5 18 Pembuatan Media Tanam In Vitro Media tanam in vitro yang digunakan dalam penelitian ini terdiri atas dua jenis berdasarkan tujuan pengunaannya, yaitu media prekondisi dan media perlakuan. Media prekondisi digunakan untuk mengetahui tingkat kesterilan bahan tanam sebelum dijadikan eksplan in vitro. Hyponex digunakan sebagai media prekondisi karena mengandung beberapa unsur hara yang dapat mendukung pertumbuhan eksplan pada awal pertumbuhan. Media perlakuan yang digunakan adalah media dasar MS yang ditambah dengan beberapa macam ZPT sesuai dengan tahapan penelitian. Media Hyponex 0.2% dibuat dengan menimbang Hyponex sebanyak 2 g yang ditambah dengan vitamin dan myo-inositol dengan konsentrasi yang sama seperti dalam media MS, kemudian dilarutkan dalam 1 l aquades. Media MS dibuat dengan mengambil setiap komponen media MS (Lampiran 1) dari larutan stok yang telah dibuat sebelumnya. Semua media yang digunakan ditambahkan dengan 30 g l -1 sukrosa, dan 2 g l -1 phytagel, dengan ph 5.8. Media yang telah dibuat kemudian dimasukkan ke dalam botol kultur steril yang kemudian disterilisasi menggunakan autoklaf pada suhu 121 o C dan tekanan 17,5-20 psi selama 10 menit. Induksi Kalus Prosedur Pelaksanaan Percobaan ini menggunakan rancangan acak lengkap satu faktor, berupa konsentrasi ZPT 2,4-D dengan dan tanpa tambahan 0,1 mg l -1 kinetin. Setiap perlakuan ditambahkan dengan 100 mg l -1 kasein hidrolisat. Komposisi media untuk induksi kalus yaitu: 1. MS0 (kontrol) 2. MS + 1 mg l -1 2,4-D 3. MS + 3 mg l -1 2,4-D 4. MS + 5 mg l -1 2,4-D 5. MS + 1 mg l -1 2,4-D + 0,1 mg l -1 kinetin 6. MS + 3 mg l -1 2,4-D + 0,1 mg l -1 kinetin

6 19 7. MS + 5 mg l -1 2,4-D + 0,1 mg l -1 kinetin Eksplan yang digunakan adalah janggle terubuk yang telah dipotong menjadi beberapa bagian (ukuran eksplan ± 1 cm). Setiap perlakuan diulang sebanyak 4 kali, dalam setiap satuan percobaan terdiri atas 1 botol kultur yang berisi 2 eksplan, sehingga terdapat 28 satuan percobaan. Eksplan dengan konsentrasi ZPT yang terbaik untuk induksi kalus, disubkultur terus setiap 4 minggu pada medium yang sama selama 12 minggu. Kultur dipelihara dalam ruang kultur gelap dengan suhu 25⁰C. Rancangan Model linear aditif yang digunakan dalam percobaan ini adalah sebagai berikut (Mattjik & Sumertajaya 2006) : Y ij = µ + α i + ε i Dimana: i = 1, 2,...,7 dan j = 1, 2, 3 Y ijk : Pengamatan pada konsentrasi ZPT ke-i µ : Rataan umum α i ε ij : Pengaruh konsentrasi ZPT ke-i : Pengaruh galat percobaan perlakuan ZPT ke-i. Pengamatan Pengamatan dilakukan terhadap peubah waktu muncul kalus (minggu setelah tanam atau MST) yang dilakukan setiap minggu, persentase jumlah eksplan yang membentuk kalus (%) dan bobot basah kalus (g) yang diamati pada akhir pengamatan. Analisis Data Data dianalisis dengan menggunakan analisis ragam (uji F) pada taraf nyata (α) 5% dengan menggunakan program SAS 9.1. Jika uji F menunjukkan beda nyata, dilanjutkan dengan uji jarak berganda Duncan (DMRT).

7 20 Induksi Tunas Prosedur Pelaksanaan Percobaan ini menggunakan media induksi kalus terbaik pada percobaan pertama (3 mg l -1 2,4-D + 0,1 mg l -1 kinetin). Dilanjutkan subkultur ke media induksi tunas (yang telah ditambahkan 0,1 mg l -1 NAA dan 0,25 mg l -1 GA 3 ), sebagai berikut: 1. MS + 1 mg l -1 BAP 2. MS + 3 mg l -1 BAP 3. MS + 5 mg l -1 BAP 4. MS + 0,5 mg l -1 kinetin 5. MS + 1 mg l -1 kinetin 6. MS + 1,5 mg l -1 kinetin 7. MS + 0,25 mg l -1 Thidiazuron 8. MS + 0,5 mg l -1 Thidiazuron 9. MS + 1 mg l -1 Thidiazuron Eksplan yang digunakan adalah janggle terubuk yang telah dipotong menjadi beberapa bagian (ukuran eksplan ± 1 cm). Setiap perlakuan diulang sebanyak 4 kali sehingga terdapat 36 satuan percobaan. Kultur dipelihara dalam ruang kultur dengan fotoperiodisitas 24 jam terang, suhu 25⁰C dan intensitas cahaya 1500 lux. Tunas yang berasal dari media induksi tunas aksilar terbaik ditumbuhkan pada media yang sama untuk multiplikasinya selama 8 minggu. Pengamatan Pengamatan dilakukan terhadap waktu muncul tunas (MST), jumlah tunas yang terbentuk dan ukuran tunas.

8 21 Elongasi Tunas dan Induksi Akar Tunas yang berukuran besar (1-3 cm) disubkultur ke media MS (kontrol) untuk pemanjangan tunas dan pembentukan akar. Kultur dipelihara dalam ruang kultur dengan fotoperiodisitas 24 jam terang, suhu 25⁰C dan intensitas cahaya 1500 lux. Tunas ditumbuhkan pada media yang sama selama 12 minggu. Aklimatisasi Setelah tunas membentuk akar, planlet dipindahkan ke media aklimatisasi. Akar dicuci lembut dengan air untuk memisahkan akar dari media agar. Media tanam yang digunakan dalam aklimatisasi berupa campuran arang sekam, tanah dan kompos dengan perbandingan 1:1:1. Selama aklimatisasi, media tanam disiram dengan media MS ½.