BAHAN DAN METODE. Penelitian dilaksanakan pada bulan Mei-Agustus Uji potensi

Transkripsi

1 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan pada bulan Mei-Agustus Uji potensi mikroba pelarut fosfat dilakukan di Laboratorium Biologi Tanah, Program Studi Agroekoteknologi, Fakultas Pertanian,. Bahan dan Alat Bahan yang digunakan adalah isolat bakteri pelarut fosfat dan jamur pelarut fosfat koleksi Laboratorium Biologi Tanah Program Studi Agroekoteknologi Fakultas Pertanian, media Pikovskaya dengan sumber P yang berbeda yaitu Ca 3 PO 4, AlPO 4, FePO 4, dan batuan fosfat, akuades, agar-agar, NaOH 0,1%, HCL 0,1%, alkohol 96%, kapas, aluminium foil, plastik wrap, label, kertas, dan tisu. Alat yang digunakan adalah petridish Ø 10 cm, Erlenmeyer 1000 ml, 500 ml, dan 250 ml, pipet tetes, pipet skala, autoklaf, kompor gas, jarum ose, sprayer, tabung reaksi, timbangan, inkubator, gelas ukur 100 ml, bunsen, oven, laminar air flow, korek api, sentrifus, ph meter, batang pengaduk, baki, serbet, masker, sarung tangan, alat tulis, kamera digital, dan baju laboratorium. Prosedur Penelitian 1. Uji potensi pada media padat Bakteri pelarut fosfat (BPF) dan jamur pelarut fosfat (JPF) yang telah diremajakan (Lampiran 5) diuji kemampuannya melarutkan fosfat dalam cawan petridish yang berisi media pikovskaya padat steril. Cara dan bahan yang digunakan dalam pembuatan media uji ini sama dengan pembuatan media

2 pikovskaya pada tahap isolasi, namun diganti dengan beberapa sumber P yaitu Ca 3 (PO 4 ) 2 dengan dosis 5 g/l media, AlPO 4 dengan dosis 5 g/l media, FePO 4 dengan dosis 5 g/l media, dan batuan fosfat dengan dosis 5 g/l media. Media Pikovskaya padat steril dituang secukupnya sampai menutupi permukaan petridish dan ditunggu mengeras. Isolat bakteri pelarut fosfat dan jamur pelarut fosfat diinokulasikan dan pada media uji dan diinkubasi selama 5 (lima) hari. Tiap biakan murni dilakukan sebanyak 3 ulangan. Selama masa pengujian diamati ukuran zona bening dan koloni yang tumbuh pada media. Parameter uji potensi pada media padat adalah bakteri pelarut fosfat dan jamur pelarut fosfat yang membentuk zona bening (holozone) paling cepat secara kualitatif dan zona bening yang secara kuantitatif menunjukkan diameter paling besar di sekitar koloni menunjukkan besar kecilnya potensi bakteri pelarut fosfat dan jamur pelarut fosfat dalam melarutkan unsur P dari bentuk yang tidak larut. Dihitung potensi dengan menggunakan indeks pelarutan (IP) P yaitu : 2. Uji potensi pada media cair IP = DZB DK Keterangan : DZB = diameter zona bening (cm) DK = diameter koloni bakteri atau jamur pelarut fosfat (cm) Media Pikovskaya cair steril dengan sumber P dari Ca 3 (PO 4 ) 2, AlPO 4, FePO 4, dan batuan fosfat dimasukkan ke dalam erlenmeyer sebanyak 100 ml. Isolat bakteri pelarut fosfat dan jamur pelarut fosfat diinokulasikan pada media uji dan diinkubasi selama 14 (empat belas) hari. Setelah masa inkubasi, media uji disaring dan disentrifus dengan kecepatan 8000 rpm selama 15 menit sampai pemisahan antara filtrat dan endapan bakteri pelarut fosfat dan jamur pelarut

3 fosfat terjadi. Diukur ph filtrat dan dihitung kandungan P-tersedia dengan Bray-II dan metode kolorimetri dengan panjang gelombang 660 nm. Parameter uji potensi pada media cair adalah mengukur kandungan P- tersedia dengan mengambil fitrat menggunakan pipet tetes dan ph untuk mengetahui pengaruh pelarutan fosfat oleh bakteri dan jamur terhadap ph media. Uji potensi pada media cair menggunakan Rancangan Acak Lengkap Faktorial dengan tiga kali ulangan dan dua faktor perlakuan, yaitu : 1. Faktor I : isolat pelarut fosfat I1 = Pseudomonas sp.1 I2 = Aspergillus sp.3 I3 = Penicillium sp. 1 I4 = Aspergillus sp.1 I5 = Aspergillus sp.6 2. Faktor II : sumber fosfat P1 = Ca 3 (PO 4 ) 2 P2 =AlPO 4 P3 = FePO 4 P4 = Batuan Fosfat Sehingga diperoleh kombinasi perlakuan adalah sebagai berikut : I1P1 I2P1 I3P1 I4P1 I5P1 I1P2 I2P2 I3P2 I4P2 I5P2 I1P3 I2P3 I3P3 I4P3 I5P3 I1P4 I2P4 I3P4 I4P4 I5P4

4 Dengan demikian jumlah perlakuan (5 x 4) x 3 = 60 satuan percobaan. Model linear Rancangan Acak Lengkap (RAL) faktorial yang digunakan dalam percobaan ini adalah sebagai berikut : Yij(k) = µ + αi + βj + αβ + ijk Keterangan : Yij(k) = Nilai pengamatan pada perlakuan isolat ke i, pada sumber fosfat ke-j, dan interaksi isolat ke-i dan sumber fosfat ke-j µ = Nilai rataan umum αi = pengaruh perlakuan isolat ke-i βj = pengaruh perlakuan berbagai sumber fosfat ke-j (αβ)ij = pengaruh interaksi perlakuan isolat ke-i dan berbagai sumber fosfat ke-j ijk = pengaruh galat dari perlakuan isolat ke-i, berbagai sumber ke-j, dan interaksi isolat ke-i dan berbagai sumber fosfat ke-j. Untuk mengetahui pengaruh dari setiap perlakuan maka dilakukan analisis sidik ragam (anova). Apabila F-hitung nyata dilanjutkan dengan uji lanjutan berdasarkan uji jarak DMRT (Duncan Multiple Range Test).

5 HASIL DAN PEMBAHASAN Uji Potensi Pada Media Padat Seleksi kemampuan mikroba pelarut fosfat dalam melarutkan FePO 4, AlPO 4, Ca 3 (PO 4 ) 2 dan Batuan Fosfat seperti pada Tabel 1. Tabel 1. Nilai indeks pelarutan fosfat dari pengujian media padat dengan berbagai sumber P setelah inkubasi 5 hari Isolat Sumber P Ca 3 (PO 4 ) 2 Batuan AlPO 4 FePO 4 Rata-Rata Fosfat Pseudomonas sp.1 1,20 1,18 0,35 1,2 0,98 Pseudomonas sp.2 0,82 0,62 1,01 0,88 0,83 Aspergillus sp.3 0,68 1,26 1,13 1,00 1,02 Penicillium sp.1 0,56 1,16 0,96 1,00 0,92 Penicillium sp.2 0,5 0,73 1,24 0,69 0,79 Penicillium sp.3 0,93 1,23 0,67 0,56 0,85 Aspergillus sp.1 1,95 0,67 1,21 1,00 1,21 Aspergillus sp.2 0,84 0,50 1,07 0,64 0,76 Aspergillus sp.4 0,85 0,63 0,71 0,56 0,69 Aspergillus sp.5 0,14 0,56 1,2 0,94 0,71 Aspergillus sp.6 1,10 0,79 0,56 1,06 0,88 Aspergillus sp.7 0,69 0,62 0,68 0,83 0,71 Indeks pelarutan P menunjukkan bahwa kemampuan mikroba dalam melarutkan fosfat bervariasi. Luas zona bening secara kualitatif menunjukkan besar kecilnya kemampuan mikroba melarutkan P dari fosfat tak larut. Secara kuantitatif, kemampuan mikroba pelarut fosfat dalam melarutkan P dapat dilakukan dengan mengukur diameter zona bening dan mengukur indeks pelarutan (IP). Diameter zona bening yang dihasilkan menunjukkan kemampuan mikroba pelarut fosfat dalam melarutkan P. Untuk mengukur indeks pelarutan, diameter zona bening dibagi diameter koloni. Semakin tinggi nilai indeks pelarutan yang dihasilkan, maka kemampuan mikroba pelarut fosfat dalam melarutkan P juga tinggi.

6 Berdasarkan hasil pengukuran indeks pelarutan fosfat (Tabel 1) terlihat bahwa keduabelas (12) isolat mampu melarutkan P dari sumber Batuan fosfat, FePO 4, dan AlPO 4 dengan nilai indeks pelarutan yang berbeda, namun hanya satu isolat yang tidak mampu melarutkan fosfat dari sumber Ca 3 (PO 4 ) 2. Mikroba pelarut fosfat yang paling besar indeks pelarutan fosfatnya dalam melarutkan Ca 3 (PO 4 ) 2 adalah Aspergillus sp.1 sebesar 1,95. Indeks pelarutan terbesar dari sumber Batuan fosfat adalah Aspergillus sp.3 sebesar 1,26. Dari sumber AlPO 4 indeks pelarutan terbesar ditunjukkan oleh Penicillium sp.2 sebesar 1,24, dan dari sumber FePO 4 indeks pelarutan ditunjukkan oleh Pseudomonas sp.1 sebesar 1,2. Hal ini menunjukkan seluruh isolat mikroba pelarut fosfat yang diamati memiliki efektivitas dalam melarutkan P pada media pikovskaya padat. Setelah dilakukan pengamatan pada media pikovskaya padat berbagai sumber P selama 5 hari, diketahui bahwa pelarutan P oleh mikroba pelarut fosfat dari batuan fosfat rata-rata nilainya lebih kecil dibandingkan dengan pelarutan P dari sumber lainnya yaitu sebesar 0,83. Hal ini dikarenakan Batuan fosfat merupakan fosfat alam yang sukar larut, sehingga isolat menghasilkan indeks pelarut (IP) yang kecil. Hal ini sesuai dengan pernyataan Widawati dan Suliasih (2006) bahwa pelarutan P alam/rock phosphate membutuhkan waktu lebih lama dari P kimia, tetapi lebih ramah terhadap lingkungan. Berdasarkan Goenadi dan Saraswati (1994), pada pengujian di media padat tampak pertumbuhan tiap mikroba pelarut fosfat berbeda-beda, yang disebabkan beberapa hal antara lain :

7 1. Fraksi Ca 3 (PO 4 ) 2, batuan fosfat, AlPO 4 dan FePO 4 dalam media padat yang tidak merata dalam petri mempengaruhi holozone yang terbentuk. 2. Ketebalan media yang tidak seragam di dalam cawan akan mempengaruhi holozone yang terbentuk. Fraksi Ca 3 (PO 4 ) 2, batuan fosfat, AlPO 4 dan FePO 4 pada media yang lebih tebal tentunya lebih sulit untuk dilarutkan daripada media yang tipis. 3. Mikroba pelarut fosfat ada yang mampu tumbuh dengan cepat dan ada mikroba yang tumbuh lambat. Diketahui dari Tabel 1 dapat diperoleh isolat-isolat yang akan diuji lanjut pada media cair. Isolat yang akan diuji lanjut dilihat dari nilai rataan yang paling besar indeks pelarutan fosfatnya dalam melarutkan Ca 3 (PO 4 ) 2, Batuan Fosfat, AlPO 4, dan FePO 4 dan didapatkan 5 isolat yaitu Bakteri 1, Penicillium sp.1, Aspergillus sp.1, Aspergillus sp.3, dan Aspergillus sp.6. Uji Potensi Pada Media Cair Setelah dilakukan pengujian pada media pikovskaya padat terpilih 5 isolat yang memiliki nilai indeks pelarutan (IP) yang tinggi, sehingga dilakukan pengujian pada media pikovskaya cair. Hal ini dikarenakan aktivitas masingmasing isolat pelarut fosfat yang tumbuh pada medium padat berbeda dengan aktivitas pada medium cair. Kemampuan bakteri pada medium cair dapat dipengaruhi oleh aerasi dan lamanya waktu inkubasi. Menurut Fankem et al. (2006), aktivitas bakteri dalam melarutkan P pada media padat dan cair tidak mutlak sama. Kriteria zona bening tidak cukup untuk menentukan kemampuan bakteri dalam melarutkan P. Jumlah mikroba yang banyak juga belum tentu memiliki kemampuan yang tinggi dalam melarutkan P.

8 Pengujian kemampuan mikroba pelarut fosfat dalam melarutkan FePO 4, AlPO 4, Ca 3 (PO 4 ) 2 dan Batuan Fosfat pada media pikovskaya cair dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2. Kemampuan isolat dalam melarutkan berbagai sumber fosfat dalam media Pikovskaya cair Isolat Sumber P Ca 3 (PO 4 ) 2 Batuan Fosfat AlPO 4 FePO 4 P-tersedia (ppm) Pseudomonas sp.1 32,62 34,17 29,48 9,53 Aspergillus sp.3 36,91 22,33 34,47 15,54 Penicillium sp.1 45,15 33,43 37,66 19,24 Aspergillus sp.1 42,48 23,44 48,58 28,34 Aspergillus sp.6 42,8 32,08 39,72 6,97 Rata-Rata 39,99 b 29,09 ab 37,98 ab 15,92 a Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada baris yang sama tidak berbeda nyata pada taraf 5% Hasil uji lanjut menunjukkan bahwa interaksi antara isolat dengan sumber P tidak berbeda nyata, tetapi pada faktor sumber P berbeda nyata. Tabel 2 menunjukkan bahwa sumber Ca 3 (PO 4 ) 2 berbeda nyata dengan sumber FePO 4 tetapi tidak berbeda nyata dengan sumber Batuan Fosfat dan AlPO 4. Tabel 2 menunjukkan bahwa kemampuan mikroba pelarut fosfat dalam melarutkan P di media pikovskaya cair berbagai sumber P berbeda-beda. Mikroba pelarut fosfat yang paling besar P-tersedianya dalam melarutkan Ca 3 (PO 4 ) 2 adalah Penicillium sp.1 sebesar 45,15 ppm. Mikroba pelarut fosfat yang paling besar P- tersedianya dalam melarutkan batuan fosfat adalah Pseudomonas sp.1 sebesar 34,17 ppm. Mikroba pelarut fosfat yang paling besar P-tersedianya dalam melarutkan AlPO 4 adalah Aspergillus sp.1 sebesar 48,58 ppm, sedangkan mikroba pelarut fosfat yang paling besar P-tersedianya dalam melarutkan FePO 4 adalah Aspergillus sp.1 sebesar 28,34 ppm. Rata-rata kemampuan pelarutan sumber P (Tabel 2) mulai dari yang terbesar yaitu Ca 3 (PO 4 ) 2 sebesar 39,99 ppm, diikuti oleh AlPO 4 sebesar 37,98

9 ppm, batuan fosfat sebesar 29,09 ppm, dan terkecil yaitu FePO 4 sebesar 15,92 ppm. Hal ini sesuai dengan Premono (1994) yang menyatakan bahwa urutan kemudahan fosfat terlepas mengikuti urutan Ca 3 (PO 4 ) 2 > AlPO 4 > Batuan fosfat > FePO 4. Selain pengukuran P-tersedia, pelarutan fosfat pada media pikovskaya cair dapat diketahui dari ph media, seperti pada Tabel 3. Tabel 3. Pengukuran ph pada media cair pikovskaya setelah inkubasi 14 hari Isolat Sumber P Ca 3 (PO 4 ) 2 Batuan Fosfat AlPO 4 FePO 4 0 hari 14 hari 0 hari 14 hari 0 hari 14 hari 0 hari 14 hari Kontrol 3,7 3,86 3,46 2,35 Pseudomonas sp.1 6,92 5,33 6,92 3,67 6,92 2,9 6,92 2,45 Aspergillus sp.3 3,93 5,72 2,95 2,35 Penicillium sp.1 4,39 3,4 2,96 2,5 Aspergillus sp.1 5,7 5,8 2,89 2,55 Aspergillus sp.6 5,22 2,96 2,89 2,5 Dari Tabel 3 diketahui bahwa ph media pikovskaya cair sebelum mikroba diinokulasi dengan ph media pikovskaya cair setelah diinokulasi mikroba pelarut fosfat selama 14 hari mengalami penurunan. Penurunan ph pada inokulan cair menandakan bahwa telah terjadi pelarutan fosfat. Hal ini sesuai dengan pernyataan Mihalache et al. (2015) bahwa nilai ph pada media pikovskaya cair dengan sumber Ca 3 (PO 4 ) 2 menurun dari 7,03 menjadi 4,92 pada hari ketujuh. Pengamatan itu menunjukkan bahwa pelarutan P meningkat (19,5 μg P/ml) diikuti dengan penurunan ph media (4,92). Menurut Widawati dan Muharam (2012), penurunan ph terjadi karena pada proses pelarutan P terikat oleh bakteri pelarut fosfat terjadi proses oksidasi, reduksi, dan kompetisi ligan organik dan hasil dari sintesis senyawa organik dilepas ke dalam inokulan cair (media pikovskaya).

10 Penurunan ph media menandakan bahwa terjadi pelarutan P oleh mikroba pelarut fosfat, dimana mikroba pelarut fosfat mengeluarkan asam-asam organik sehingga ph media menjadi semakin masam. Menurut Poeponegoro (2005) mengatakan bahwa meningkatnya asam-asam organik tersebut diikuti dengan penurunan ph. Penurunan ph ini diduga akibat pembebasan sejumlah asam-asam organik oleh mikroba pelarut fosfat. Hal ini merupakan bentuk adaptasi mikroba pelarut fosfat terhadap media yang mengandung P terikat yang lebih tinggi dari P terlarut. Menurut Jang dan Suh (2002), terdapat korelasi negatif antara ph dengan pelarutan P, dimana penurunan ph sejalan dengan penaikan pelarutan P. Hubungan antara ph dengan P terlarut dimana pelarutan P tergantung dari banyaknya dan jenis asam organik yang dikeluarkan oleh isolat MPF tersebut yang ditandai dengan penurunan ph. Pada uji media padat diperoleh 5 isolat yang memiliki kemampuan paling besar dalam melarutkan P dari berbagai sumber. Isolat tersebut kemudian diuji pada media pikovskaya cair dan diketahui isolat yang memiliki rata-rata paling besar dalam melarutkan P dari sumber Ca 3 (PO 4 ) 2, Batuan fosfat, AlPO 4 dan FePO 4 jenis Penicillium sp 1 dan Aspergillus sp 1. Hal ini sesuai dengan Sanjotha et al. (2011) yang mengatakan bahwa berdasarkan hasil percobaan pelarutan fosfat di laboratorium, diketahui bahwa jamur memiliki potensi pelarutan fosfat lebih efisien dibanding bakteri.

11 KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan Pseudomonas sp.1, Penicillium sp.1, Aspergillus sp.1, Aspergillus sp.3, dan Aspergillus sp.6 merupakan isolat yang memiliki nilai rataan yang paling besar indeks pelarutan fosfatnya dalam melarutkan P dari sumber Ca 3 (PO 4 ) 2, Batuan Fosfat, AlPO 4, dan FePO 4. Isolat yang memiliki potensi pelarutan P paling besar, yaitu Penicillium sp.1 dengan sumber Ca 3 (PO 4 ) 2 sebesar 45,15 ppm dan Aspergillus sp.1 dengan sumber AlPO 4 sebesar 48,58 ppm dan sumber FePO 4 sebesar 28,34 ppm. Saran 1. Penicillium sp. 1 dan Aspergillus sp. 1 perlu dilakukan pengujian lanjutan ke tanaman secara langsung untuk mengetahui kemampuan mikroba pelarut fosfat dalam melepaskan ikatan P pada tanah sehingga menjadi P tersedia bagi tanaman. 2. Perlu dilakukan pengujian lanjutan ke tanah secara langsung dari 5 isolat yang diuji untuk mengetahui perbedaan potensi isolat dalam melarutkan P pada pengujian laboratorium dengan pengujian langsung pada tanah.