33 III. BAHAN DAN METODE 3.1 WAKTU DAN TEMPAT Pelaksanaan penelitian dilakukan di Pusat Pengujian Obat dan Makanan Nasional Badan POM Jl.Percetakan Negara No.23 Jakarta, dari bulan April sampai dengan Agustus 2012. 3.2 ALAT DAN BAHAN Bahan yang diperlukan untuk penelitian mencakup 3 merk sampel uji produk susu bubuk skim yang diklaim mengandung Imunoglobulin G (Bovine immunoglobulin G) yaitu susu bubuk skim sampel A: kadar IgG 150mg/15g, sampel B: kadar IgG 180mg/15g dan sampel C: kadar IgG 200mg/15g, tercantum pada Lampiran1. Reagen yang digunakan untuk pengujian IgG adalah kit ELISA komersial yaitu Zeptometrix Immuno-Tek Bovine IgG sandwich ELISA kit. Immuno-Tek Bovine IgG ELISA kit merupakan gabungan bahan-bahan yang terdiri dari: microplate (1x96 well) pre coated with purified goat anti-bovine IgG (Antibodi terhadap bovine IgG yang berasal dari kambing), Detector antibody (12 ml) berisi conjugated goat anti-bovine IgG peroxydase, Bovine IgG standard 125ng/ml (5ml): Assay diluent (100 ml) berisi campuran PBS, triton X-100 @ dan 2-chloroacetamide, Plate wash Buffer (125 ml) berisi campuran PBS, Tween 20 @ dan 2-chloroacetamide, Substrat (12 ml) berisi Tetramethyl Benzidine (TMB), Stop solution (12 ml) proprietary formulation (hydrochloric acid), air suling. Microplate detektor antibodi yang disediakan dalam kit telah dioptimasi agar bereaksi seimbang dengan semua subklas dari bovine IgG. Alat yang digunakan antara lain, microplate dan tutup plastik, pipet mikro, tabung mikro dan rak, tips, pipet mikro, gelas Erlenmeyer, labu volumetrik, pipet volumetrik, ELISA reader (Thermo Scientific Multiskan GO UV/Vis Microplate and Cuvette), disposable gloves, inkubator dengan suhu 37±1 C, dan timer (telah terintegrasi pada ELISA reader).
34 3.3 METODE PENELITIAN Metode penelitian meliputi 2 tahap, tahap pertama adalah uji pendahuluan untuk menetapkan kurva baku dari standar bovine IgG dan mencari kadar optimum sampel susu bubuk skim yang digunakan pada validasi pengujian. Tahap kedua adalah validasi metode analisis kadar IgG dalam susu bubuk yang dilaksanakan dengan parameter uji linieritas dan rentang, uji presisi, uji akurasi, limit deteksi dan limit kuantitasi dan spesifisitas. Pengujian kadar IgG dalam susu bubuk skim dilakukan terhadap 3 sampel susu bubuk yang mengandung IgG yang beredar dengan kadar yang berbeda (kadar IgG :Sampel A: 150 mg/15g, sampel B: 180 mg/15g dan sampel C: 200 mg/15g). 3.3.1 PEMBUATAN KURVA BAKU DAN KALIBRASI KURVA BAKU Kurva baku harus dikalibrasi sebelum digunakan karena kurva baku merupakan suatu fungsi dari rentang nilai analisis, yang akan berhubungan dengan respon analit (Chan, 2004), baku yang digunakan adalah larutan standar bovine IgG yang tersedia dalam kit reagen ELISA dengan kadar larutan stok 125ng/ml. Seri larutan baku dibuat dengan mengencerkan larutan standar bovine IgG (125ng/ml) dengan assay diluent pada kadar: 125 ng/ml; 62.5 ng/ml; 31.25 ng/ml; 15.6 ng/ml; 7.8 ng/ml; dan 0 ng/ml. Kalibrasi kurva baku dengan membuat suatu seri larutan standar, replikasi 7 kali dan pembacaan hasil dilakukan 10 kali dengan rentang waktu pembacaan setiap 5 detik. Kurva baku yang valid diperoleh jika nilai r hasil pengukuran 0,95. Larutan pencuci (wash bufer) dilakukan pengenceran dengan air suling dengan perbandingan 1:10. Prosedur ELISA dilakukan mengacu pada prosedur dari manual kit Zeptometrix (2010). Prosedur uji dilakukan dengan cara menyiapkan microplate dan dipipet 200 µl larutan standar ke dalam sumuran (dilakukan duplo), microplate kemudian di tutup dengan tutup plastik, dan ditempatkan pada ELISA reader dan diinkubasi selama 30 menit pada
35 suhu 37 o C. Microplate dicuci dengan wash buffer menggunakan volume 300 µl tiap sumuran sebanyak 4x dan dikeringkan dengan cara membalik balik secara kuat microplate hingga tidak ada lagi droplet pada sumuran. Sejumlah 100 µl detector antibody ditambahkan ke dalam sumuran yang berisi larutan standard an sampel, microplate ditutup kembali. Microplate ditempatkan pada ELISA reader dan diinkubasi pada suhu 37 o C selama 30 menit. Pencucian kedua dilakukan dengan wash buffer dengan volume 300 µl tiap sumuran sebanyak 4x dan dikeringkan. Sebanyak 100 µl substrat (larutan berisi TMB) ditambahkan ke dalam semua sumuran termasuk ke dalam sumuran larutan standar bovine IgG dan blanko. Microplate diinkubasi pada suhu ruang selama 30 menit, akan terbentuk warna biru. Semua sumuran ditambahkan 100 µl stop solution, akan terjadi perubahan warna menjadi kuning. Microplate ditempatkan dan dilakukan pembacaan pada ELISA reader pada panjang gelombang 450 nm dalam rentang waktu 15 menit. Berdasarkan densitas optik yang diperoleh, dibuat kurva baku dari rata rata densitas optik masing masing pengukuran pada semua sumuran. Analisis hasil dilakukan dengan program SkanIt Software dari Multiskan GO, Thermo scientific, kemudian dianalisis secara statistik melalui spreadsheet Excel. 3.3.2 PENETAPAN KADAR OPTIMUM IgG DALAM SAMPEL SUSU BUBUK SKIM Pada penetapan kadar optimum IgG dalam sampel susu bubuk skim yang akan digunakan pada validasi metode analisis, dilakukan pembuatan kurva baku yang validitasnya sudah diketahui dari seri larutan baku IgG dengan rentang kadar 0-125 ng/ml. Seri larutan baku dibuat dengan mengencerkan larutan standar bovine IgG (125ng/ml) dengan assay diluent pada kadar: 125 ng/ml; 62.5 ng/ml; 31.25 ng/ml; 15.6 ng/ml; 7.8 ng/ml; dan 0 ng/ml. Kalibrasi kurva baku dengan membuat suatu seri larutan standar. Larutan stok sampel susu bubuk skim disiapkan dengan
36 menimbang 15 mg susu bubuk skim (sampel dengan kadar IgG 150mg/ 15g) ke dalam labu volumetrik 10 ml, ditambahkan air suling hingga batas dan dikocok kuat hingga homogen. Larutan stok sampel (1,5mg/mL) diencerkan secara bertingkat dalam assay diluent dengan perbandingan 1/10 hingga diperoleh pengenceran : (A) 1/10; (B) 1/100; (C) 1/500 dan (E) 1/1000. Larutan pengenceran diperoleh dengan cara memipet larutan stok sampel sejumlah 100 µl dan ditambahkan 900 µl assay diluents dan pengenceran selanjutnya dilakukan sama hingga diperoleh tingkat pengenceran akhir 1/1000. Microplate disiapkan dan kemudian dipipet 200 µl masing-masing larutan baku dan sampel ke dalam sumuran (dilakukan duplo), dilakukan prosedur ELISA sama seperti yang tertera pada 3.3.1 pada pembuatan kurva dan kalibrasi kurva baku. Berdasarkan densitas optiik yang diperoleh, dengan menggunakan kurva baku selanjutnya dihitung kadar IgG dalam masing-masing tiap kadar sampel yang ditetapkan. 3.3.3 LINIERITAS DAN RENTANG Untuk uji linieritas dan rentang, dibuat kurva baku dari satu seri larutan standar bovine IgG (125ng/ml). Seri larutan baku dibuat dengan mengencerkan larutan standar bovine IgG (125ng/ml) dengan assay diluent pada kadar: 125 ng/ml; 62.5 ng/ml; 31.25 ng/ml; 15.6 ng/m l; 7.8 ng/ml; dan 0 ng/ml. Kalibrasi kurva baku dengan melakukan replikasi sejumlah 7 kali untuk tiap konsentrasi baku dan dihitung nilai r. Linieritas memenuhi syarat jika r hitung 0,95. Microplate disiapkan dan kemudian dipipet 200 µl larutan baku ke dalam sumuran (dilakukan duplo), dilakukan prosedur ELISA sama seperti yang tertera pada 3.3.1 pada pembuatan kurva dan kalibrasi kurva baku. Berdasarkan densitas optik yang diperoleh, dengan menggunakan kurva baku selanjutnya dihitung kadar IgG dalam masing-masing tiap kadar sampel yang ditetapkan.
37 3.3.4 PENETAPAN LIMIT DETEKSI DAN LIMIT KUANTITASI Penetapan limit deteksi dan limit kuantitasi dilakukan dengan cara membuat kurva baku dari seri larutan standar bovine IgG (125ng/ml). Seri larutan baku dibuat dengan mengencerkan larutan standar bovine IgG (125ng/ml) dengan assay diluent pada kadar: 125 ng/ml; 62.5 ng/ml; 31.25 ng/ml; 15.6 ng/ml; 7.8 ng/ml; dan 0 ng/ml, replikasi dilakukan sejumlah 7 kali dan dihitung SD. Kurva kalibrasi dibuat dengan konsentrasi sebagai absis dan absorbansi sebagai ordinat. Limit deteksi mempunyai nilai ekuivalen dengan rata-rata respon blanko plus 3 kali simpangan baku (SD), dan limit kuantitasi adalah rata-rata blanko plus 10 kali SD (Eurachem 2002). Microplate disiapkan dan kemudian dipipet 200 µl larutan baku ke dalam sumuran (dilakukan duplo), dilakukan prosedur ELISA sama seperti yang tertera pada 3.3.1 pada pembuatan kurva dan kalibrasi kurva baku. Selanjutnya dilakukan perhitungan uji keberulangan dan simpangan baku pada kadar larutan baku bovine IgG terendah. Limit deteksi dan limit kuantitasi dihitung dari SD yang diperoleh, dimana konsentrasi ini mempunyai nilai lebih besar dari kadar terendah larutan baku bovine IgG dan limit kuantitasi pada konsentrasi yang telah ditetapkan. 3.3.5 UJI PRESISI Uji presisi dilakukan dengan membuat suatu kurva baku dari satu seri satu seri larutan standar bovine IgG (125ng/ml) dengan assay diluent pada konsentrasi 0-125 ng/ml dan pembuatan larutan sampel pada konsentrasi yang telah ditentukan (dari hasil optimasi kadar IgG dalam sampel susu bubuk skim). Penetapan dilakukan dengan replikasi 7 kali. Seri larutan baku dibuat dengan mengencerkan larutan standar bovine IgG (125ng/ml) dengan assay diluent pada kadar: 125 ng/ml; 62.5 ng/ml; 31.25 ng/ml; 15.6 ng/ml; 7.8 ng/ml; dan 0 ng/ml. Dibuat larutan stok
38 sampel susu bubuk skim dengan menimbang 15 mg susu bubuk skim (sampel dengan kadar IgG 150mg/ 15g) ke dalam labu volumetrik 10 ml, ditambahkan air suling hingga batas dan dikocok kuat hingga homogen. Larutan stok sampel diencerkan secara bertingkat dalam assay diluent dengan perbandingan 1/10 hingga diperoleh pengenceran akhir 1/500. Larutan pengenceran diperoleh dengan cara memipet larutan stok sampel sejumlah 100 µl dan ditambahkan 900 µl assay diluents, dan pengenceran selanjutnya dilakukan sama hingga diperoleh tingkat pengenceran akhir 1/500. Microplate disiapkan dan kemudian dipipet 200 µl sampel ke dalam sumuran (dilakukan duplo), dan dilakukan prosedur ELISA sama seperti yang tertera pada 3.3.1 pada pembuatan kurva dan kalibrasi kurva baku. Berdasarkan densitas optiik yang diperoleh, dengan menggunakan kurva baku selanjutnya dihitung kadar IgG dalam masing-masing tiap kadar sampel yang ditetapkan. Perhitungan SD dan RSD dilakukan menggunakan rumus sebagai berikut : Berdasarkan densitas optiik yang diperoleh, dengan menggunakan kurva baku selanjutnya dihitung kadar IgG dalam masing-masing sampel yang ditetapkan, selanjutnya dilakukan perhitungan nilai rata ratanya, standar deviasi (SD) dan standar deviasi relatif (RSD). Keberterimaan uji keberulangan adalah RSD 20%. 3.3.6 UJI AKURASI Pada penelitian ini dilakukan uji akurasi dengan membuat larutan rekoveri sampel yaitu mencampurkan larutan sampel 100% dengan larutan standar konsentrasi 31,25 ng/ml masing masing dengan kadar 50% dan dilakukan replikasi 9 kali. Dihitung rata rata dari hasil pengujian, simpangan baku dan % RSD. Keberterimaan uji akurasi untuk RSD adalah 15 % atau persen rekoveri adalah 85-115%. Kadar dari masing
39 masing larutan rekoveri merupakan kadar total, kadar IgG dalam sampel dan kadar IgG baku yang ditambahkan. Seri larutan baku dibuat dengan mengencerkan larutan standar bovine IgG (125ng/ml) dengan assay diluent pada kadar: 125 ng/ml; 62.5 ng/ml; 31.25 ng/ml; 15.6 ng/ml; 7.8 ng/ml; dan 0 ng/ml. Dibuat larutan stok sampel susu bubuk skim dengan menimbang 15 mg susu bubuk skim (sampel dengan kadar IgG 150mg/ 15g) dan dimasukkan ke dalam labu volumetrik 10 ml, ditambahkan air suling hingga batas dan dikocok kuat hingga homogen. Larutan stok sampel diencerkan secara bertingkat dalam assay diluent hingga diperoleh pengenceran akhir 1/100. Dari masing masing larutan baku kadar 31.25 ng/ml dan larutan sampel pada pengenceran 1/100 dipipet sejumlah volume sama ke dalam tabung dan campuran ini digunakan sebagai larutan sampel untuk pengujian selanjutnya. Microplate disiapkan dan kemudian dipipet 200 µl sampel ke dalam sumuran (dilakukan duplo), selanjutnya dilakukan prosedur ELISA sama seperti yang tertera pada 3.3.1 pada pembuatan kurva dan kalibrasi kurva baku. Berdasarkan densitas optik yang diperoleh, dengan menggunakan kurva kalibrasi baku selanjutnya dihitung jumlah total bovine IgG, baku bovine IgG dan dari sampel, persen rekoveri dihitung menggunakan rumus sebagai berikut: Rekoveri (%) = kadar IgG total kadar IgG sampel x 100% Kadar baku Akurasi diterima bila memenuhi kriteria kebertrimaan persen rekoveri yang diperoleh pada rentang 85 115 %.
40 3.3.7 SPESIFISITAS Pada penetapan uji spesifisitas digunakan sampel matriks susu bubuk skim yang diklaim tidak mengandung IgG dan komposisi sampel tertera pada Lampiran 1. Kurva baku dibuat terlebih dahulu dari satu seri larutan standar bovine IgG (125ng/ml) dengan assay diluent pada konsentrasi 0:125 ng/ml. Suspensi matriks sampel dari susu bubuk skim yang tidak mengandung IgG dan sampel susu bubuk skim yang mengandung IgG dibuat larutan stok dengan kadar sampel 1,5mg/mL dalam air suling. Pengenceran larutan sampel stok dilakukan secara bertingkat dalam assay diluent dengan perbandingan 1/10 hingga diperoleh pengenceran sebagai berikut: (A)1/10; (B) 1/100; (C) 1/500. (D) 1/1000. Larutan npengenceran diperoleh dengan cara memipet larutan stok sampel sejumlah 100 µl dan ditambahkan 900 µl assay diluents, dan pengenceran selanjutnya dilakukan sama hingga diperoleh tingkat pengenceran akhir 1/1000. Microplate disiapkan dan kemudian dipipet 200 µl sampel dan 200 µl larutan baku ke dalam sumuran dan dilakukan duplo, selanjutnya dilakukan prosedur ELISA sama seperti yang tertera pada 3.3.1 pada pembuatan kurva dan kalibrasi kurva baku. Perhitungan kadar dilakukan menggunakan kurva kalibrasi, kadar rata-rata dan SD dari masing-masing uji spesifisitas dihitung. Metode dikatakan spesifik bila pada larutan matriks sampel tanpa IgG terlihat densitas optik pada konsentrasi 1/100 sd 1/1000 menunjukkan nilai dibawah 0.200 atau nilai yang hampir sama dengan konsentrasi 0 ng/ml larutan baku di atas memberikan hasil yang tidak berbeda bermakna. Sedangkan densitas optik pada larutan sampel yang mengandung IgG menunjukkan hasil yang positif atau lebih besar dari 0,200 pada tingkat pengenceran yang terendah (Zeptometrix 2010).
41 3.3.7 PENETAPAN KADAR IgG PADA SUSU BUBUK SKIM DENGAN KADAR BERVARIASI Penetapan kadar IgG pada susu bubuk skim dengan dengan kadar selain 150 mg/15g adalah susu bubuk skim dengan kadar 180 mg/15g serta 200 mg/15g, penetapan dilakukan sama seperti prosedur uji presisi, dengan membuat suatu kurva baku dari satu seri larutan standar dan pembuatan larutan sampel susu bubuk skim dan dilakukan replikasi tujuh kali. Hasil pengujian sampel dibuat rata rata dan dihitung simpangan baku dan % RSD. Dari hasil perhitungan dapat diperoleh hasil uji dan ditentukan nilai rata-rata, standar deviasi (SD) dan standar deviasi relatif (RSD). Keberterimaan uji keberulangan adalah RSD 20% (Chan 2004). Larutan stok sampel dengan kadar 1,5 mg/ml diencerkan secara bertingkat dalam assay diluent dengan perbandingan 1/10 hingga diperoleh pengenceran akhir 1/500. Larutan pengenceran diperoleh dengan cara memipet larutan stok sampel sejumlah 100 µl dan ditambahkan 900 µl assay diluents (pengenceran 1/10)). Pengenceran selanjutnya dilakukan sama hingga diperoleh tingkat pengenceran akhir 1/5000. Microplate disiapkan dan kemudian dipipet 200 µl sampel ke dalam sumuran (dilakukan duplo), dan dilakukan prosedur ELISA sama seperti yang tertera pada 3.3.1 pada pembuatan kurva dan kalibrasi kurva baku. Berdasarkan densitas optiik yang diperoleh, dengan menggunakan kurva baku selanjutnya dihitung kadar IgG dalam masing-masing sampel yang ditetapkan. Selanjutnya dilakukan perhitungan nilai rata ratanya, standar deviasi (SD) dan standar deviasi relatif (RSD). Keberterimaan uji keberulangan adalah RSD 20%.