BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Alat dan Bahan Metodologi

Transkripsi

1 BAHAN DAN METODE Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan pada periode waktu Juni 007 sampai dengan Juni 008 di Instalasi Karantina Hewan (IKH) Balai Besar Karantina Hewan Soekarno Hatta dan Laboratorium Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian. Alat dan Bahan Alat dan bahan yang digunakan yaitu: biosafety cabinet class II, ELISA reader, ELISA washer, microplate dasar V, multichannel micropipet 0-00µl, single microplate 5-50 µl, single microplate 0-00 µl, microplate dasar V (kit berjumlah 6 well), konjugat.5 ml (tutup orange): protein A/peroksidase (konsentrasi 0x) konjugat diluent 50 ml, buffer peroxidase substrate 50 ml, kontrol negatif.5 ml (tutup hijau) dengan konsentrasi 0x, kontrol positif.5 ml (tutup merah) dengan konsentrasi 0x, sample diluent/sd 50 ml, wash solution 5 ml dan adesif film 6 film. Metodologi Penelitian adalah suatu proses mencari sesuatu secara sistematis dalam waktu yang relatif lama dengan menggunakan metode ilmiah serta aturan yang berlaku. Dalam proses penelitian ini ditunjukkan untuk mengetahui hubungan antara titer antibodi terhadap virus rabies dengan risiko masuknya penyakit rabies dari negara yang belum bebas dan telah bebas penyakit rabies. Konseptualisasi proses tersebut kemudian dituangkan menjadi suatu metode penelitian lengkap dengan pola analisis observasi serta pengumpulan data yang diperlukan untuk melukiskan keadaan tersebut. Sesuai dengan anggapan dasar serta hipotesis dalam penelitian ini bahwa deskripsi yang dimaksudkan menggambarkan peubah yang digunakan untuk menilai pengaruhnya terhadap titer antibodi, serta menggambarkan peubah tersebut dalam menentukan angka titer kekebalan rabies. Data tersebut perlu dilakukan analisis untuk menguji hipotesis dan mengadakan interpretasi tentang hubungan dan pengaruhnya.

2 9 Kerangka Studi Penelitian ini menggunakan disain studi lintas seksional dengan metode penelitian kualitatif. Metode penelitian kualitatif merupakan metode penelitian yang berlandaskan pada falsafah positifisme. Metode ini digunakan untuk meneliti populasi, pengumpulan data menggunakan instrumen penelitian, analisis data bersifat kuantitatif/statistik dengan tujuan menguji hipotesis yang telah ditetapkan (Sugiyono 006). Studi ini dilaksanakan dengan menggunakan kajian lintas seksional. Kajian lintas seksional adalah suatu kajian observasional yang meneliti secara sekaligus faktor exposure dan penyakit tanpa arah dimensi penyelidikan tertentu (Budiharta dan Suardana 007). Pemilihan kajian ini dengan dasar studi dilakukan pada satu titik waktu (periode waktu satu tahun). Keuntungan dilakukannya studi lintas seksional ini adalah:. Sampel dipilih secara acak dari populasi target.. Cukup valid untuk melihat pengaruh suatu faktor risiko terhadap penyakit. 3. Memungkinkan untuk generalisasi hasil studi karena pengambilan sampel dilakukan pada populasi yang besar. 4. Memungkinkan untuk menyidik beberapa faktor penyebab potensial penyakit. Kajian ini akan memberikan potret pada satu saat tertentu atau periode tertentu. Kajian ini sangat baik untuk menguji hipotesis asosiasi antara penyakit dan faktor permanen (tidak akan berubah seumur hidup), misalnya umur, genetik dan sebagainya pada inferensi yang bersifat kausal (Budiharta dan Suardana 007). Independent. Antibodi protektif (positif). Antibodi tidak protektif (negatif) Dependent Faktor:. Umur. Aplikasi vaksin 3. Jarak waktu vaksinasi dengan pengujian serum darah 4. Status negara asal 5. Ulangan vaksinasi 6. Jenis kelamin 7. Jenis vaksin Gambar 4 Kerangka disain penelitian.

3 30 Setiap kelompok diselidiki terhadap faktor risiko melalui data dan riwayat kesehatan hewan yang diperoleh dari lembar permohonan karantina, dokumen kesehatan yang disertakan bersama dengan hewan dari negara asal, serta lembar kartu status hewan saat dilakukan pemeriksaan di IKH. Setiap hewan dilakukan pengujian titer antibodi rabies dan dilakukan observasi selama 4 hari sesuai petunjuk teknis Badan Karantina Pertanian Indonesia (Surat Keputusan Kepala Badan Karantina Nomor 344.b/Kpts/PD /L//06). Hasil pengujian dimasukkan dalam tabel yang dibuat dengan berdasarkan pengelompokan nilai hasil pengujian titer antibodi, yaitu protektif dan tidak protektif. Data hasil pengujian titer antibodi yang telah diperoleh akan dilakukan analisis secara statistik chi square (X ) dengan umur, aplikasi vaksinasi, jarak waktu vaksinasi dengan pengukuran titer antibodi, ulangan vaksinasi, jenis kelamin, dan jenis vaksin guna mengetahui pengaruh masing-masing faktor terhadap titer antibodi. Uji statistik X digunakan untuk melihat hubungan antara faktor-faktor yang berpengaruh terhadap titer antibodi (Thrusfield 005). Tabel Definisi operasional peubah penelitian No Peubah Definisi operasional Skala. Titer antibodi Ordinal Titer protektif (positif) Merupakan kelompok hewan yang memiliki nilai titer antibodi rabies 0.6 EU/ml Titer tidak Merupakan Kelompok hewan yang memiliki protektif nilai titer antibodi rabies <0.6 EU/ml (negatif). Faktor umur Ordinal Umur <6 Adalah hewan yang berumur kurang dari 6 bulan bulan saat diimpor ke Indonesia Umur >6 bulan Adalah hewan yang berumur lebih dari 6 bulan saat diimpor ke Indonesia 3. Cara aplikasi vaksin Ordinal Injeksi Intramuskular (IM) Merupakan cara vaksinasi dengan melakukan injeksi vaksin pada otot Injeksi Subkutaneus (SC) Merupakan cara vaksinasi dengan melakukan injeksi vaksin pada jaringan dibawah kulit/subkutis

4 No Peubah Definisi operasional Skala 4. Jarak waktu vaksinasi dengan pengujian Ordinal x < bulan Selisih waktu vaksinasi dengan waktu pengujian serum darah kurang dari bulan x > bulan Selisih waktu vaksinasi dengan waktu pengujian serum darah lebih dari bulan 5. Ulangan vaksinasi Ordinal 0 Hewan mendapatkan vaksinasi rabies pertama kali Hewan mendapat ulangan vaksinasi rabies satu kali Hewan mendapat ulangan vaksinasi rabies dua kali atau lebih 3 6. Faktor status negara Ordinal Negara bebas rabies (rabies free country) Negara-negara yang tidak pernah dilaporkan terjadi kasus rabies, mempunyai system surveilans penyakit yang efektif, mempunyai aturan yang jelas dalam pencegahan dan pengendalian rabies, serta Negara yang dalam periode tahun terakhir tidak terjadi kasus rabies pada manusia maupun spesies Negara endemik rabies hewan. Negara yang dilaporkan masih terjadi kasus rabies pada manusia maupun spesies hewan dalam periode waktu kurang dari tahun. 7. Jenis Kelamin Ordinal Jantan Hewan yang memiliki alat reproduksi jantan dan belum dikastrasi Betina Hewan yang memiliki alat reproduksi betina dan belum disteril 8. Jenis vaksin Ordinal Tunggal Vaksin dalam satu vial hanya berisi antigen rabies Kombinasi Vaksin dalam satu vial berisi antigen rabies dan antigen lainnya. 3 Cara ukur Alat ukur Observasi dan pemeriksaan titer antibodi. Data pemasukan hewan Balai Besar Karantina Pertanian Soekarno Hatta (kuesioner pemilik). Data hasil pemeriksaan laboratorium Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian Jakarta

5 3 Teknik Pengambilan Data Penelitian ini dilakukan pada anjing yang berasal dari negara bebas rabies dan negara endemik rabies (menurut daftar Wahid Interface OIE tahun 008) pada periode waktu Juni 007-Juni 008. Data yang akan digunakan adalah data primer dengan mengumpulkan data pengujian laboratorium titer antibodi di Laboratorium Balai Besar Uji Standar Karantina Pertanian. Sedangkan data sekunder diperoleh melalui lembar permohonan karantina, dokumen kesehatan yang disertakan bersama dengan hewan dari negara asal, buku vaksinasi, dokumen karantina hewan serta lembar kartu status hewan saat dilakukan pemeriksaan di IKH. Pengambilan Sampel Darah Pengambilan sampel darah dilakukan pada setiap kedatangan anjing yang berasal dari luar negeri (sampel 00% hewan yang datang) baik yang berasal dari negara bebas rabies dan negara endemik rabies. Setiap anjing yang datang akan diistirahatkan terlebih dahulu selama - hari agar kondisi tubuhnya berada pada kondisi yang baik sebelum dilakukan pengambilan darah. Pengambilan darah ditujukan untuk mendapatkan serum sebagai bahan untuk pemeriksaan kandungan antibodi rabies dari hewan yang telah divaksinasi. Darah anjing sebanyak - ml diambil dari Vena femoralis kaki belakang atau Vena saphena kaki depan dengan menggunakan spuit steril berukuran.5 ml. Spuit yang telah berisi darah kemudian dibiarkan pada suhu luar sampai terjadi pemisahan antara serum dan bekuan sel darah. Cairan serum yang sudah terpisahkan dari bekuan darah ini kemudian dipindahkan ke dalam tabung gelas/plastik (tabung venoject/ampul) yang steril. Tabung yang berisi cairan serum tadi kemudian disimpan dalam boks/kotak dengan suhu dingin (berisi batu es), atau langsung dimasukkan ke dalam freezer suhu -0 o C sampai serum tersebut digunakan atau diuji. Sebelum digunakan untuk pengujian, cairan serum diinaktivasi terlebih dahulu dengan cara menempatkan tabung berisi serum tadi pada mesin penghangat air (waterbath) dengan suhu 56 o C untuk selama 30 menit.

6 33 Gambar 5 Pengambilan sampel darah pada hewan impor. Pemeriksaan Laboratorium Pada penelitian ini pemeriksaan titer antibodi terhadap virus rabies dilakukan dengan menggunakan metode ELISA. Metode ini merupakan salah satu metode yang direkomendasikan dalam Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines (OIE 000). Metode ini cukup baik untuk digunakan sebagai pengujian cepat titer antibodi rabies. Menurut Cliquet et al. (004), hasil pengujian titer antibodi anjing dengan menggunakan ELISA ini menunjukkan spesifisitas yang baik apabila dibandingkan dengan pengujian menggunakan gold standard uji fluorescent antibody virus neutralization (FAVN) yang direkomendasikan OIE, namun ELISA menunjukkan sensitifitas yang lebih rendah. Menurut Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 008, ELISA dapat digunakan sebagai pilihan uji alternatif untuk perdagangan dan lalu lintas hewan selain uji yang direkomendasikan, yaitu FAVN dan rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT). Uji ini telah divalidasi dan terbukti memiliki kinerja yang memuaskan dengan sensitifitas, spesifisitas dan kemampuan menunjukkan hasil yang sama pada pengujian berulang (Servat et al. 007).

7 34 Gambar 6 Kit ELISA rabies pada sampel serum darah hewan. Uji ELISA merupakan alat uji yang baik guna melakukan screening secara cepat terhadap sampel serum hewan kesayangan. Uji ini telah digunakan secara rutin sebagai uji standar pemeriksaan serum darah hewan kesayangan di karantina pertanian Indonesia. Keuntungan uji ini adalah mampu menampilkan hasil yang lebih cepat apabila dibandingkan gold standard yang dapat mencapai 4 hari. Alat uji ini hanya membutuhkan waktu 4 jam hingga diperoleh hasil titer antibodi. Pengujian laboratorium akan menggunakan diagnostic kit SERELISA TM RABIES Ab Mono Indirect dengan sensitivitas 76.% dan spesifisitas 97.% (Cliquet et al. 004). Prinsip kerja dari ELISA ini adalah berdasarkan atas ikatan antigen (Ag) coating di dasar sumur microplate dengan antibodi (Ab) dari serum dan konjugat yang ditandai adanya perubahan warna karena adanya penambahan substrat. Titer serum ditentukan berdasarkan atas optical density (OD) dalam bentuk equivalen unit terhadap serum standar OIE. Hasil titer yang protektif ditunjukkan dengan nilai 0.6 EU/ml yang nilainya ekuivalen dengan 0.5 IU/ml sebagai standar protektif titer antibodi menurut OIE, sedangkan sebaliknya akan dianggap tidak protektif. Prosedur kerja ELISA rabies ini dilakukan pertama kali dengan mengeluarkan kit ELISA dari refrigerator, sampel dan serum standar OIE dari freezer dan didiamkan pada suhu 7 o C (suhu ruang) selama jam. Pengenceran dengan wash solution bagian (0 ml) + 9 bagian (80 ml) air destilata; Plate

8 35 dasar F disediakan untuk pengenceran dan diisi 90µl sampel diluen (SD) pada A- G untuk standar serum OIE dan sumur-sumur selanjutnya sesuai dengan jumlah sampel yang akan diuji (tidak duplo). Selanjutnya dilakukan pengenceran serum sesuai standar OIE, yaitu sebagai berikut::0, :30, :00, :50, :300, :000, :3000; Lalu dimasukkan 0 µl serum sampel ke dalam sumur-sumur yang sudah terisi SD dan dicampur mulai dari sumur H, A, B, C, dan seterusnya sesuai dengan jumlah sampel, selanjutnya plate kit ELISA diambil sesuai dengan jumlah sampel, lalu dimasukkan 90 µl SD pada sumur A dan A untuk kontrol negatif dan sumur B dan B untuk kontrol positif. Sebanyak 90 µl SD dimasukkan pada sumur C, D, E, F, G, H dan C, D, E, F, G, H, dan A3, A4 untuk standar serum OIE dan sumur-sumur selanjutnya sesuai dengan jumlah sampel yang akan diuji (duplo). Sebanyak 0 µl kontrol negatif dimasukkan ke sumur A dan A, 0 µl kontrol positif dimasukkan ke sumur B dan B, 0 µl standar serum OIE dan serum sampel yang telah diencerkan dimasukkan ke sumur C, D, E, F, G, H dan C, D, E, F, G, H dan A3, A4, dan sumur-sumur selanjutnya sesuai dengan jumlah sampel yang akan diuji (duplo). Sumur-sumur ditutup dengan adhesive film dan larutan dilarutkan dengan shaker. Plate diinkubasi pada suhu 37±3 o C selama jam ± 5 menit. Cairan dibuang dan dicuci 4 kali, masingmasing 3 menit. Sebanyak 00 µl buffer peroksidase ditambahkan ke substrat dan tidak ditutup dengan adhesive film, kemudian dilarutkan dengan shaker. Plate diinkubasi pada suhu 0±5 o C selama 30 menit ± 5 menit (warna berubah menjadi biru), setelah itu ditambahkan stop solution 50 µl dan warna akan berubah menjadi kuning. Selanjutnya, dilarutkan kembali dengan shaker dan terakhir dibaca OD pada 450 nm/630 nm (mesin ELISA Reader). Nilai valid bila OD kontrol positif 0.300, OD kontrol negatif <0.50 x OD kontrol positif, koefisien korelasi diantara Ln Ods dan Ln rabies Ab untuk standar serum OIE >0.95. Titer kalkulasi: Ln [Rab Ab concentration (EU/ml)] = a+b*ln OD, sampel Rab Ab concentration (EU/ml) = e (a+b* Ln OD), jika titer kalkulasi >0.5 dikatakan hewan protektif, sedangkan sebaliknya akan dikatakan tidak protektif.

9 36 Tabulasi Data Data pengujian yang telah diperoleh dan data kuisioner dikelompokkan berdasarkan faktor-faktor yang telah ditentukan. Data yang layak digunakan untuk analisis statistik. Analisis Data Data yang telah dikumpulkan dan direkapitulasi sehingga diperoleh gambaran secara menyeluruh terhadap hasil pengumpulan data di lapangan. Menurut Hosmer dan Lemeshow (989), untuk mengukur hubungan antara peubah terikat (dependent variable) dan peubah bebas (independent variable) dianalisis sebagai berikut :. Analisis univariat. Analisis ini berfungsi untuk melihat distribusi frekuensi responden menurut berbagai karakteristik yang diteliti, baik peubah terikat maupun peubah bebas.. Analisis bivariat. Analisis ini berfungsi untuk melihat besarnya hubungan antara peubah terikat dan peubah bebas 3. Analisis multivariat. Analisis ini berfungsi untuk melihat pengaruh beberapa faktor risiko yang signifikan secara bersamaan terhadap munculnya titer antibodi tidak protektif. Dengan analisis ini akan diperoleh nilai Odds Ratio (OR) yang dapat mengukur kekuatan asosiasi faktor tanpa memandang cara pengambilan sampel (Budiharta dan Suardana 007). Dalam penelitian ini akan digunakan analisis statistik deskriptif, chi square (X ) dan statistik logistik regresi dengan menggunakan bantuan software SPSS versi 7.