HASIL DAN PEMBAHASAN

21 ASIL DA PEMBAASA ilai e-docking dan Log P Senyawa Analog UK-3A E-docking program ArgusLab 4,0 digunakan untuk melihat kesesuaian antara senyawa aktif (ligan) dengan reseptor (protein/ligan) secara in silico kemudian diperkirakan afinitas ikatan antara ligan dan reseptor sehingga diperoleh nilai energi bebas minimum ( G⁰ bind ) dalam satuan kkal/mol. Pada pelaksanaan docking, ligan dioptimasi bentuk dan orientasi struktur paling stabil untuk dapat berikatan dengan tapak aktif dari reseptor (dalam hal ini protein Bcl-xL) tertentu yang menjadi target sampai mendapatkan energi bebas minimum ( G⁰ bind ) yang sesuai (da & Takahashi 2009). Tidak adanya ketentuan yang jelas mengenai batas optimum batas atas maupun batas bawah dari nilai e-docking yang diperoleh menunjukkan bahwa ligan tersebut cocok atau sesuai dengan tapak aktif protein yang dijadikan target. amun dari acuan yang diperoleh, ada kecenderungan bahwa semakin kecil nilai e-docking semakin cocok ikatan antara ligan dan protein target (Thomas 2003). Dari hasil docking senyawa SME diperoleh nilai -11,12 kkal/mol dan dari senyawa A nilai -10,46 kkal/mol. asil e- docking senyawa SME dan A dapat dilihat berturut-turut pada Gambar 11 dan 12. Protein SME Gambar 11 asil e-docking SME menggunakan program ArgusLab versi 4,0

22 Protein A Gambar 12 asil e-docking A menggunakan program ArgusLab versi 4,0 Log P (lipofilisitas/hidrofobisitas) merupakan koefisien partisi senyawa yang diukur berdasarkan nisbah kelarutan zat pada pelarut n-oktanol dan air. Log P merupakan suatu parameter krusial yang menentukan kemampuan senyawa (obat) menembus membran sel dan berinteraksi dengan target. al ini juga sesuai dengan salah satu faktor pada lima aturan Lipinski yang juga mensyaratkan nilai log P < 5 karena berhubungan dengan kemampuan senyawa untuk melarut dan menembus membran sel. Perubahan struktur pada senyawa akan memberikan pengaruh yang signifikan pada nilai log P dan juga pada aktivitas hayatinya (Patrick 2005; Mishra et a.l 2009). ilai log P senyawa SME dan A adalah 1,49 dan 2,50. Korelasi hubungan antara struktur dan aktivitas serta nilai yang diperoleh dari hasil komputasi e-docking akan dapat dilihat setelah hasil uji bioaktivitas kedua senyawa SME dan A tersebut selesai dilakukan. Sintesis SME SME disintesis dengan mereaksikan asam 2-hidroksinikotinat dengan L- serin metil ester hidroklorida dengan bantuan disikloheksilkarbodiimida (DCC) dan dimetil amino piridin (DMAP) sebagai katalis (aktivator) dalam kloroform

23 pada suhu 55 C selama 24 jam. Senyawa asam-2-hidroksinikotinat diaktivasi menggunakan DCC dan dibantu dengan katalis DMAP untuk mempermudah reaksi dengan L-serin metil ester hidroklorida (SME) yang mengandung gugus amina sehingga membentuk gugus amida. Reaksi sintesis SME mengikuti perkiraan mekanisme reaksi pada Gambar 13. C 6 11 C DCC.... C 6 11 C C 6 11 - C C 6 11 C 6 11 Asam-2-hidroksinikolinat C 6 11 + + - DMAP C 6 11 C - Cl: C 6 11 C 6 11 C C6 11 DCU +.. C 3 o L-serin metil ester hidroklorida _ C 3.. DMAP C 3 2-hidroksinikotinil serin metil ester (SME) Gambar 13 Perkiraan mekanisme reaksi sintesis SME asil reaksi sintesis SME yang diperoleh berupa larutan tidak berwarna bercampur dengan padatan putih disikloheksilurea (DCU). DCU merupakan hasil samping dari penggunaan aktivator DCC. Pemisahan hasil reaksi dari DCU dipisahkan dengan penyaringan dan pemurnian secara kromatografi. Filtrat yang dihasilkan kemudian dibebaskan dari pelarut menggunakan evaporator putar.

24 Analisis pendahuluan terhadap produk reaksi yang terbentuk dilakukan menggunakan KLT analitik dengan fase diam silika gel dan fase gerak n- diklorometana : metanol 10%. Spot yang terbentuk diamati di bawah lampu UV. Analisis KLT menghasilkan 3 spot dari hasil reaksi sintesis tahap pertama, yaitu spot senyawa awal asam 2-hidroksinikotinat dengan Rf = 0,19, spot produk 2- hidroksinikotinil serin metil ester yang merupakan spot dominan dengan Rf = 0,42, dan spot produk samping dengan Rf = 0,51. Spot produk reaksi yang dominan merupakan spot berwarna ungu dan memiliki nilai Rf yang lebih tinggi dari spot standar asam 2-hidroksinikotinat karena bersifat lebih nonpolar. Produk samping reaksi dapat terbentuk karena adanya reaksi samping yang tidak spesifik sehingga terjadi reaksi pada gugus aktif yang tidak diinginkan (Anita et al.2008). asil analisis KLT SME dapat dilihat pada Lampiran 1a. Senyawa hasil samping dipisahkan dari produk SME dengan kolom kromatografi yang menggunakan fase diam silika gel dan fasa gerak n- diklorometana:metanol secara bergradien. Fraksi-fraksi dengan spot yang memiliki nilai Rf 0,42 digabungkan, kemudian pelarut diuapkan. Senyawa yang dihasilkan berupa kristal jarum berwarna putih. Rendemen hasil sintesis SME yang diperoleh sebesar 87,8 %. Produk reaksi tersebut dapat dikatakan murni berdasarkan spot tunggal hasil KLT dan jarak titik leleh yang sempit, yaitu 73-74 C. asil pengukuran menggunakan LC-MS (liquid chromatography mass spectroscopy) (Lampiran 2a) terhadap senyawa SME menghasilkan 2 puncak dengan 1 puncak dominan yang muncul pada waktu retensi 1,61 menit (T1,6) dengan luas area 6053,5. al ini dibuktikan dari nilai bobot molekul (m/z) sebesar 240,23 g/mol (M + = 241,23 g/mol) yang merupakan bobot molekul senyawa SME. Puncak kedua muncul pada waktu retensi 1,12 (T1,1) dengan area sebesar 291,06 yang merupakan hasil samping reaksi yang masih mengotori produk. Senyawa pengotor ini adalah DCU sesuai dengan bobot molekulnya 224,39. ilai bobot molekul SME hasil pengukuran sesuai dengan bobot molekul SME penelitian sebelumya (Shimano et al. 1998). Spektrum FT-IR senyawa L-serin metil ester hidroklorida sebagai material awal menujukkan pita-pita serapan antara lain pada bilangan gelombang ν = 3350

25 cm -1 yang merupakan serapan lebar dari vibrasi ulur, bilangan gelombang ν = 1743 cm -1 yang merupakan vibrasi ulur gugus karbonil (C=) ester, dan ν = 1448 cm -1 merupakan vibrasi tekuk C- (Lampiran 3a). Spektrum FT-IR untuk senyawa hasil sintesis SME menunjukkan pita serapan baru pada ν = 1680 cm -1 yang merupakan vibrasi ulur karbonil (C=) dari amida, serapan tunggal pada ν = 3381 cm -1 yang merupakan vibrasi ulur dari amida sekunder (Pavia et al. 2001). asil analisis juga menunjukkan masih adanya vibrasi ulur karbonil (C=) ester pada ν = 1746 cm -1, dan serapan pada ν = 3481 cm -1 yang menunjukkan vibrasi ulur (Lampiran 3b). asil analisis FT- IR ini menunjukkan senyawa SME telah terbentuk karena adanya serapanserapan baru yang menunjukkan adanya gugus amida yang tidak terdapat pada spektrum FT-IR senyawa L-serin metil ester hidroklorida sebagai material awal. Spektrum hasil analisis senyawa SME menggunakan spektrometer 1 - MR (Lampiran 4a) dan 13 C-MR (Lampiran 5a) dapat ditunjukkan dalam Tabel 4 dan menggunakan panduan Gambar 14. 6 5 4 2 3 Gambar 14 Struktur senyawa 2-hidroksinikotinil serin metil ester (SME) 2' 1' 3' 1"' Tabel 4 Geseran kimia (δ, ppm) spektrum 1 -MR (500 Mz) dan 13 C-MR (125 Mz) untuk senyawa SME (CD 3 D) Geseran Kimia (δ, J dalam z) C/ 1 -MR 13 C-MR 1 3,78 (s, 3) 53,16 1-173,00 2 4,70 (m, 1, J = 3,7; 7,3) 56,51 3 4,01 (dd, 1, J = 3,7; 11) 63,08 3,90 (dd, 1, J = 3,7; 11) C 10,62 (d, 1, J = 7,3) 166,06 2-166,15 3-121,53 4 8,49 (dd, 1 J = 2,5; 7,4) 140,68 5 6,59 (t, 1, J = 7,4) 108,28 6 7,71 (dd, 1 J = 2,5; 6,1) 146,35

26 Berdasarkan hasil pengukuran menggunakan spektrometer 1 -MR dengan standar TMS dan pelarut CDCl 3 untuk senyawa SME dapat dijelaskan bahwa geseran kimia pada δ = 3,78 ppm (s, 3) merupakan geseran proton pada gugus metil, yaitu C1. Puncak yang dihasilkan berbentuk singlet karena gugus metil terikat pada atom oksigen pada ester yang tidak mengikat proton. ilai geseran kimia ini lebih bawah-medan karena berdekatan dengan gugus ester pada posisi α. Gugus metilena C3 ditunjukkan oleh δ = 3,90 (dd, 1, J = 3,7; 11 z) dan δ = 4,01 (dd, 1, J = 3,7; 11 z). ilai geseran kimia ini lebih bawah-medan karena pengaruh dari atom oksigen yang elektronegatif pada posisi α dan gugus amida serta ester pada posisi β. Proton yang terikat pada C2 ditunjukkan oleh δ = 4,70 (m, 1, J = 3,7 z) yang terletak di bawah-medan karena berdekatan dengan karbonil pada ester dan amida pada posisi α. Puncak berbentuk multiplet karena interaksi dengan proton pada amida, pada cincin nikotinil dan 2 proton pada metilena. Proton pada gugus amida ditunjukkan oleh δ = 10,62 (d, 1, J = 7,3 z), berupa puncak doblet yang berasal dari interaksi proton pada amida dengan 1 proton yang terikat pada C2. Puncak pada δ = 6,59 (t, 1, J = 7,4 z), 7,71 (dd, 1 J = 2,5; 6,1 z), dan 8,49 (dd, 1 J = 2,5; 7,4 z) masing-masing menunjukkan 1 proton aromatik pada C4, C5, dan C6 pada cincin nikotinil. Puncak berbentuk doblet-doblet pada C4 dan C6 serta kuartet pada C5. Tetapan kopling untuk -4 terhadap -5 sebesar 7,4 z yang kisaran koplingnya masuk pada tetapan kopling proton aromatik heteroatom pada posisi orto. Tetapan kopling untuk -4 terhadap -6 sebesar 2,5 z yang kisaran koplingnya masuk pada tetapan kopling proton aromatik heteroatom pada posisi meta. Tetapan kopling untuk -5 terhadap -6 sebesar 7,4 z yang kisaran koplingnya masuk pada tetapan kopling proton aromatik heteroatom pada posisi orto. Tetapan kopling untuk -6 terhadap -5 dan -6 terhadap -4 sebesar 6,1 dan 2,5 z yang kisaran koplingnya masuk pada tetapan kopling proton aromatik heteroatom pada posisi orto dan meta, yaitu 6-9 z untuk posisi orto dan 1-3 z untuk posisi meta (Jenie et al. 2006). Geseran kimia untuk proton yang terdapat pada pelarut CD 3 D muncul pada δ = 3,31. Pengukuran menggunakan 13 C-MR menghasilkan geseran kimia antara lain δ = 53,01 yang merupakan geseran kimia dari gugus metil C1 yang bawah-

27 medan karena berdekatan dengan atom oksigen pada ester yang bersifat elektronegatif. Geseran pada δ = 56,5 menunjukkan C2 yang bawah-medan karena pengaruh atom nitrogen amida yang elektronegatif, sedangkan δ = 63,08 menunjukkan karbon metilena C3 yang lebih bawah-medan karena pengaruh atom oksigen hidroksil yang lebih elektronegatif dari atom nitrogen. Karbon gugus karbonil pada ester, yaitu C1, ditunjukkan oleh δ = 173,0 yang lebih bawah-medan karena pengaruh atom oksigen. Puncak pada δ = 108,28; 121,53; 140,68; 146,35; dan 166,15 menunjukkan geseran kimia atom karbon aromatik pada cincin nikotinil, yaitu masing-masing C5, C3, C4, C6, dan C2. C2 memiliki nilai geseran kimia paling bawah-medan di antara karbon-karbon lain pada cincin nikotinil karena C3 mengikat gugus hidroksil yang elektronegatif. asil spektrum 13 C-MR juga memberikan nilai δ = 49,1 yang merupakan geseran kimia atom karbon dari pelarut CD 3 D. Geseran kimia 1 -MR dan 13 C-MR pada struktur SME telah dikonfirmasi menggunakan program ChemBioDraw Ultra 11,0 dan menghasilkan data geseran kimia yang sesuai dengan penelitian sebelumnya (Shimano et al. 1998). asil analisis menggunakan KLT, FT-IR, LC-MS, 1 -MR, dan 13 C- MR menunjukkan bahwa senyawa SME telah terbentuk dalam sintesis tahap pertama. Produk ini kemudian digunakan sebagai bahan sintesis tahap kedua untuk menghasilkan senyawa analog UK-3A, yaitu senyawa 2-hidroksinikotinil serin metil oktanoil ester (SME) melalui reaksi esterifikasi. Sintesis SME Reaksi sintesis tahap kedua untuk menghasilkan senyawa SME dilakukan dengan mereaksikan senyawa hasil sintesis tahap pertama, yaitu SME dengan asam oktanoat untuk membentuk SME. Reaksi esterifikasi dapat terjadi karena gugus asam dari asam oktanoat diaktivasi oleh DCC dan dikatalisis dengan DMAP sehingga mudah diserang oleh elektron bebas pada atom oksigen dalam gugus yang terdapat pada senyawa SME. Gugus yang diserang adalah gugus primer pada SME karena memiliki ikatan karbon sp 3 yang

28 lebih lemah dibandingkan dengan ikatan karbon sp 2 pada gugus yang terdapat di cincin nikotinil. Perkiraan mekanisme reaksi sintesis senyawa SME dapat dilihat pada Gambar 15. Perpanjangan rantai ester pada sintesis SME ini dilakukan untuk menggantikan cincin dilakton, karena cincin dilakton merupakan gugus yang berperan dalam aktivitas hayati senyawa UK-3A (anafi 1995). Perpanjangan rantai ini bertujuan mendapatkan senyawa yang lebih aktif dengan cara meningkatkan lipofilitas senyawa. Lipofilitas senyawa berpengaruh pada kemampuan senyawa dalam menembus dinding sel kanker yang tersusun dari fosfolipid yang bersifat nonpolar (anafi et al. 1999). C 7 15 C 6 11 C C 7 15.... C 6 11 C 6 11 - C C C 6 11 C 6 11 DCC C 6 11 + + C 6 11 - C C 6 11 C 7 15 + - DMAP C 7 15.. 3 C C 6 11 C C6 11 DCU + C 7 15 :.. : - 3 C.. C 3 C 7 15 Gambar 15 Perkiraan mekanisme reaksi sintesis senyawa SME

29 Setelah reaksi berlangsung, dilakukan analisis pendahuluan terhadap produk reaksi yang terbentuk menggunakan KLT analitik dengan fase diam silika gel dan fase gerak n-diklorometana : metanol 10%. Spot yang terbentuk diamati di bawah lampu UV. Pada KLT diperoleh 2 spot, yaitu spot SME dengan Rf = 0,428, dan spot produk SME yang merupakan spot dominan dengan Rf = 0,595. ilai Rf senyawa SME lebih kecil dibandingkan produk SME karena senyawa produk bersifat lebih nonpolar akibat penambahan rantai alifatik pada gugus ester. asil analisis KLT SME dapat dilihat pada Lampiran 1b. Senyawa SME berupa larutan berwarna jernih. Larutan ini dikeringkan menggunakan evaporator putar, kemudian dilarutkan dalam diklorometana. Larutan ini bercampur dengan padatan putih DCU. DCU dipisahkan dengan penyaringan. Filtrat ditambah dengan magnesium sulfat anhidrat untuk menyerap air yang mungkin masih tersisa guna menghindari hidrolisis produk. Produk dipisahkan dengan MgS 4 dengan penyaringan. Filtrat yang diperoleh dikeringkan dan pemurnian dilakukan dengan kromatografi kolom silika gel. Fase diam yang digunakan adalah silika gel dan fase gerak n-diklorometana : metanol secara gradien. Kolom kromatografi dilakukan untuk memurnikan produk dari sisa pereaksi SME, sisa asam, dan DCU. Senyawa SME yang dihasilkan seperti-minyak (oily) berwarna kuning. Rendemen hasil sintesis SME yang diperoleh adalah 74,50%. Rendemen sintesis untuk tahap reaksi pertama maupun kedua cukup baik tetapi rendemen síntesis SME keseluruhan reaksi masih < 70%, yaitu 65,4%. asil analisis LC-MS senyawa SME menunjukkan adanya satu puncak dominan yang muncul pada kromatogram (Lampiran 2b). Puncak ini muncul pada waktu retensi 2,72 menit (T2,7) dengan area 644895,98 yang merupakan produk senyawa SME. al ini dibuktikan dari nilai bobot molekul (m/z) sebesar 366,12 g/mol (M + = 367,12 g/mol) yang merupakan bobot molekul SME, muncul pada serapan spektroskopi massa. Spektrum FT-IR untuk SME menunjukkan pita serapan pada ν = 1743 cm -1 yang merupakan vibrasi ulur karbonil (C=) dari ester, dan ν = 1672 cm -1 yang merupakan vibrasi ulur karbonil (C=) pada amida. asil analisis juga menunjukkan ada vibrasi ulur C alifatik pada ν = 2954-2854 cm -1. Pembentukan

30 senyawa SME dapat dilihat munculnya gugus alifatik pada serapan ν = 2954-2854 cm -1 yang menunjukkan terbentuknya rantai alifatik pada gugus ester yang baru (Lampiran 3c). Spektrum hasil analisis senyawa produk sintesis tahap kedua, yaitu senyawa SME menggunakan spektrometer 1 -MR (Lampiran 4b) dan 13 C- MR (Lampiran 5b), membantu dalam menganalisis struktur produk reaksi yang terbentuk. Data hasil pengukuran terhadap senyawa SME dapat dilihat pada Tabel 5 yang disertai dengan struktur kimia SME (Gambar 16). 6 5 4 2 3 2' 3' 1'' 2'' 4" 3'' 5" 6" 7" 8" 1' 1"' Gambar 16 Struktur SME Tabel 5 Geseran kimia (δ, ppm) spektrum 1 -MR (500 Mz) dan 13 C-MR (125 Mz) senyawa SME (CDCl 3 ) Geseran Kimia (δ, J dalam z) C/ 1 -MR 13 C-MR 1-173,62 2 2,32 (t, 2, J = 7,3) 34,23 3 1,59 (m, 2, J = 7,3) 25,09 4 1,27 29,18 5 1,27 (m, 8, J = 7,3) 29,07 6 1,27 31,80 7 1,27 22,75 8 0,84 (t, 3, J = 7,3) 14,22 1 3,79 (s, 3) 52,93 1-170,13 2 5,03 (m, 1, J = 3,7; 7,4) 51,34 3 4,54 (dd, 1, J = 4,3; 11,6) 63,49 4,56 (dd, 1, J = 4,3; 11,6) -C 10,27 (d, 1, J = 7,4) 163,73 2-164,22 3-120,91 4 8,61 (dd, 1, J = 2,4; 7,3) 138,51 5 6,58 (t, 1, J = 6,7) 108,20 6 7,69 (m, 1, J = 1,9; 8,8) 145,89 Spektrum 1 -MR dengan standar internal TMS dan pelarut CDCl 3 untuk senyawa SME dapat dijelaskan bahwa geseran kimia proton dari rantai alifatik

31 gugus metil pada C8 ditunjukkan oleh geseran kimia pada δ = 0,84 (t, 2, J = 7,3 z). Serapan muncul sebagai pita berbentuk triplet karena terikat pada C7 yang memiliki 2 proton. Integrasi pada spektrum menunjukkan bahwa proton pada C8 ini berjumlah 3 proton. Geseran kimia untuk C4, C5, C6, dan C7 muncul pada δ = 1,27 (m, 8, J = 7,3 z). Puncak muncul sebagai pita multiplet karena di sekitar atom-atom tersebut terikat 2 proton. Geseran kimia ini menyatakan geseran kimia untuk 8 buah proton, yaitu 2 proton pada C4, 2 proton pada C5, 2 proton pada C6, dan 2 proton pada C7. Geseran kimia pada δ = 2,32 (t, 2, J = 7,3 z) merupakan geseran kimia untuk 2 buah proton pada C2. Serapan berbentuk triplet karena terikat pada C3 yang memiliki 2 proton dan C1 yang tidak memiliki proton. Serapan ini muncul lebih bawah-medan karena berdekatan dengan gugus ester yang memiliki atom elektronegatif. Tetapan kopling proton alifatik ini sebesar 7,3 z, sesuai tetapan proton alifatik pada umumnya yang berkisar 6,5-7,5 z (Jenie et al. 2006). Geseran kimia proton-proton lainnya pada SME hampir sama dengan nilai geseran kimia pada SME karena perubahan struktur hanya terjadi pada gugus pada serin menjadi gugus ester. Spektrum 13 C-MR dari senyawa SME dapat memperkuat hasil spektrum 1 -MR yang dapat memberi informasi geseran kimia atom-atom karbon pada senyawa SME. Pembentukan senyawa SME ditunjukkan oleh adanya rantai alifatik pada gugus ester yang merupakan hasil esterifikasi gugus pada SME. Rantai alifatik ini ditunjukkan oleh geseran kimia untuk C2 pada δ = 34,23, C3 pada δ = 25,09, C4 pada δ = 29,18, C5 pada δ = 29,07, C6 pada δ = 31,80, C7 pada δ = 22,75 dan C8 pada δ = 14,226. Geseran kimia pada rantai alifatik C2 lebih bawah-medan karena pengaruh atom elektronegatif. Karbon pada gugus ester C1 muncul pada δ = 173,62. Geseran kimia karbonkarbon lain pada SME mirip dengan geseran kimia karbon-karbon pada SME. Pelarut CDCl 3 ditunjukkan oleh geseran kimia atom karbon pada δ = 77,20. Geseran kimia 1 -MR, dan 13 C-MR pada struktur SME telah dikonfirmasi menggunakan program ChemBioDraw Ultra 11,0.

32 Sintesis A Sintesis A dilakukan dengan mereaksikan asam 2-hidroksinikotinat dengan oktilamina sebagai material awal dengan bantuan disikloheksilkarbodiimida (DCC) dan dimetil amino piridin (DMAP) sebagai katalis/aktivator dalam kloroform pada suhu 55 C selama 24 jam. Senyawa asam- 2-hidroksinikotinat diaktivasi menggunakan DCC dan dibantu dengan katalis DMAP untuk mempermudah reaksi dengan oktil amin yang mengandung gugus amina sehingga membentuk gugus amida. Adapun perkiraan mekanisme reaksi sintesis A dapat dilihat pada Gambar 17. C 6 11 C DCC C 6 11 Asam-2-hidroksinikolinat.... C 6 11 C 6 11 - C C C 6 11 C 6 11 + + + - DMAP.. C 6 11 C - C 6 11 : C 8 17 ktilamina C 6 11 C C 6 11 DCU.. DMAP _ C 8 17 2-hidroksinikotinil oktilamida (A) Gambar 17 Perkiraan mekanisme reaksi sintesis A A hasil sintesis berupa larutan tidak berwarna bercampur dengan kristal putih DCU. DCU merupakan hasil samping dari penggunaan aktivator DCC. DCU dipisahkan dengan penyaringan dan pemurnian secara kromatografi.

33 Filtrat yang dihasilkan kemudian dibebaskan dari pelarut menggunakan evaporator putar. Analisis pendahuluan terhadap produk reaksi yang terbentuk dilakukan menggunakan KLT dengan fase gerak diklorometana : metanol 10%. Spot yang terbentuk diamati di bawah lampu UV. Pada KLT terdeteksi 3 spot, yaitu spot senyawa awal asam 2-hidroksinikotinat dengan Rf = 0,19, spot produk 2- hidroksinikotinil oktilamida yang merupakan spot dominan dengan Rf = 0,67, dan spot produk samping dengan Rf = 0,83. Spot produk reaksi yang dominan merupakan spot berwarna ungu dan memiliki nilai Rf yang lebih tinggi dari spot standar asam 2-hidroksinikotinat. asil KLT A dapat dilihat pada Lampiran 1c. Senyawa hasil samping dipisahkan dari A dengan kolom kromatografi yang menggunakan fase diam silika gel dan fase gerak n-diklorometana : metanol secara bergradien. Fraksi-fraksi dengan spot yang memiliki nilai Rf 0,67 digabungkan, kemudian pelarut diuapkan. Senyawa yang dihasilkan berupa kristal jarum berwarna putih. Produk reaksi tersebut dapat dikatakan murni berdasarkan spot tunggal hasil KLT dan jarak titik leleh yang sempit, yaitu 98-99 C. Rendemen sintesis A adalah 76,1%. LC-MS A (Lampiran 2c) menunjukkan 2 puncak dengan 1 puncak dominan yang muncul pada waktu retensi 2.16 menit (T2,1) dengan area 40093,1. al ini dibukt ikan dari nilai bobot molekul (m/z) sebesar 250,30 g/mol (M + = 251,31 g/mol) yang merupakan bobot molekul A. Puncak kedua muncul pada waktu retensi 1.15 (T1,1) dengan area 459,60 yang merupakan pengotor atau hasil samping reaksi yang masih tersisa. Senyawa pengotor ini memiliki bobot molekul (m/z) 225,4 g/mol yang menunjukkan kemungkinan masih adanya sisa pengotor dari DCU (BM = 224). Spektrum FT-IR untuk senyawa hasil sintesis A menunjukkan pita serapan pada ν = 1680 cm -1 yang merupakan vibrasi ulur karbonil (C=) dari amida (Pavia et al. 2001). Pita serapan pada ν = 3086 cm -1 yang merupakan vibrasi ulur C aromatik pada cincin nikotinat. asil analisis juga menunjukkan masih adanya vibrasi ulur C alifatik pada ν = 2926-2852 cm -1 (Lampiran 3d).

34 Geseran kimia 1 -MR (Lampiran 4c) dan 13 C-MR (Lampiran 5c) untuk senyawa A dapat dilihat pada Tabel 6 dengan panduan menggunakan Gambar 18. 6 2 5 4 3 1' 2' 3' 4' 5' 6' 7' 8' 9' Gambar 18 Struktur senyawa 2-hidroksinikotinil oktilamida (A) Tabel 6 Data geseran kimia (δ, ppm) spektrum 1 -MR (500 Mz) dan 13 C- MR (125 Mz) untuk senyawa A (CDCl 3 ) Geseran Kimia (δ, J dalam z) C/ 1 -MR 13 C-MR 1 9,60 (d, 1, J = 8) - 2 3,46 (q, 2, J =7,4) 39,69 3 1,61 (dt, 2, J = 7,4) 31,99 4 1,32 27,31 5 1,32 29,73 (m, 8, J = 6,8) 6 1,32 29,45 7 1,32 34,03 8 1,63 (m, 2, J = 7,4) 22,82 9 0,88 (t, 3, J = 7,4) 14,27 -C - 163,70 2-164,13 3-121,95 4 8,63 (dd, 1, J = 2,5; 7,4) 137,44 5 6,55 (t, 1, J = 7,3) 107,99 6 7,54 (dd, 1, J = 2,4; 6,7) 163,70 2-12,68 (s, 1) - asil amidasi senyawa asam 2-hidroksinikotinat dengan oktilamina menghasilkan senyawa A yang memiliki rantai gugus amida dengan panjang rantai alifatik sebanyak 8 karbon. Spektrum 1 -MR menunjukkan terbentuknya rantai alifatik berdasarkan geseran kimia pada δ = 3,46 (q, 2, J = 7,4 z) proton pada C2. Proton pada C2 ini ditunjukkan oleh geseran kimia yang lebih bawahmedan dibandingkan proton pada karbon alifatik lainnya karena C2 lebih dekat dengan gugus amida yang mengandung atom oksigen yang elektronegatif. Serapan proton pada C2 berbentuk kuartet karena bertetangga dengan C3 yang mengikat 2 buah proton, amida dan pada cincin nikotinil. Proton pada

35 C3 ditunjukkan oleh geseran kimia pada 1,71 (dt, 2, J = 7,4 z) berbentuk dobel triplet. Proton yang terikat pada karbon alifatik C4, C5, C6, dan C7 masing-masing ditunjukkan oleh geseran kimia pada δ = 1,32 (m, 8, J = 6,8 z). Spektrum untuk proton-proton ini berbentuk multiplet karena banyak terdapat proton yang terikat pada atom karbon tetangga. ilai geseran kimia semakin turun untuk karbon alifatik yang semakin jauh dari gugus amida. Proton pada C8 ditunjukkan oleh geseran kimia pada δ = 1,63 (m, 2, J = 7,4 z) berbentuk multiplet karena banyak terdapat proton yang terikat pada atom karbon tetangga, yaitu 2 proton pada C7 dan 3 proton pada C9. Geseran kimia untuk proton pada metil C9 berada pada δ = 0,88 (t, 3, J = 7,4 z) yang spektrumnya berbentuk triplet karena mengikat atom C8 yang memiliki 2 buah proton. Tetapan kopling proton alifatik ini 6,8 dan 7,4 z, sesuai dengan tetapan proton alifatik pada umumnya yang berkisar pada 6,5-7,5 z (Jenie et al. 2006). Proton pada gugus amida (-C) ditunjukkan oleh geseran kimia pada δ = 9,60 (d, 1, J = 8 z) yang berbentuk doblet karena berinteraksi dengan 1 proton pada metin C2. Geseran kimia proton pada gugus amida ini lebih bawahmedan karena berdekatan dengan atom nitrogen dan oksigen yang memiliki keelektronegatifan tinggi. Proton yang terikat pada karbon dalam cincin nikotinil ditunjukkan oleh geseran kimia pada δ = 8,63 (dd, 1, J = 2,5; 7,4 z) untuk proton pada C4, δ = 6,55 (t, 1, J = 7,3 z) untuk proton pada C5, dan δ = 7,54 (dd, 1, J = 2,4; 6,7 z) untuk proton pada C6. Tetapan kopling untuk -4 terhadap -5 sebesar 7,4 z yang kisaran koplingnya masuk pada tetapan kopling proton aromatik heteroatom pada posisi orto. Tetapan kopling untuk -4 terhadap -6 sebesar 2,5 z yang kisaran koplingnya masuk pada tetapan kopling proton aromatik heteroatom pada posisi meta. Tetapan kopling untuk -5 terhadap -6 sebesar 7,3 z yang kisaran koplingnya masuk pada tetapan kopling proton aromatik heteroatom pada posisi orto. Tetapan kopling untuk -6 terhadap -5 dan -6 terhadap -4 sebesar 6,7 dan 2,4 z yang kisaran koplingnya masuk pada tetapan kopling proton aromatik heteroatom pada posisi orto dan meta, yaitu 6-9 z untuk posisi orto dan 1-3 z untuk posisi meta (Jenie et al. 2006). Proton pada gugus hidroksil yang terikat pada C2 memilki δ = 12,68 (s, 1) yang memiliki serapan singlet karena terikat pada C2 yang tidak memiliki proton dan

36 lebih bawah-medan karena terjadi penbentukan ikatan hidrogen intramolekular dengan karbonil pada gugus amida. Spektrum 13 C-MR senyawa A dapat memperkuat hasil spektrum 1 - MR yang dapat memberi informasi geseran kimia atom-atom karbon pada senyawa A. Pembentukan senyawa A ditunjukkan oleh adanya rantai alifatik pada gugus amida yang merupakan hasil esterifikasi gugus pada asam- 2-hidroksinikotinat dan gugus 2 pada oktilamina. Rantai alifatik ini ditunjukkan oleh geseran kimia C2 pada δ = 39,69, C3 pada δ = 31,99, C4 pada δ = 27,31, C5 pada δ = 29,73, C6 pada δ = 29,45, C7 pada δ = 34,0, C8 pada δ = 22,82, dan C9 pada δ = 14,27. Geseran kimia pada rantai alifatik C2 lebih bawah-medan karena bertetangga dengan gugus amida. Gugus 2-hidroksinikotinil amida dapat ditunjukkan oleh geseran kimia untuk karbon pada amida (-C) pada δ = 163,70. Cincin nikotinil ditunjukkan oleh geseran kimia C2-C6. C2 yang mengikat gugus hidroksil muncul lebih bawah-medan pada δ = 164,13 karena mengikat atom oksigen yang lebih elektronegatif. C3 dan C4 muncul pada δ = 121,95 dan δ = 137,44. C5 dan C6 masing-masing ditunjukkan oleh geseran kimia pada δ = 107,99 dan δ = 145,29 yang bawah-medan karena berikatan nitrogen dalam cincin. Geseran kimia 1 - MR, dan 13 C-MR pada struktur A telah dikonfirmasi menggunakan program ChemBioDraw Ultra 11.0. Berdasarkan hasil analisis menggunakan KLT, FT-IR, LC-MS, 1 -MR, dan 13 C-MR dibuktikan bahwa senyawa SME dan A telah berhasil disintesis. Senyawa SME dan A memiliki kemurnian yang cukup tinggi dan selanjutnya dilakukan uji pendahuluan untuk mengetahui efek toksisitas melalui metode uji larva udang dan uji aktivitas senyawa produk sintesis secara in vitro terhadap sel kanker leukemia murin P-388. Perubahan cincin pikolinil menjadi nikotinil sehingga terjadi perubahan posisi gugus aktif hidroksil diharapkan berpengaruh pada aktivitas senyawa dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukemia murin P-388.

37 Letalitas Larva Udang Uji toksisitas dengan metode BSLT bertujuan memantau sifat sitotoksik senyawa hasil sintesis karena adanya korelasi positif antara nilai toksisitas dengan efek sitotoksik pada kultur sel kanker. Metode ini merupakan uji pendahuluan untuk mendapatkan senyawa bersifat antikanker. Dari hasil uji diketahui bahwa A mempunyai nilai toksisitas 116,9 ppm (Lampiran 6). Menurut Meyer (1982), suatu senyawa mempunyai efek toksisitas yang signifikan (tinggi) jika mempunyai nilai LC50 50 ppm. SME mempunyai kelarutan yang rendah dalam air laut dan penambahan DMS pada pengujian tidak cukup melarutkan senyawa tersebut, sehingga diperlukan emulsifier yang lebih baik atau jumlah DMS yang lebih banyak namun harus dikontrol menggunakan kontrol positif tanpa penambahan SME. Sitotoksisitas (IC 50 ) SME DA A asil uji sitotoksisitas SME dan A terhadap sel kanker leukemia murin dan payudara T47D dapat dilihat pada Tabel 7. Tabel 7 asil uji sitotoksisitas (IC 50 ) senyawa analog UK-3A terhadap sel kanker leukemia murin P-388 dan payudara T47D Senyawa PSME SME PA A Artonin E Cis platin UK-3A (Ueki et al. 1997) Log P 1,56 1,49 0,82 2,50 1,61 G⁰ bind (kkal/mol) -11,93-11,45-10,16-10,46-10,26-11,65 IC50 (µg/ml) P388 T47D 15,4 10,0 3,19 13,2 32,0 4,67 0,06 12,0 1,09 38,0 Senyawa artonin E sebagai kontrol positif memperlihatkan aktivitas yang tinggi (IC 50 0,06 µg/ml) dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukemia murin P-388 jika dibandingkan dengan senyawa semua analog UK-3A. Senyawa SME memiliki aktivitas yang lebih baik dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukemia murin P-388 jika dibandingkan dengan senyawa PSME dan senyawa analog UK-3A. Senyawa A memiliki aktivitas yang lebih rendah jika

38 dibandingkan dengan senyawa PA dan memiliki aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan senyawa UK-3A. Pergantian subtituen pikolinil dengan nikotinil tidak berbanding lurus dengan aktivitas dalam menghambat pertumbuhan sel kanker leukemia murin P-388, ada pengaruh nilai log P dan e-docking pada perubahan struktur tersebut. ilai log P A meningkat pada pergantian subtituen pikolinil menjadi nikotinil dari nilai log P 0,86 menjadi 2,50 sehingga mempengaruhi kemampuan senyawa dalam melewati membran sel dalam mencapai sel target. Senyawa obat yang mendekati nilai log P optimum yang dapat memberikan aktivitas yang lebih baik (Thomas 2003). ilai log P dan e- docking SME tidak berbeda jauh dengan PSME, yaitu 1,49; -11,45 kkal/mol dan 1,56; -11,93 kkal/mol tetapi aktivitas SME dalam menghambat pertumbuhan sel kanker Leukemia murin P-388 lebih baik daripada PSME, yaitu dengan nilai IC 50 = 10,0 µg/ml. al tersebut menunjukkan bahwa nilai log P SME mendekati nilai log P optimum. ilai e-docking menggambarkan nilai kesesuaian struktur suatu senyawa yang dapat berikatan dengan reseptor di sel target. Semakin rendah nilai G⁰ bind semakin tinggi tingkat kesesuaian antara ligan dengan reseptor (Thomas 2003, Patrick 2005). al tersebut sejalan pada hasil penelitian ini, yaitu nilai e-docking ( G⁰ bind ) SME lebih rendah daripada nilai ( G⁰ bind ) A. asil uji aktivitas SME dan A dalam menghambat pertumbuhan sel kanker payudara T47D memberikan hasil yang lebih baik daripada sel kanker leukemia murin P-388. al tersebut dtunjukkan dengan rendahnya nilai IC 50 SME dan A, yaitu 3,19 dan 4,67 µg/ml. Akan tetapi, aktivitas SME dan A dalam menghambat pertumbuhan sel kanker ini masih lebih rendah dibandingkan senyawa cis-platin sebagai kontrol positif dengan nilai IC50 = 1,09 µg/ml. Aktivitas antikanker SME memberikan hasil yang lebih baik daripada A. al tersebut sejalan nilai e-docking SME ( G⁰ bind = -11,45) yang lebih rendah dibandingkan A ( G⁰ bind = -10,46), yaitu semakin rendah nilai G⁰ bind semakin tinggi pula tingkat kesesuaian antara ligan dengan reseptor (protein BclxL). asil aktivitas SME dan A dalam menghambat pertumbuhan sel kanker payudara T47D yang lebih baik daripada aktivitasnya pada sel kanker

39 leukemia murin P-388 disebabkan adanya pengaruh protein Bcl-xL yang digunakan docking karena protein Bcl-xL merupakan protein antiapoptosis spesifik pada sel kanker payudara (Espana et al. 2005).