36 LAMPIRAN
37 Lampiran 1. DATA SHEET : RIBAVIRIN (Bertrand 2000 dalam McEvoy 2005) Nilai toksisitas Non-Manusia : Rat LD50 oral 5,3 g / kg; Mouse LD50 oral 2 g / kg; Ip Mouse LD50 0,9-1,3 g / kg; LD50 ip rat 2 g / kg. Formula molekul : C 8 -H 12 -N 4 -O 5 Bobot molekul : 244.20 Warna / Bentuk : Tanpa warna/ Kristal putih bubuk Bau : Tanpa bau Rasa : Hambar Melting Point : 166-168 o C (aq etanol); 174-176 o C (etanol). Kelarutan : Larut air, Sedikit larut dalam alkohol. Dalam air, 142 mg / ml pada 25 o C Spectral Properties : Khusus rotasi optik: -36,5 derajat di 25 o C / D Fitotoksisitas : 100 ppm
38 Lampiran 2 Tahapan umum penelitian Plbs (Protocorm likes bodies) dari anggrek Dendrobium Deteksi CyMV pada plbs anggrek Dendrobium dengan DAS-ELISA Positif terinfeksi CyMV Negatif terinfeksi CyMV Perbanyakan plbs yang terinfeksi (+) pada media VW (Vacin and Went) Cair Eliminasi CyMV dengan perlakuan antivirus Analisis Statistik Membedakan pola pita protein pada tanaman dan plbs anggrek Dendrobium sehat atau bebas CyMV dengan tanaman dan plb anggrek Dendrobium sakit (terinfeksi CyMV) dengan Elektroforesis Gel Komposit
39 Lampiran 3 Deteksi CyMV pada plbs anggrek Dendrobium dengan DAS-ELISA (Clark&Adam 1977; BALITHI 2003) Coating/lapisi lubang plate dengan antibody-anti CyMV (IgG) yang dicampur dengan penyangga coating ( 1,59 g Na 2 CO 3 + 2,93 g NaHCO 3 + 0.20 g NaN 3 + H 2 O s/d 1 Liter) (1:200), tiap lubang sebanyak 100 µl. Inkubasi selama 1 malam pada suhu 4 o C atau 2jam pada suhu 37 o C Cuci lubang plate dengan penyangga PBS Tween (8 g NaCl + 1,2 g KH 2 PO 4 + 2,9 g Na 2 HPO 4.12H 2 O + 0,2 g KCl + 500 µl Tween 20 + H 2 O s/d 1 liter) menggunakan botol semprot 3 x 3 menit (sambil dishaker). Kemudian tunggu hingga cukup kering. Inkubasi selama 1 malam pada suhu 4 o C atau 2jam pada suhu 37 o C Timbang sampel (plbs anggrek) 0,2 g berikut control negatif dan positif CyMV, hancurkan dalam mortar dengan penyangga ekstraksi (PBS IX; 0,10% tween 20; 20% PVP; 0,20% BSA) dengan perbandingan 1:5 s/d 1: 10 Masukan sampel ke dalam lubang plate sebanyak 100 µl, posisi sampel disesuaikan dengan format yang telah diisi sebelumnya Inkubasi selama 1 malam pada suhu 4 o C atau 2jam pada suhu 37 o C Cuci kembali dengan penyangga PBST 3 x 3 menit Masukan antibody-anti CyMV (yang telah dilabel dengan enzim alkalin fosfatase) yang dicampur dengan ECl (20% PBS 5 x 0,02% tween 20; 20% PVP; 0,20% BSA, H 2 O) (1:200) sebanyak 100 µl Inkubasi selama 1 malam pada suhu 4 o C atau 2jam pada suhu 37 o C Cuci kembali dengan penyangga PBST 3 x 3 menit Masukan penyangga substrat yang mengandung 4-nitrophenylphosphate (1mg/ml), tiap lubang 100 µl Inkubasi pada suhu kamar + selama 1 jam Setelah terjadi perubahan warna menjadi kuning, hentikan reaksi dengan NaOH 3 M sebanyak 25 µl Ukur intensitas perubahan warna (kandungan virus) dengan menggunakan Elisa Reader pada panjang gelombang 410 nm
40 Lampiran 4 Perbanyakan plbs yang terinfeksi (+) pada media VW (Vacin and Went) Cair Plbs terinfeksi CyMV Masukan dan lakukan kultur dalam media VW Cair Inkubasi selama 2 bulan (18 o C) sambil di shaker Plbs siap uji eliminasi CyMV dengan
41 Lampiran 5 Eliminasi CyMV dengan perlakuan antivirus Plbs yang akan diberi perlakuan, berukuran + 5 mm dicampur ke dalam media steril dengan cara difilter (saringan bakteri/milipore 0.22 µm) Ditanam pada media VW padat mengandung 0, 10, 20, 30, 40 dan 50 ppm Botol kultur disimpan di ruang kultur (18 o C) dengan intensitas cahaya 1000 lux Subkultur selama 18 hari pada media yang sama dilakukan 3 kali Deteksi kembali CyMV dalam sampel dengan ELISA
42 Lampiran 6 Pembuatan Media Vacin and Went (VW) Cair dan Padat sebanyak 1 liter. STOK A: KNO3 0,525 gr; KH2PO4 0,25 gr; (NH4)2SO4 0,5 gr; MnSO4.4H2O 7,5 mg; (dilarutkan dalam 20 ml aquades steril) STOK C: Na EDTA 37,5 mg; FeSO4.7H2O 27,8 mg; (dilarutkan dalam 20 ml aquades steril panas) STOK B: MgSO4.7H2O 25mg; (dilarutkan dalam 20 ml aquades steril) STOK D: Ca3(PO4)2 0,2 gr (dilarutkan dalam HCl 1 N) Membuat media VW cair STOK A 20 ml + STOK B 20 ml + STOK C 20 ml + STOK D 20 ml + 150 ml air kelapa + 20 gr sukrosa Membuat media VW Padat STOK A 20 ml + STOK B 20 ml + STOK C 20 ml + STOK D 20 ml + 150 ml air kelapa + 20 gr sukrosa Ditambahkan aquades hingga volume 1 liter Ditambahkan aquades hingga volume 1 liter Diukur ph hingga 5,2 dengan penambahan sedikit demi sedikit NaOH 3 M Diukur ph hingga 5,2 dengan penambahan sedikit demi sedikit NaOH 3 M Ditambahkan 7 gr agar dan panaskan hingga mendidih
43 Lampiran 7 Membedakan pola pita protein tanaman dan plbs anggrek Dendrobium sehat atau bebas CyMV dengan tanaman dan plbs anggrek Dendrobium sakit (terinfeksi CyMV) dengan Elektroforesis Gel Komposit Cara membuat gel: Agarose 0,5% dan aquades dicampurkan dalam wadah I, dipanaskan dalam microwave Acrylamid:bis 2% dan TBE 3x dicampurkan dalam wadah II, dipanaskan dalam inkubator (water bath) 100 o C selama 1 menit Ditambahkan 200 µl APS 10% Ditambahkan 30 µl TEMED Setelah hangat kuku,dicampurkan kedua larutan tersebut, diaduk sebentar, kemudian dicetak dalam casting (pencetak gel). Prosedur: 1 g daun/plbs digerus dalam 1 ml buffer ekstraksi Diinkubasi 10 menit pada suhu 50 o C (water bath) Disentrifus 12.000 rpm selama 10 menit. Diambil supernatan, sebelum dipakai disimpan di suhu 4 o C 100 µl supernatan tiap sampel yang sudah dicampur dengan 20 µl loading buffer (sample buffer 6x) dan Marker protein dipanaskan pada suhu 95 o C selama 5 menit lalu didinginkan selama 15 detik dan dimasukan ke dalam sumur gel Running dilakukan selama ± 3,5 jam pada voltase 50 Pewarnaan dengan Amidobalck (0,1 g Amidoblack dilarutkan dalam 100 ml asam asetat 7%) Penentuan BM (bobot molekul) CyMV
44 Lampiran 8 Deteksi CyMV pada plbs anggrek Dendrobium untuk perlakuan zat antivirus Jenis Plbs Dendrobium Absorbansi Hasil Uji D. Sonia 1 0,00-2 0,01-3 0,00 - D. Jayakarta 1 0,09 + 2 0,07 + 3 0,08 + D. Polisema 1 0.01-2 0,00-3 0.01 - Kontrol positif subkultur 3 = 0.17 ; Kontrol negatif = 0.10 Sampel dikatakan positif (+) terinfeksi CyMV jika nilai absorbansinya sama dengan atau lebih besar dari dua kali nilai absorbansi kontrol negatif (Sutula 1986)
45 Lampiran 9 Hasil uji DAS-ELISA terhadap plbs anggrek D. Jayakarta selama tiga kali subkultur Sub kultur 1 Hasil Uji DAS-ELISA Absorbansi pada 410 nm Hasil uji 1 2 3 1 2 3 0 0.13 0.15 0.13 + + + 0 10 0.2 0.22 0.22 + + + 0 20 0.18 0.18 0.19 + + + 0 30 0.19 0.21 0.21 + + + 0 40 0.18 0.17 0.17 + + + 0 50 0.17 0.14 0.17 + + + 0 (ppm) % bebas CyMV 0 0.12 0.11 0.14 + + + 0 10 0.07 0.09 0.08 + + + 0 2 20 0.09 0.11 0.1 + + + 0 30 0.12 0.15 0.13 + + + 0 40 0.12 0.17 0.22 + + + 0 50 0.22 0.21 0.2 + + + 0 0 0.24 0.29 0.25 + + + 0 10 0.27 0.27 0.19 + + - 33.33 3 20 0.13 0.21 0.21 - + + 33.33 30 0.13 0.15 0.18 - - - 100 40 0.15 0.11 0.1 - - - 100 50 0.13 0.14 0.19 - - - 100 keterangan: kontrol positif subkultur 1 = 0.15 ; kontrol negatif = 0.05 kontrol positif subkultur 2 = 0.16 ; kontrol negatif = 0.03 kontrol positif subkultur 3 = 0.17 ; kontrol negatif = 0.10 Sampel dikatakan positif (+) terinfeksi CyMV jika nilai absorbansinya sama dengan atau lebih besar dari dua kali nilai absorbansi kontrol negatif (Sutula 1986)
46
47 Lampiran 11 Analisis statistika data hasil penelitian Transformasi data % Bebas CyMV berdasarkan arcsin transformation (Gomez&Gomez, 1976) Data % Bebas CyMV Transformasi Data % Bebas CyMV Subkultur 1 Subkultur 1 (ppm) 1 2 3 rata rata- 1 2 3 0 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 10 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 20 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 30 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 40 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 50 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 Data % Bebas CyMV Transformasi Data % Bebas CyMV Subkultur 2 Subkultur 2 (ppm) 1 2 3 rata rata- 1 2 3 0 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 10 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 20 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 30 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 40 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 50 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 Data % Bebas CyMV Transformasi Data % Bebas CyMV Subkultur 3 Subkultur 3 (ppm) 1 2 3 rata rata- 1 2 3 0 0 0 0 0 0 1.28 1.28 1.28 3.84 1.28 10 0 0 100 100 33.33 1.28 1.28 88.72 91.28 30.43 20 100 0 0 100 33.33 88.72 1.28 1.28 91.28 30.43 30 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 40 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 50 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 Keterangan: Transformasi menggunakan rumus Nilai 0% disubstitusi dengan 1/(4n) Nilai 100% disubstitusi dengan [100-1/(4n)] n = banyaknya plbs per perlakuan
48 Hasil analisis ANOVA % Bebas CyMV subkultur 1 Source DF SS MS F P konsentrasi ribavirin 5 0.0000000 0.0000000 * * Error 12 0.0000000 0.0000000 Total 17 0.0000000 S = 0 R-Sq = *% R-Sq(adj) = *% subkultur 2 Source DF SS MS F P konsentrasi ribavirin 5 0.0000000 0.0000000 * * Error 12 0.0000000 0.0000000 Total 17 0.0000000 S = 0 R-Sq = *% R-Sq(adj) = *% subkultur 3 Source DF SS MS F P konsentrasi ribavirin 5 22512 4502 5.30 0.008 Error 12 10194 850 Total 17 32707 S = 29.15 R-Sq = 68.83% R-Sq(adj) = 55.84%
49 Hasil uji Duncan % Bebas CyMV pada setiap subkultur (ppm) % Bebas CyMV Subkultur 1 Transformasi Data Data Asli Rata-rata Uji Duncan Rata-rata Uji Duncan 0 1.28 a 0 a 10 1.28 a 0 a 20 1.28 a 0 a 30 1.28 a 0 a 40 1.28 a 0 a 50 1.28 a 0 a (ppm) % Bebas CyMV Subkultur 2 Transformasi Data Data Asli Rata-rata Uji Duncan Rata-rata Uji Duncan 0 1.28 a 0 a 10 1.28 a 0 a 20 1.28 a 0 a 30 1.28 a 0 a 40 1.28 a 0 a 50 1.28 a 0 a (ppm) % Bebas CyMV Subkultur 3 Transformasi Data Data Asli Rata-rata Uji Duncan Rata-rata Uji Duncan 0 1.28 a 0 a 10 30.43 ab 33.33 ab 20 30.43 ab 33.33 ab 30 88.72 b 100 b 40 88.72 b 100 b 50 88.72 b 100 b Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji Duncan 5%
50 Transformasi data % Hidup plbs berdasarkan arcsin transformation (Gomez&Gomez, 1976) (ppm) Data % Hidup plbs Transformasi Data %Hidup plbs Subkultur 1 Subkultur 1 0 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 10 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 20 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 30 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 40 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 50 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 (ppm) Data % Hidup plbs Transformasi Data %Hidup plbs Subkultur 2 Subkultur 2 0 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 10 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 20 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 30 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 40 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 50 100 100 50 250 83.33 88.72 88.72 45 222.4 74.15 (ppm) Data % Hidup plbs Transformasi Data %Hidup plbs Subkultur 3 Subkultur 3 1 2 1 2 3 3 1 2 1 2 3 3 1 2 1 2 3 3 0 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 10 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 20 100 100 100 300 100 88.72 88.72 88.72 266.2 88.72 30 100 100 66.67 266.7 88.89 88.72 88.72 54.94 232.4 77.46 40 100 66.67 66.67 233.3 77.78 88.72 54.94 54.94 198.6 66.20 50 100 100 66.67 266.7 88.89 88.72 88.72 54.94 232.4 77.46 Keterangan: Transformasi menggunakan rumus Nilai 0% disubstitusi dengan 1/(4n) Nilai 100% disubstitusi dengan [100-1/(4n)] n = banyaknya plbs per perlakuan
51 Hasil Analisis ANOVA % Hidup plbs Anggrek D. Jayakarta subkultur 1 Source DF SS MS F P 5 0.0000000 0.0000000 * * Error 12 0.0000000 0.0000000 Total 17 0.0000000 S = 0 R-Sq = *% R-Sq(adj) = *% subkultur 2 Source DF SS MS F P 5 531 106 1.00 0.458 Error 12 1274 106 Total 17 1805 S = 10.30 R-Sq = 29.41% R-Sq(adj) = 0.00% subkultur 3 Source DF SS MS F P 5 1268 254 1.33 0.315 Error 12 2282 190 Total 17 3550 S = 13.79 R-Sq = 35.71% R-Sq(adj) = 8.93%
52 Hasil Uji Duncan % Hidup plbs Anggrek D. Jayakarta pada setiap subkultur (ppm) % Hidup plbs Subkultur 1 Transformasi Data Data Asli Rata-rata Uji Duncan Rata-rata Uji Duncan 0 88.72 a 100 a 10 88.72 a 100 a 20 88.72 a 100 a 30 88.72 a 100 a 40 88.72 a 100 a 50 88.72 a 100 a % Hidup plbs Subkultur 2 Transformasi Data Data Asli (ppm) Rata-rata Uji Duncan Rata-rata Uji Duncan 0 88.72 a 100 a 10 88.72 a 100 a 20 88.72 a 100 a 30 88.72 a 100 a 40 88.72 a 100 a 50 74.15 a 83.33 a % Hidup plbs Subkultur 3 Transformasi Data Data Asli (ppm) Rata-rata Uji Duncan Rata-rata Uji Duncan 0 88.72 a 100 a 10 88.72 a 100 a 20 88.72 a 100 a 30 77.46 a 88.89 a 40 66.20 a 77.78 a 50 77.46 a 88.89 a Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji Duncan 5%