LAMPIRAN. Lampiran 1. Deskripsi Pembuatan Larutan Stok dan Buffer

Transkripsi

1 LAMPIRAN Lampiran 1. Deskripsi Pembuatan Larutan Stok dan Buffer 1. Pembuatan Larutan Stok a. CTAB 5 % Larutan dibuat dengan melarutkan : - NaCl : 2.0 gr - CTAB : 5.0 gr - Aquades : 100 ml b. Tris HCl 1M ph 8.0 (100 ml) Bahan yang digunakan adalah : - Tris : gr - HCl p.a : 4.2 ml - Aquades : 80 ml - Larytan dibuat dengan mencampurkan bahan kimia di dalam gelas beker yang diaduk dengan menggunakan batang pengaduk magnetik diatas hotplate - Volume ditempatkan dengan aquades hingga 100 ml - Larutan disterilisasikan dengan autoclave c. Tris HCl 1M ph 7.4 (50 ml) Bahan yang digunakan adalah : - Tris : gr - Aquades ditambahkan hingga volume larutan mendekati 50 ml - Pengaturan ph dilakukan dengan menambahkan NaOH 2.5 M hingaa ph Volume ditepatkan hingga 50 ml - Larutan disterilisasi dengan autoclave d. EDTA 0.5 MpH 8.0 (100ml) - NaEDTA : gr - NaOH : 2.0 gr - Aquades : 80 ml - Larutan dibuat dengan mencampurkan bahan kimia dengan gelas beker dan diaduk dengan batang pengaduk magnetik - Pengaturan ph dilakukan dengan menambahkan HCl hingga ph Volume ditepatkan dengan aquades hingga 100 ml - Larutan disterilkan dengan autoclave e. NaCl 5 M ph (100 ml) Bahan yang digunakan adalah :

2 - NaCL : gr - Aquades ditambahkan hingga larutan mencapai 100 ml dan diaduk dengan menggunakan batang pengaduk magnetik hingga larut - Volume ditepatkan dengan aquades hingga 100 ml - Larutan disterilisasi dengan autoclave 2. Pembuatan Larutan Buffer a. Buffer ekstraksi / CTAB (100ml) Bahan yang digunakan adalah : - CTAB 5 % : 40 ml - NaCl 5 M : 25.1 ml - EDTA 0.5 M ph 8.0 : 4 ml - Tris HCl ph 8.0 : 10 ml - Aquades steril : 20.8 ml b. Buffer TAE 50 X (100 ml) Bahan yang digunakan adalah : - Tris : 10 ml - Asam Asetat Glasial : 5.7 ml - EDTA 0.5 M ph 8.0 : 10 ml - Aquades ditambahakan hingga volume larutan 100 ml c. Buffer TAE 1X (500 ml) Bahan yang digunakan adalah : - Buffer TAE 50 X : 10 ml - Aquades : 490 ml d. Buffer TE (50 ml) Bahan yang digunakan adalah : - Tris HCl 1 M ph 8.0 : 0.5 ml - EDTA 0.5 M ph 8.0 : 0.1 ml - Aquades : 49.4 ml - Dimasukkan kedalam gelas beaker dan diaduk hingga merata e. Klorofom Isoamilalkohol 24 : 1 (50 ml) Bahan yang digunakan adalah : - Klorofom : 48 ml - Isoamilalkohol : 2 ml - Semua bahan dicampur merata f. Etanol 70% (100 ml) - Etanol : 70 ml - Aquades : 30 ml

3 Lampiran 2. Alur Penelitian Sampel DNA Kelapa Sawit Isolasi DNA Uji Kualitas Uji Kuantitas Proses PCR-RAPD Elektroforesis Analisis Hasil Amplifikasi PCR (Williams, 1990)

4 Lampiran 3. Proses Isolasi DNA Sampel daun Kelapa Sawit ditimbang 0.2 gram dan digerus sambil ditambahkan nitrogen cair dan PVPP Sampel dimasukkan ke dalam tabung yang berisi 1 ml buffer ekstraksi dan 10 µl β- mercaptoetanol Tabung di vortex dan diinkubasi dalam waterbath selama 30 menit pada suhu 65 0 C Supernatan ditambahkan 1 ml KIAA (24:1) dan disentrifuse dengan kecepatan.000 rpm selama 10 menit Supernatan ditambahkan 1 ml KIAA (24:1) dan disentrifus dengan kecepatan.000 rpm selama 10 menit Supernatan ditambahkan 1 ml isopropanol dan diinkubasi pada suhu 4 0 C selama satu malam Tabung disentrifus pada pada kecepatan.000 rpm selama 10 menit dan dikeringkan Pelet dilarutkan dengan buffer TE 100µl Campuran ditambahkan dengan etanol absolute dingin dan diinkubasi dalam freezer (-20 0 C) selama 30 menit Campuran disentrifus dengan kecepatan.000 rpm selama 10 menit Pelet dicuci dengan etanol 70% dan dikeringkan Pelet dilarutkan dengan 100 µl buffer TE Stok DNA disimpan dalam freezer (-20 0 C)

5 Lampiran 4. Amplifikasi dan genotyping Komposisi Master Mix volume 25 µl : Go Taq PCR 12.5 µl Nuclease free water 9.5 µl Primer 1 µl DNA sampel 2 µl Running PCR sebanyak 45 siklus : Denaturasi awal 94 0 C 2 menit Denaturai 94 0 C 1 menit Annealing 36 0 C 1 menit Extension 72 0 C 2 menit Post extension 72 0 C 10 menit Kondisi akhir PCR 4 0 C tak terbatas Proses running dimulai selama kurang lebih 4 jam

6 Lampiran 5. Proses Elektroforesis hasil PCR- RAPD Agar rose 2.6 gram ditambahkan dengan 0 ml buffer TAE 1 x Campuran dipanaskan dengan hot plate Campuran ditambahkan 1.5 µl EtBr Larutan gel dituang kedalam cetakan yang telah dipasang sisir Gel yang telah mengeras dipindahkan ke dalam chamber berisi buffer TAE 1 x Sampel hasil PCR, marker dan loading dye dimasukkan ke dalam sumur gel dengan perbandingan (8:5:2) Alat elektroforesis dihubungkan dengan power supply 80 volt Proses running dimulai selama 65 menit

7 Profil Elektroforesis - 20 MA B C D E F G H I J K L M N O Gambar 1. Elektroforegram amplifikasi 30 DNA Kelapa Sawit dengan primer - 20, Ket ; M= marker ladder 1kb,kode sampel (A O). M PQRSTUVWXYZ A1 A2 A3 A Gambar 2. Elektroforegram amplifikasi 30 DNA Kelapa Sawit dengan primer - 20, Ket ; M= marker ladder 1kb,kode sampel (P A4). Profil Elektroforesis OPN-03 M A B C D E F G H I J K L M N O Gambar 5. Elektroforegram amplifikasi 30 DNA Kelapa Sawit dengan primer OPN 03, Ket ; M= markerladder 1kb, kode sampel A O M P Q R S T U V W X Y Z A1 A2 A3 A4 Gambar 6. Elektroforegram amplifikasi 30 DNA Kelapa Sawit dengan primer OPN 03, Ket ; M= markerladder 1kb, kode sampelp-a4.

8 Profil Elektroforesis - M A B C D E F G H I J K L M N O Gambar 3. Elektroforegram amplifikasi 30 DNA Kelapa Sawit dengan primer -, Ket ; M=marker ladder 1kb, Kode sampel A O. M PQRSTUVWXYZA1A2A3A Gambar 4. Elektroforegram amplifikasi 30 DNA Kelapa Sawit dengan primer -, Ket ; M=marker ladder 1kb, Kode sampel P A4 Profil Elektroforesis OPH- MA B C D E F G H I J K L M N O Gambar 7. Elektroforegram amplifikasi 30 DNA Kelapa Sawit dengan primer OPH, Ket: M= marker ladder 1kb + invitro, kode sampel A O. M P Q R S T U V W X Y Z A1 A2 A3 A Gambar 8. Elektroforegram amplifikasi 30 DNA Kelapa Sawit dengan primer OPH, Ket: M= marker ladder 1kb + invitro, kode sampel P-A4.

9 Lampiran 7. Hasil Uji Kuantitas dengan UV-Spektrofotometer NO Sampel Kode A34260/A280 Konsentrasi (µg/ml ) 1. 1/61 A 2,32 80,9 2. 2/92 B 1,61 33,3 3. 3/93 C 1,03 102,7 4. 4/94 D 2,18 61,2 5. 5/95 E 2,11 41,6 6. 6/90 F 0,53 2,2 7. 7/89 G 2, /88 H 1,52 43,2 9. 9/83 I 1,76 25, /84 J 1, /85 K 2,04 32, /86 L 2,44 15,6. /87 M 1,64 27, /82 N 2,04 14, /81 O 1,67 9, /76 P 2, /77 Q 1,95 114, /78 R 1,74 58, /80 S 1,49 26, /75 T 1,56 72, /74 U 1,94 29, /68 V 1,6 21, /73 W 1,59 29, /72 X 1,82 58, /71 Y 1,82 26, /70 Z 1,85 37, /69 A1 1,54 25, /67 A2 1,96 37, /66 A3 1,85 4, /65 A4 1,78 9,5 Keterangan : A260/A280 = Kemurnian DNA

10 Lampiran 8. Foto Pengambilan sampel daun

11 Lampiran 9. Foto isolasi dan pemurnian DNA

12

13 Lampiran 10. Faktorial Koordinat Tabel 5. Faktorial Analisis (PCoA) Tabel 6. Nilai Factorial coordinates ue Inertia%

14 Lampiran 8. Data skoring 30 sampel Tanaman Kelapa Sawit Berdasarkan 4 Primer RAPD Sampel OPN OPN OPN OPN OPN OPH 2075 OPH 17 OPH 05 OPH 1016 OPH 893 OPH 585 OPH 470 A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X

15 Y Z A A A A

16 Lampiran. 12 Molecular weight dengan 4 primer A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z A1 A2 A3 A A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z A1 A2 A3 A

17 OPH A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z A1 A2 A3 A OPN 3 A B C D E F G H I J K L M N O P Q R S T U V W X Y Z A1 A2 A3 A