Lampiran I. Skema Kerja 1. Peremajaan Jamur Diambil satu ose jamur Gliocladium sp. TNC73 dan TNC59 secara aseptis Ditumbuhkan pada media miring PDA Dinkubasi pada temperatur kamar selama 7 hari 2. Produksi enzim laminarinase Dimasukkan 5 ml akuades yang sudah disterilisasi ke dalam koloni (agar miring) Diaduk dengan vortex untuk melepaskan sel jamur dari media ] ; Diinokulasi kedalam 20 ml media produksi cair enzim laminarinase Diinkubasi selama 3, 5. 7 dan 9 hari dalam rotary shaker 33
3. Penentuan aktivitas enzim laminarinase Media produksi laminarinase dengan variasi waktu produksi enzim t Disentrifuse salama 10 menit pada kecepatan 9500 rpm Ekstrak kasar enzim Supematan * Disaring dengan kertas Whatman GF/C, syringe filter 0,45 pm CA Whatman puradics dan ditambahkan NaNj 0,02% Ditentukan kadar gula reduksinya dengan metode Nelson-Somogyi Ditentukan kadar proteinnya dengan metode Lowrey (Folin Ciocalteau) 34
Lampiran 2. Pembuatan Larutan 1. Larutan asam asetat 0,2 M CH3COOH glasial (17 N) sebanyak 1,155 ml dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml dan diencerkan hingga tanda batas dengan akuades. 2. Larutan Na-Asetat 0,2 M CH3COONa.3H20 sebanyak 2,72 gr dilarutkan dalam labu takar 100 ml dan diencerkan hingga tanda batas dengan akuades. 3. Larutan Buffer Na-Asetat 0,05 M ph 5,5 Asam asetat 0,2 M sebanyak 4,4 ml ditambahkan dengan Na-Asetat 0,2 M sebanyak 20,6 ml, kemudian tepatkan volumenya dalam labu ukur 100 ml dengan akuades. ph larutan diatur 5,5 dengan penambahan larutan HCI dan NaOH. 4. Reagen Nelson-Somogyi Reagen A: Kalium Tartarat 1,2 gr, NaCOs anhidrat 2,4 gr, NaHCOa 1,6 gr, Na2S04 14,4 gr dilarutkan dengan 80 ml akuades dengan pemanasan. Reagen B : CUSO4.5 H2O 2 gr, 18 gr Na2S04 ke dalam 100 ml akuades, aduk hingga larut semuanya dan tambahkan 1-2 tetes H2SO4 pekat. Reagen Nelson-Somogyi Reagen A dan B dicampurkan dengan perbandingan 4: 1 5. Reagen Arsenomolibdat Amonium molibdat.4 H2O sebanyak 13,27 gr atau Amonium molibdat 12,5 gr dilarutkan dalam 200 ml akuades dan ditambahkan 10,5 ml H2SO4 pekat. Dilarutkan 1,5 gr disodium hidrogen arsenat dalam 12,5 ml akuades. Tuangkan larutan ini ke dalam molibdat, encerkan campuran ini hingga 250 ml. Setelah tercampur baik tuangkan larutan ini kedalam botol cokelat. Larutan ini diinkubasi pada suhu 37 C selama 24-48 jam. Setelah itu simpan reagen arsenomolibdat dalam lemari es. 6. Reagen Lowrey (Reagen C) Reagen A: NaaCOj 2% dalam 0,1 N NaOH Reagen B : CUSO4.5 H2O 0,5% dalam 1 % Nattrium Kalium Tartarat Reagen C : Campurkan 50 ml reagen A dengan 1 ml reagen B 35
Lampiran 3. Uji-t pengukuran kondisi aktivitas enzim laminarinase Repikasi Gliocladium sp. TNC73 Konsentrasi Gula Pereduksi (pg/ml) Inkubasi 1 Jam Inkubasi 24 Jam Uji Kontrol Uji Kontrol I 37,5 0 149,3 7,111 II 36,4 0 165,6 7,777 III 40,1 0 162,9 7,555 IV 40,3 0 156,8 8 Contoh perhitungan uji-t konsentrasi gula pereduksi uji dengan kontrol Gliocladium sp, TNC73 inkubasi 24 jam, v/aktu produksi enzim 3 hari. Uji (^g/ml) X, 149,3 22.290,49 165,6 27.423,36 162,9 26.536,41 156,8 24.586,24 Kontrol (pg/ml) X2 X2' 7,111 50,666 7,777 60,482 7,555 57,078 8 64 IT, =634,6 SX,^= 100.836,5 ET2 = 30,443 SX2^ = 232,126 IT' =402.717,16 IT2^ = 926,776 ir,' 402.717,16 N ~ 4 X, =^ = ^ = 158,65 ' N 4 Jk = IX' - -L ' N = 100.679,29 = 100.836,5-100.679,29 = 157,21 ir/ _ 926,776 N ~ 4 ^ ^ ^ 30,443 ^ N 4 Jit = I X ' - ^ ' N = 232.126-231.694 = 0,432 = 231,694 = 7,61075 36
= 7,2389 = 0,3795 t = X, -Xj 158,65-7,61075 /52,403 0,144 i"4 ""4 " 151,039 ~ Vl3,10075 +0.036 151,039 ~ 7)3,13675 ^ 151,039 ~ 3,62446 = 41,672 ttabei = 2,447 Df=6 or = 0,05 thitumg > tyabeu maka Hq ditolak : yang memberikan perbedaan nyata antara kondisi pengukuran aktivitas enzim laminarinase Contoh perhitungan uji-t aktivitas enzim inkubasi 1 jam dan 24 jam Gliocladium sp. TNC73 pada waktu produksi enzim 3 hari. 1 (Satu) jam (Unit/ml) 24 Jam (Unit/ml) X, X2 0,0139 1,9321 X 10"* 0,0134 1,8171 X 10-^ 0,0148 2,20522 X 10-^ 0,0149 2,22606x 10"* 0,00218 0,00243 0,00239 0,0023 4,7524 X 10"* 5,9049 X 10"* 5,7121 X 10"* 5,29 X 10"* 37
ST, = 0,05715 EX,^ = 8,18048 x 10"* ST2 = 0,0093 1X2^ 2 = _ -v-5 2,16594 x 10 ST' =3,266x10-3 IT2^ = 8,649 x 10-5 Er' 3,266x 10-3 = 8,165x10' ST;' 8,649x10-5 = 2,16225x10-5 ^ ^ 7; 0,05715 = 0,01428 X,=^ = M2^ = 0,002325 ' 4 Jk =zx,- N Jk = i:x; --^ - N = 8.18048x10 " -8,165x10"' = 1,548x 10 " = 2,16594x10-' -2,16225x 10 ' = 3,69x10"' ^ ^ 1.548.10- ^., ^ ^ 3.69.10- ^ ^^^^^ N-1 4-1 N-1 4-1 = 75,16x10"' = 7,1833x10"" Vl23xlO"' 1,109x10" X, - X, -.2 c2 0,01428-0,002325 15,16x10'^ 1,23x10" ' N N ' 4 4 0,011955 \-9 Vl,29x 10"' +3,075x10" 0,011955 0,011955 _ 32 8957 Vl,32075xl0-' ttabei = 2,447 Df=6 a = 0,05 3,634212x10-" thitumg > txabei* maka Ho ditolak : yang memberikan perbedaan nyata antara kondisi pengukuran aktivitas enzim laminarinase 38
Lampiran 4. Absorbansi hasil hidrolisis laminarin oleh enzim lamianarinase Gliocladium sp. TNC73. Repli- Gliocladium sp. TNC73 kasi 3 Hari 5 Hari 7 Hari 9 Hari Uji Kontrol Uji Kontrol Uji Kontrol Uji Kontrol Hg/mi I 0,201 0 0,769 0 1,053 0,041 0,942 0 11 0,195 0 0,796 0 1,113 0,038 0.991 0 111 0,215 0 0,799 0,009 1,030 0,037 0,958 0 IV 0,216 0 0,796 0,007 1,048 0,041 0,977 0 Enzim laminarinase diinkubasi dalam substrat laminarin selama 1 jam, pada suhu 40 C, ph 5,5 buffer Natrium asetat. 39
Lampiran 5. Konsentrasi gula pereduksi hasil hidrolisis laminarin oleh enzim laminarinase Gliocladium sp. TNC73. Gliocladium sp. TNC73 Replikasi 3 Hari 5 Hari 7 Hari 9 Hari Uji Kontrol Uji Kontrol Uji Kontrol Uji Kontrol Hg/ml I 37,5 0 110,8 0 164,5 10,2 121 0 II 36,4 0 114,6 0 173,9 9,5 127,3 0 III 40,1 0 115,1 1,9565 160,9 9,25 123,1 0 IV 40,3 0 114,6 1,5217 163,7 10,2 125,5 0 Enzim laminarinase diinkubasi dalam substrat laminarin selama 1 jam, pada suhu 40 C, ph 5,5 buffer Natrium asetat. Contoh perhitungan uji t Gliocladium sp. TNC73 pada waktu produksi enzim tertinggi yaitu 7 hari antara uji dengan kontrol. Uji (mg/ml) Kontrol (mg/ml) X, X,^ X2 X2' 0,1645 0,02706 0,0102 1,0404 X lo"* 0,1739 0,03024 0,0095 9,025 X 10-^ 0,1609 0,02588 0,00925-5 8,556 X 10 0,1637 0,02679 0,0102 1,0404x10^ ST, = 0,663 ST,' =0,4395 SX,2 = 0,10997 ST2 = 0,03915 1X2^ = 3,8389x 10"* ST2^= 1,5327x 10 r3 sr,' _ 0,4395 = 0,1098 N ~ 4 X, =^ = ^ = 0,1657 ' N 4 ILT^ 1,5327x10-^ ~ 4 7, ^ 0 ^ ' 4 = 3,8317x10-4 40
' N ' N = 0,10997-0,1098 =3,8389x10^ -3,8317x10" = 0,00017 = 0,0072 xlo"" S,^ = ^ = = 5,6667. 10- S= = ^ = 00072x10:1 ^ ^ N-1 4-1 ' N-1 4-1 = v5.6667xl0"' =724x10'' = 7,5277x10"' =4,898x10"" ^ _ X, -X, _ 0,16575-0,0097875 7,5277x10"' ^ 2,4x10" N N V 4 4 0,1559625 7l,8819xl0"' +6x10"' 0,1559625 7l,88196xl0 ^ 0,1559625 0,04338 = 3,5952-3 ttabei = 2,447 Df=6 or = 0,05 thitumg > txabeij maka Ho ditolak : yang memberikan perbedaan nyata antara aktivitas enzim uji dengan aktivitas enzim kontrol. 41
Lampiran 6. Aktivitas ekstrak kasar enzim laminarinase Gliocladium sp. TNC73 Replikasi Gliocladium sp. TNC73 3 Hari 5 Hari 7 Hari 9 Hari Aktivitas Enzim Aktivitas Enzim Aktivitas Enzim Aktivitas Enzim Unit/ml 1 0,01388 0,04071 0.05729 0,04481 II 0,01348 0,04212 0,06078 0,04715 III 0,01485 0,04231 0,05596 0,04559 IV 0,01492 0,04231 0,05700 0,04648 Diperoleh dari hasil perhitungan menggunakan rumus : Aktivitas Enzim = ( xmol gula pereduksi uji - ^imol gula pereduksi kontrol) Volume sampel x 60 menit Contoh perhitungan aktivitas enzim untuk Gliocladium sp. TNC73 replikasi I Mol gula pereduksi uji = 37.5 \ie/m\ = 0,2083 ^imol/ml 180gr/mol Mol gula pereduksi kontrol = 0 jxmol/ml Aktivitas Enzim = 0.2083 umol/ml - 0 lunol/ml 0,25 ml x 60 menit = 0,01388 funol/ml/menit enzim = 0,01388 Unit/ml enzim 42
Lampiran 7. Anava aktivitas ekstrak kasar enzim laminarinase Gliocladium sp. TNC73 pada variasi waktu produksi enzim Sumber variasi df SS MS F Fo,05 Antara Kelompok 3 0,0040632 0,0013544 846,5 3,49 Dalam kelompok 12 0,0000194 0,0000016 Total 15 0,0040827 Df = Degree of freedom = Derajat kebebasan SS = Sum of squares = Jumlah kuadrat MS = Mean of square = Jumlah kuadrat rata-rata *) Kesimpulan : P<0,05 ada perbedaan yang nyata F>Fo,o5 ada perbedaan yang nyata 43
Lampiran 8. Test Duncan aktivitas ekstrak kasar enzim Gliocladium sp. TNC73 A. p 2 3 4 SSRo.05 3,082 3,225 3,313 LSR 0,00196 0,00205 0,00211 SSR = Significant student and range LSR = Least significant range P = Jumlah rata-rata yang ada antara ke-4 nilai rata-rata diurutkan berdasarkan besamya nilai. B. Pengurutan nilai rata-rata aktivitas enzim laminzuinase pada Gliocladium sp. TNC73 Aktivitas spesifik enzim 7 Hari 9 Hari 5 Hari 3 Hari Rata-rata (Unit/ng) 0,05775 0,04601 0,0418 0,01428 Nilai tertinggi T3 ke terendah T T4 T3 T? T, C. Perbandingan nilai rata-rata Kesimpulan T4 - T, = 0,04347 > 0,00211 P < 0,05 T4 - T2 = 0,01595 > 0,00205 P < 0,05 T4-T3 = 0,01174 > 0,00196 P<0,05 T3 - Ti = 0,03173 > 0,00205 P < 0,05 T3 - T2 = 0,00421 > 0,00196 P < 0,05 T2 - T = 0,02752 > 0,00196 P < 0,05 44
Lampiran 9. Absorbansi hasil hidrolisis laminarin oleh enzim lamianrinase pada Gliocladium sp. TNC59 Gliocladium sp. TNC59 Replikasi 3 Hari 5 Hari 7 Hari 9 Hari Uji Kontrol Uji Kontrol Uji Kontrol Uji Kontrol Hg/ml 1 0,119 0,029 0,194 0,029 0,362 0,023 0,270 0,035 11 0,119 0,029 0,196 0,029 0,325 0,026 0,271 0,030 III 0,116 0,026 0,199 0,025 0,343 0,030 0,275 0,044 IV 0,104 0,055 0,200 0,023 0,323 0,022 0,265 0,043 Enzim laminarinase diinkubasi dalam substrat laminarin selama 1 jam, pada suhu 40*'C, ph 5,5 buffer Natrium asetat. 45
Lampiran 10. Konsentrasi gula pereduksi hasil hidrolisis laminarin oleh enzim laminarinase pada Gliocladium sp. TNC59 Gliocladium sp. T7^)C59 Replikasi 3 Hari 5 Hari 7 Hari 9 Hari Uji Kontrol Uji Kontrol Uji Kontrol Uji Kontrol Hg/ml I 18,8 5,1785 29,39 5,9183 56,91 4,6938 39,27 7,4468 n 18,8 5,1785 29,69 5,9183 51,10 5,3061 39,41 6,3829 III 18,4 4,6428 30,15 5,1020 53.93 6,1224 40,00 9,3617 IV 16,5 9,8214 30,30 4,6938 50,78 4,4897 38,54 9.1489 Enzim laminarinase diinkubasi dalam substrat laminarin selama 1 Jam, pada suhu 40''C, ph 5,5 buffer Natrium asetat. 46
Lampiran U. Aktivitas ekstrak kasar enzim lamianrinase TNC59 Gliocladium sp. Replikasi Gliocladium sp. TNC59 3 Hari 5 Hari 7 Hari 9 Hari Aktivitas Enzim Aktivitas Enzim Aktivitas Enzim Aktivitas Enzim Unit/ml I 0,00441 0,00888 0,01916 0,01155 II 0,00441 0,00899 0,01701 0,01160 111 0,00452 0,00916 0,01806 0,01182,v 0,00381 0,00922 0,01690 0,01128 Diperoleh dari hasil perhitungan menggunakan rumus : Aktivitas Enzim = ( imol gula pereduksi uji - [xmol gula pereduksi kontrol) Volume sampel x 60 menit Contoh perhitungan aktivitas enzim laminarinase uniuk Gliocladium sp. TNC59 replikasi I Mol gula pereduksi uji = 18,8 \xg/ml = 0,1005 amol/ml 180gr/mol Mol gula pereduksi kontrol = 0,0344 xmol/mi Aktivitas Enzim = 0.1005 ^mol/ml - 0.0344 umol/ml 0,25 ml X 60 menit = 0,00441 imol/ml/menit enzim = 0,00441 Unit/ml enzim 47
Lflmpiran 12. Anava aktivitas ekstrak kasar enzim laminarinase Gliocladium sp. TNC59 untuk variasi waktu produksi enzim Sumber variasi df SS MS F Fo,05 Antara Kelompok 3 0,0003788 0,0001262 390,19 3,49 Dalam kelompok 12 0,0000038 0,0000003 Total 15 0,0003826 Df = Degree of freedom = Derajat kebebasan SS = Sum of squares = Jumlah kuadrat MS = Mean of square = Jumlah kuadrat rata-rata *) Kesimpulan : P<0,05 ada perbedaan yang nyata F>Fo,o5 ada perbedaan yang nyata 48
Lampiran 13. Test Duncan aktivitas ekstrak kasar enzim pada Gliocladium sp. TNC59 A. p 2 3 4 SSRo.05 3.082 3,225 3,313 LSR 0.000877 0,000917 0,000939 SSR = Significant student and range LSR = Least significant range P = Jumlah rata-rata yang ada antara ke-4 nilai rata-rata diurutkan berdasarkan besarnya nilai. B. Pengurutan nilai rata-rata aktivitas enzim laminarinase pada Gliocladium sp. TNC59 Aktivitas spesifik enzim 7 Hari 9 Hari 5 Hari 3 Hari Rata-rata (Unit/ng) 0,0177825 0,01156225 0,0090625 0,0042875 Nilai tertinggi T3 ke terendah Ti T4 T3 T2 T, C. Perbandingan nilai rata-rata Kesimpulan T4 - T = 0,013495 > 0,000939 P < 0,05 T4 - T2 = 0,008720 > 0,000917 P < 0,05 T4-T3 = 0,006220 > 0,000877 P<0,05 T3 - Ti = 0,007274 > 0,000917 P < 0,05 T3-T2 = 0,002499 > 0,000877 P<0,05 T2 - Ti = 0,004775 > 0,000877 P < 0,05 49
Lampiran 14. Absorbansi hasil hidrolisis laminarin oleh enzim lamianrinase 0,02 Unit/ml enzim dari Gliocladium sp. TNC73, Gliocladium sp. TNC59 dan komersial dari Trichoderma sp. Repli Sampel kasi Gliocladium sp. TNC73 Gliocladium sp. TNC59 Komersial dari Trichoderma sp Uji Kontrol Uji Kontrol Uji Kontrol jig/ml I 0,414 0,061 0,435 0,051 1,305 0,047 11 0,418 0,058 0,410 0,050 1,285 0,044 111 0,421 0,065 0,424 0,045 1,216 0,047 IV 0,420 0,059 0.415 0,046 1,296 0.030 Enzim laminarinase diinkubasi dalam substrat laminarin selama 1 jam, pada suhu 40"C, ph 5,5 buffer Natrium asetat. 50
Lampiran 15. Konsentrasi gula pereduksi hasil hidrolisis laminarin oleh enzim laminarinase 0,02 Unit/ml enzim dari Gliocladium sp. TNC73, Gliocladium sp. TNC59 dan komersial dari Trichoderma sp. Repli Sampel (ng/ml) kasi Gliocladium sp. TNC73 Gliocladium sp. TNC59 komersial dari Trichoderma sp Uji Kontrol Uji Kontrol Uji Kontrol Hg/ml I 57,02 8,1333 59,92 6,8 123,76 4.7058 II 57,57 7,7333 56,47 6,6666 122,46 4,7058 III 57,98 8,6666 58,40 6 118.84 5,2941 IV 57,85 7,8666 57,16 6,1333 113,91 5.2941 Enzim laminarinase diinkubasi dalam substrat laminarin selama 1 jam, pada suhu 40V, ph 5,5 buffer Natrium asetat. 51
Lampiran 16. Aktivitas ekstrak kasar enzim laminarinase 0,02 Unit/ml Gliocladium sp. TNC73, Gliocladium sp. TNC59 dan komersial dari Trichoderma sp. Replikasi Sampel Gliocladium sp. Gliocladium sp. komersial dari Trichoderma TNC73 TNC59 sp 0.02 Unit/ml 1 0,05266 0,01956 0,30543 II 0,05326 0,01854 0,30210 III 0,05370 0,01925 0.29280 IV 0,05356 0,01879 0,28011 Diperoleh dari hasil perhitungan menggunakan rumus : Aktivitas Enzim = (p,mol gula pereduksi uji - \imo\ gula pereduksi kontrol) Volume sampel x 60 menit Contoh perhitungan aktivitas enzim laminarinase komersial dari rr/c/t0</erma 5/;. replikasi I Mol gula pereduksi uji = 123,76 pg/ml = 0,68755 pmol/ml 180gr/mol Mol gula pereduksi kontrol = 0,02775 pmol/ml Aktivitas Enzim = 0.6875 umol/ml - 0.02775 umol/ml 0,036 ml X 60 menit = 0,30543 ^mol/ml/menit enzim = 0,30543 Unit/ml enzim 52
Lampiran 17. Absorbansi aktivitas spesifik ekstrak kasar enzim Gliocladium sp. TNC73, Gliocladium sp. TNC59 dan komersial dari Trichoderma sp Replikasi Sampel Gliocladium sp. Gliocladium sp. komersial dari Trichoderma TNC73 TNC59 sp. Hg/ml 1 0,009 0,019 0,007 II 0,01 0,020 0,01 III 0,011 0,020 0,007 IV 0,0! 0,020 0,007 53
Lampiran 18. Kadar protein ekstrak kasar enzim Gliocladium sp. TNC73, Gliocladium sp. TNC59 dan komersial dari Trichoderma sp. Replikasi Sampel (ng/ml) Gliocladium sp. Gliocladium sp. komersial dari Trichoderma TNC73 TNC59 sp Hg/ml I 4,6339 9,78 3,604 II 5,1488 10 5,148 III 5,6636 10 3,604 IV 5,1488 10 3.604 54