Potensi Desikator untuk Inkubator Anaerob DISUSUN OLEH: Siti Humaidah NRP. 1506 100 030 DOSEN PEMBIMBING: Dr. rer.nat. Maya Shovitri, M.Si Nengah Dwianita Kuswytasari, S.Si., M.Si PROGRAM STUDI BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI SEPULUH NOPEMBER SURABAYA 2011
LATAR BELAKANG metode khusus Mikroorganisme anaerob 1. Louis Pasteur (1877 ) 2. Brewer (1940 ) 3. Hungate ANAEROB JAR Anaerob jar saat ini aplikasi teknik Hungate dan penambahan paladium DESIKATOR MAHAL
PERMASALAHAN BATASAN MASALAH apakah desikator yang sudah vakum dapat digunakan sebagai inkubator kultur bakteri anaerob? Gas yang berada di head space desikator divakum dengan menggunakan pompa vakum Desulvofibrio Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa
Tujuan Untuk mengetahui potensi desikator sebagai inkubator kultur bakteri anaerob. Manfaat berpotensi positif anaerob jar yang murah dan aplikatif Penelitian bakteri anaerob dapat dikembangkan
METODOLOGI
Waktu dan Tempat Penelitian Mei - Oktober 2010 Laboratorium Mikrobiologi dan Bioteknologi Biologi ITS.
Isolat Uji Desulvofibrio Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa
Pembuatan Medium Media thioglikolat 1000 ml akuades Diaduk hingga homogen dituang ke tabung reaksi sebanyak 7,5 ml KULTUR ANAEROB: 2 gr MgSO4. 7H2O sebagai elektron akseptor dan 300 ml sodium laktat sebagai elektron donor Diautoklaf 15 menit, suhu 121 C, tekanan 1,5 atm
Desikator Sebagai Anaerob Jar Tabung reaksi yang berisi media Diinokulasi dgn isolat uji Diletakkan dalam desikator dihisap dengan pompa (Haiou, Cina) selama 1 menit Inkubasi slama 72 jam Selang penghubung Desikator Tempat masuknya gas pada desikator Data??? Pompa vakum Parameter Tabel 3.1
Teknik Hungate pada tabung reaksi tabung reaksi yang berisi media Bakteri uji diinokulasikan Tabung reaksi ditutup dengan penutup sumbat karet Sumbat karet Jarum untuk mengalirkan gas tabung rx dialiri gas selama 2 menit Medium padat/cair Panel on/off Arah aliran gas Pipa yang terhubung dengan sumber gas diinkubasi pada suhu ruang selama 72 jam. Parameter pengamatan seperti pada (Tabel 3.1).
Konfirmasi Isolat Uji Setelah Inkubasi Pengamatan mikroskopik Uji Pembentukan Hidrogen Sulfida (H 2 S) /uji TSIA Pengamatan makroskopik
Pengamatan makroskopik Pertumbuhan bakteri aerob (kiri), fakultatif (tengah) dan obligat anaerob (kanan).
Pengamatan mikroskopik Desulfovibrio: koma P.aeruginosa: batang E.coli: batang Diamati dengan perbesaran 1000X
Uji Pembentukan Hidrogen Sulfida (H 2 S) Jarum tanam tajam yg terdapat bakteri Triple Sugar Iron Agar (TSIA) Inkubasi 24 jam Hasil positif : Desufovibrio: endapan hitam di dalam media E.coli: perubahan warna menjadi kuning pada seluruh bagian media dan menghasilkan gas yang ditandai dengan sedikit terangkatnya bagian bawah media biakan P. aeruginosa: adanya perubahan warna menjadi kuning pada bagian bawah agar (Harley and Prescott, 2002).
Rancangan Penelitian - Tiga kali pengulangan. - dianalisa metode deskriptif. - parameter pada (Tabel 3.1).
Tabel 3.1 Parameter keberadaan oksigen Bakteri Obligat Aerob Bakteri Fakultatif Bakteri Obligat Anaerob Keterangan Hidup Hidup Mati O 2 masih tinggi dan masih dapat mendukung pertumbuhan bakteri obligat aerob Mati Hidup Mati O 2 masih ada, tetapi hanya dapat mendukung pertumbuhan bakteri fakultatif sedangkan bakteri obligat anaerob masih belum dapat tumbuh. Mati Hidup Hidup O 2 tidak ada sehingga bakteri anaerob dapat tumbuh dan bakteri fakultatif masih dapat hidup. Mati Mati Hidup O 2 tidak ada sehingga hanya bakteri obligat anaerob yang dapat hidup dan tidak mendukung pertumbuhan bakteri fakultatif.
HASIL DAN PEMBAHASAN
(a) (b) Gambar 4.1 (a) Inkubasi di desikator vakum dan (b) Inkubasi di suhu ruang pada teknik Hungate
Gambar 4.2 Isolat uji yang tumbuh pada media thioglikolat setelah inkubasi selama 72 jam. (a) teknik desikator, (b) teknik Hungate dan (c) kontol positif. KENAPA??? Diduga karena kandungan medium thioglikolat: Agar, resazurin, sodium thioglikolat
Agar 0,075% menghambat difusi oksigen dari permukaan media ke dasar media High O 2 Low O 2 Pertumbuhan bakteri aerob (kiri), fakultatif (tengah) dan obligat anaerob (kanan).
Resazurin pada media thioglikolat merupakan indikator redoks yang akan berubah warna menjadi merah muda jika terdapat oksigen (Turoski, 2001). HUNGATE tidak terjadi perubahan warna Tetapi ternyata P. aeruginosa masih dapat tumbuh setelah aplikasi teknik Hungate diduga penukaran gas oksigen dengan gas nitrogen belum dapat menghilangkan semua gas oksigen dalam headspace tabung reaksi. KONTROL a b Sangat tampak pada Desulfovibrio. E. coli tertutup biomassa sel. P. aeruginosa warna pudar tertutup bimassa sel c Zona aerob Ket: a. E. coli b. P. aeruginosa c. Desulfovibrio DESIKATOR VAKUM terjadi perubahan warna oksigen masih terdapat di head space tabung reaksi meskipun telah diinkubasi pada wadah yang telah beratmosfir kosong. Hal ini ditandai dengan tumbuhya P. aeruginosa dengan tebalnya biomassa sel (Gambar 4.3).
Biomasa sel Pseudomonas aeruginosa (a) (b) (c) Gambar 4. 3 Pseudomonas aeruginosa setelah inkubasi 72 jam pada (a) teknik desikator, (b) kontrol positif, (c) teknik Hungate, dan (d) kontrol negatif. (d) Menurut Ortega (2007) dengan konsentrasi O 2 0,4% saja P. aeruginosa masih bisa tumbuh dengan waktu paruh 138 ± 20 menit. Lamanya waktu paruh ini bisa dilihat dari tipisnya biomassa sel pada teknik Hungate jika dibandingkan dengan desikator vakum dan kontrol positif (Gambar 4.3). Selain itu ternyata menurut Ramsdell (1935), kadar oksigen kurang dari 0,3 ml dalam media tidak mengakibatkan perubahan warna pada resazurin. Rendahnya kadar oksigen dalam teknik Hungate ini mungkin sebagai penyebab tidak terdeteksinya keberadaan oksigen oleh resazurin.
Secara kualitatif, biomassa isolat uji yang tumbuh dari dua metode anaerob tersebut tidak berbeda nyata, tetapi secara kuantitatif diduga memiliki perbedaan biomassa sel. Sebagai contoh pada isolat uji Desulfovibrio (Gambar 4.2). Pertumbuhan isolat uji pada teknik Hungate, desikator vakum dan kontrol menunjukan kesamaan ketinggian biomassa sel bila dilihat dari dasar media. Tetapi apabila diuji secara kuantitatif, mungkin jumlahnya tidak sama. Uji kuantitatif yang bisa dilakukan adalah secara turbidimetrik yaitu perhitungan massa sel berdasarkan kekeruhan (Waluyo, 2008).
Semua tumbuh Apakah kontaminan?? Dilakukan uji TSIA fermentasi dari E. coli dan P. aeruginosa serta dapat membuktikan adaya gas H 2 S pada bakteri yang mereduksi sulfur. Menurut Holt (1994)
Escherichia coli. a b Gambar 4.4 Uji TSIA pada Escherichia coli. (a) teknik desikator, (b) teknik Hungate dan (c) kontol positif. c Terjadi fermentasi laktosa dan glukosa sehingga terjadi penurunan ph menjadi asam yang ditandai dengan terjadi perubahan warna dari merah menjadi kuning pada seluruh bagian media dan menghasilkan gas yang ditandai dengan terangkatnya bagian bawah media biakan (Gambar 4.4).
Pseudomonas aeruginosa. a b c Gambar 4.5 Uji TSIA pada Pseudomonas aeruginosa. (a) teknik desikator, (b) teknik Hungate dan (c) kontol positif. memfermentasi glukosa saja yang ditandai dengan adanya perubahan warna merah menjadi kuning pada bagian bawah agar (Gambar 4.5) (Harley and Prescott, 2002).
Desulfovibrio TIDAK TERBETUK FeS reaksi dari H 2 S dengan ferous sulfat pada media TSIA Widdle and Bak (1991) menyatakan bahwa substrat yang toksik bagi Desulfovibrio adalah yang mengandung indol atau phenol yang dapat menghambat pertumbuhan Desulfovibrio dan mengakibatkan tidak terbentuknya H 2 S pada media. Sedangkan media TSIA mengandung phenol red sebanyak 0,024 gr per liter (Harley and Prescott, 2002). Selain itu Desulfovibrio adalah bakteri yang bersifat obligat anaerob; media TSIA yang digunakan walaupun telah ditambahkan MgSO 4. 7H2O sebagai elektron akseptor dan sodium laktat sebagai elektron donor tetapi tidak dikondisikan secara anaerob.
PENUTUP
Kesimpulan Dari hasil penelitian diketahui bahwa desikator berpotensi sebagai inkubator kultur anaerob ditandai dengan tumbuhnya isolat Desulfovibrio (anaerob obligat). Namun terdapat kelemahan dalam pemanfaatan desikator vakum ditandai dengan hidupnya isolat P. aeruginosa (aerob obligat) dan E. coli (fakultatif anaerob) yang diduga masih terdapat oksigen di head space tabung reaksi Saran Untuk mengetahui potensi desikator vakum sebagai alternatir anaerob jar perlu diperhatikan kemungkinan kebaradaan oksigen dalam head space tabung reaksi.
Terima kasih