BAB III METODE PENELITIAN

Transkripsi

1 BAB III METODE PENELITIAN A. Jenis dan rancangan penelitian Jenis dan rancangan penelitian yang digunakan dalam penelitian isolasi dan identifikasi bakteri resisten antibiotik dari sampel tanah di Rumah Sakit Umum Daerah Margono Soekarjo Purwokerto adalah non eksperimental deskriptif. B. Alat dan Bahan Alat yang digunakan adalah tabung erlenmeyer (Pyrex ), tabung reaksi (Pyrex ), beaker glass (Pyrex ), pipet ukur (Pyrex ), gelas ukur (Pyrex ), jarum ose, cawan petri (Pyrex ), spatula, bunsen, timbangan analitik (AND GD-200), batang pengaduk, rak tabung, laminar air flow (Mascotte Model LV-S), autoklaf (UL Model 25X-2), pipet tetes, mikroskop (XSZ 107BN), obyek glass, pinset, gunting, masker, mikropipet (Nichipet EX, Japan), jangka sorong (Vernier Lakiper, China), oven kering (Memmert, USA), Penangas air (REC), Inkubator (Memmert, USA). Bahan-bahan yang digunakan pada penelitian adalah sampel tanah, medium nutrient agar (Merck, Germany), medium TSA (OXOID, England), Medium MR-VP (OXOID, England), Medium TSIA (Merck, Germany), pepton (OXOID, England), Ekstrak daging (Merck, Germany), Agar (Merck, Germany), aquadest steril, kapas (Bunga biru), label, kasa (Mawar biru), zat untuk pewarnaan gram (Merck, Germany), Reagen Uji Biokimia (Merck, Germany), antibiotik Oksitetrasiklin (Terramycin, PT Pfizer Indonesia), Kloramfenikol (Colsancetin, Sanbe Farma), Gentamisin (Indofarma), Amoksisilin (Kalmoxilin, PT Bernofarma Pharmaceutical), Siprofloksasin (PT Ferron Pharmaceuticals). 15 C. Cara penelitian 1. Tahap persiapan a. Pengambilan Sampel 14

2 Sampel tanah diambil dari lingkungan Rumah Sakit Umum Daerah Margono Soekarjo Purwokerto. Sampel diambil di antara kamar Bugenvil dan kamar Cempaka, sampel diambil 5 kali secara acak dengan jarak yang tidak terlalu dekat. Sampel diambil pada kedalaman 15 cm dengan panjang 30 cm (diambil dari arah kanan ke kiri), masing-masing tempat diambil sampel sebanyak 1 gram. Langkah selanjutnya kelima sampel dicampur menjadi satu, kemudian sampel secepatnya diisolasi karena waktu yang digunakan untuk menyelesaikan penelitian bakteriologi biasanya tidak melebihi 2 sampai 3 jam (Mudryk et al, 2009). b. Sterilisasi Alat dan Bahan Bahan atau peralatan yang digunakan dalam bidang mikrobiologi harus dalam keadaan steril. Metode sterilisasi secara fisik dapat dipakai bila selama sterilisasi dengan bahan kimia tidak akan berubah akibat suhu yang tinggi atau tekanan yang tinggi. Cara kerja dari panas tersebut, bahwa panas membunuh mikroba karena mendenaturasi protein, terutama enzim dan membran sel. Panas kering membunuh bakteri karena oksidasi komponen-komponen sel. Daya bunuh panas kering tidak sebaik panas basah. Hal ini dibuktikan dengan memasukkan biakan mikroba dalam air mendidih akan cepat mematikan daripada dipanasi secara kering (Waluyo, 2004). Sterilisasi dilakukan di dalam autoklaf pada suhu 121 o C selama 15 menit (Hadioetomo, 1993). c. Pembuatan Medium Agar Nutrien agar dibuat dari 14 g campuran medium yang berisi ekstrak daging 1,5 g; pepton 2,5 g; dan agar 10 g ke dalam 500 ml aquades, lalu dipanaskan di atas penangas 16 air (water bath) selama menit sambil diaduk. Volume medium yang hilang selama pemanasan diganti dengan penambahan aquades sampai volume 500 ml. Dalam keadaan panas, medium disaring dengan kertas saring yang bersih kemudian 12 ml medium dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril. Medium disterilkan dalam autoklaf dengan tekanan 2 atm, suhu 121 o C selama 15 menit (Hadioetomo, 1993). d. Isolasi Bakteri Suspensi sampel tanah dibuat dengan cara 5 g sampel tanah di campur dengan 10 ml aquadest, kemudian diencerkan sampai konsentrasi Sebanyak 0,5 ml suspensi sampel tanah

3 diambil dan dicampur dengan 12 ml medium Nutrient Agar lalu tuang ke dalam cawan petri steril. Permukaan cawan petri tersebut diratakan dengan glass spreader lalu diinkubasi pada suhu kamar selama 24 jam. Setelah diinkubasi maka akan dihasilkan beberapa koloni bakteri. Medium agar steril yang kosong sebanyak koloni yang terbentuk disiapkan lalu koloni-koloni bakteri tersebut diisolasi dengan teknik streaking plate. Alat yang dipakai adalah ose tumpul yang telah disterilkan dengan cara dipijarkan pada nyala bunsen. Setelah itu, masing-masing cawan petri diberi etiket dan cawan petri tersebut dibalik kemudian dibungkus dengan kertas koran. Medium tersebut diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. e. Perhitungan Jumlah Sel Bakteri Medium cair dibuat dengan bahan-bahan 1,5 g ekstrak daging; 2,5 g pepton dicampur dan dilarutkan dalam air suling sebanyak 500 ml. Sebanyak 5 ml medium cair dimasukkan ke dalam tabung reaksi steril. Medium disterilkan dalam autoklaf dengan tekanan 2 atm, suhu 121 o C selama 15 menit (Hadioetomo, 1993).Medium cair disiapkan sebanyak koloni bakteri hasil isolat. Setelah itu, satu ose tumpul koloni bakteri hasil isolat diambil dan ditumbuhkan dalam medium cair. Tabung reaksi tersebut ditutup dengan kapas dan diinkubasi selama 24 jam. 17 Jumlah bakteri yang digunakan untuk uji adalah sebanyak 3x10 8 sel/ml (OD600 = 0,1). Suspensi bakteri tersebut dibaca di spektrofotometri visibel pada panjang gelombang 600 nm. Apabila serapannya 0,1 maka suspensi tersebut bisa langsung dipakai untuk uji resistensi bakteri, tapi apabila serapannya belum 0,1 dilakukan pengenceran sampai didapatkan serapan 0,1. Semua koloni bakteri diberi perlakuan yang sama. 2. Tahap pelaksanaan a. Uji Resistensi Bakteri Pengujian resistensi bakteri dilakukan dengan metode difusi agar menggunakan kertas cakram. Medium Nutrien Agar yang berisi bakteri uji hasil isolasi disiapkan. Kertas cakram sebanyak 5 buah di pasang di atas medium padat tersebut, kemudian antibiotik yang akan diujikan (Siprofloksasin, Oksitetrasiklin, Kloramfenikol, Gentamisin, Amoksisilin) diteteskan menggunakan mikropipet sebanyak 10 µl. Cakram yang diletakkan pada media agar yang telah ditanami mikroorganisme yang akan berdifusi pada media agar tersebut. Masing-masing koloni bakteri diberi perlakuan yang sama, kemudian diinkubasikan selama 24 jam pada suhu 37 o C.

4 Diameter hambatan diukur dan resistensi bakteri uji ditentukan kemudian. Area jernih mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antimikroba pada permukaan media Agar (Pratiwi, 2008). Untuk biakan bakteri yang resisten terhadap banyak antibiotik dilakukan uji-uji biokimia selanjutnya untuk diidentifikasi jenis bakterinya. b. Pembuatan Stok Kultur Sebanyak 1 ml suspensi bakteri yang sudah dibaca serapannya dimasukkan ke dalam mikrotube dan dicampur dengan 1 ml gliserol 40%. Mikrotube tersebut ditutup dan disimpan lemari pendingin pada suhu 5 o C. 18 c. Pengamatan karakteristik mikroskopik bakteri Pengamatan karakteristik mikroskopik bakteri dapat dilakukan dengan pewarnaan gram dan pewarnaan endospora. Pewarnaan gram dilakukan untuk mengetahui bentuk sel dan sifat Gram bakteri.pewarnaan dilakukan dengan membuat apusan bakteri terlebih dahulu. Apusan dibuat dari satu ose bakteri hasil isolasi diletakkan di atas kaca objek lalu dipijarkan diatas api bunsen. Langkah selanjutnya yaitu kristal ungu diteteskan pada apusan dan didiamkan selama 1 menit. Zat warna dicuci menggunakan air mengalir, kemudian kalium iodida diteteskan pada apusan bakteri tersebut dan didiamkan selama 1 menit, setelah itu dicuci dengan air mengalir. Alkohol aseton diteteskan pada apusan bakteri tersebut dan didiamkan selama 30 detik, kemudian dicuci dengan air mengalir. Kemudian safranin diteteskan pada apusan bakteri tersebut, lalu didiamkan selama 1 menit dan dicuci dengan air mengalir. Setelah itu preparat diamati menggunakan mikroskop (Irianto, 2006). Bakteri yang berwarna ungu digolongkan ke dalam Gram positif, sedangkan bakteri yang berwarna merah digolongkan ke dalam Gram negatif (Pratiwi, 2008). Cara yang sama dilakukan untuk biakan bakteri yang lain. 3. Identifikasi Bakteri Identifikasi bakteri dilakukan menggunakan buku identifikasi bakteri dari Holt dkk (1994) dalam Bergey s Manual Of Determinative Bacteriology 9 th. a. Pembuatan Medium Trypton Soya Agar (TSA)

5 Sebanyak 7,5 g trypycase; 2,5 g phytone; 2,5 g sodium chloride; 6 g agar dicampur lalu dilarutkan dalam 500 ml aquades steril. Campuran larutan tersebut diaduk lalu dipanaskan sampai larut. Dalam keadaan panas larutan tersebut dimasukkan ke dalam tiap tabung reaksi masing-masing tabung reaksi sebanyak 7 ml. Pada ujung tabung reaksi disumbat dengan kapas steril lalu medium tersebut disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 2 atm selama 15 menit. Kemudian setelah medium disterilkan, tabung yang berisi medium tersebut dimiringkan tapi jangan sampai medium yang didalam tabung menyentuh sumbat, biarkan medium sampai memadat. 19 b. Pembuatan Medium Triple Sugar Iron Agar (TSIA) Sebanyak 10 g polipepton; 5 g laktosa; 5 g sukrosa; 5 g glukosa; 2,5 g NaCl; 0,1 g feroamonium sulfat; 0,1 g Na thiosulfat; 0,0125 g fenol red; 6 g agar dicampur lalu dilarutkan dalam 500 ml aquades steril. Campuran larutan tersebut diaduk lalu dipanaskan sampai larut. Dalam keadaan panas larutan tersebut dimasukkan ke dalam tiap tabung reaksi masing-masing tabung reaksi sebanyak 5 ml. Pada ujung tabung reaksi disumbat dengan kapas steril lalu medium tersebut disterilkan di autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 2 atm selama 15 menit. Kemudian setelah medium disterilkan, tabung yang berisi medium tersebut dimiringkan tapi jangan sampai medium yang didalam tabung menyentuh sumbat, biarkan medium sampai memadat. c. Pembuatan Medium MR-VP Sebanyak 3,5 g polipepton; 2,5 g glukosa; 2,5 g Kalium dihidrogen fosfat dicampur dan dilarutkan dalam 500 ml aquades steril. Campuran larutan tersebut diaduk lalu dipanaskan sampai larut. Dalam keadaan panas larutan tersebut dimasukkan ke dalam tiap tabung reaksi masing-masing tabung reaksi sebanyak 5 ml. Pada ujung tabung reaksi disumbat dengan kapas steril lalu medium tersebut disterilkan di autoklaf pada suhu 121 o C tekanan 2 atm selama 15 menit. d. Uji Biokimia (Barrow, 1993; Irianto, 2006)

6 1. Uji Katalase Pengujian katalase dilakukan untuk mengetahui bakteri yang dapat menghasilkan enzim katalase. Uji katalase dilakukan dengan menyiapkan 2 medium TSA miring terlebih dahulu, satu medium untuk uji satu medium sebagai kontrol. Bakteri diinokulasikan ke medium TSA miring tersebut lalu diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Setelah diinkubasi kemudian reagen H 2 O 2 3% diteteskan ke koloni. Hasil uji katalase positif jika timbul gelembung-gelembung gas pada koloni. Cara yang sama dilakukan untuk biakan bakteri yang lain Uji Oksidase Pengujian oksidase dilakukan untuk mengetahui adanya enzim oksidase pada bakteri. Uji oksidase dilakukan dengan menyiapkan medium TSA miring terlebih dahulu. Bakteri diinokulasikan ke medium TSA miring tersebut lalu diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Setelah diinkubasi, sebanyak 1 ose biakan bakteri diambil lalu dioleskan ke kertas saring kemudian ditetesi dengan reagen oksidase. Hasil uji oksidase positif jika muncul warna biru kehitaman pada olesan bakteri tersebut. Cara yang sama dilakukan untuk biakan bakteri yang lain. 3. Uji fermentasi karbohidrat Uji fermentasi karbohidrat dilakukan dengan menyiapkan 2 medium TSIA miring terlebih dahulu, satu medium untuk diuji satu medium sebagai kontrol. Bakteri diinokulasikan ke medium TSIA miring tersebut lalu diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Pengujian dilakukan dengan mengamati adanya perubahan warna medium pada bagian permukaan dan bagian dasar medium. Cara yang sama juga dilakukan untuk biakan bakteri yang lain. Bagian permukaan medium disebut slant, sedangkan bagian dasar medium disebut butt. Perubahan warna medium tersebut adalah sebagai berikut: Slant dan butt tidak mengalami perubahan warna, menunjukan tidak terjadi fermentasi karbohidrat. Slant berwarna merah, sedangkan butt berwarna kuning dengan atau tanpa produksi gas. Kondisi tersebut menunjukkan telah terjadi fermentasi glukosa.

7 Slant dan butt berwarna kuning dengan atau tanpa produksi gas. Kondisi tersebut menunjukkan telah terjadi fermentasi sukrosa dan laktosa. Butt berwarna kehitaman menunjukkan adanya produksi gas H 2 S. 4. Uji methyl red Pengujian methyl red dilakukan untuk mengetahui kemampuan 21 bakteri memfermentasikan glukosa untuk menghasilkan asam. Uji methyl red dilakukan dengan menyiapkan 2 medium MR-VP terlebih dahulu, satu tabung sebagai kontrol satu tabung untuk uji. Bakteri diinokulasikan ke medium MR-VP tersebut lalu diinkubasi pada suhu 37 o C selama 24 jam. Pengujian dilakukan dengan menuangkan sepertiga suspensi biakan ke dalam tabung reaksi yang lain, kemudian reagen methyl red diteteskan sebanyak 2 tetes ke dalam biakan. Uji positif jika terbentuk cincin berwarna merah pada permukaan medium. Cara yang sama juga dilakukan untuk biakan bakteri yang lain. 5. Uji voges proskauer Pengujian voges proskauer dilakukan untuk menentukan bakteri yang mampu menghasilkan acetymethyl carbinol dan fermentasi glukosa. Uji voges proskauer dilakukan dengan menggunakan dua pertiga sisa biakan pada uji methyl red. Pengujian dilakukan dengan cara reagen α-naftol sebanyak 15 tetes dan 40% KOH sebanyak 10 tetes diteteskan ke biakan tersebut, kemudian biakan tersebut dikocok. Uji positif jika terjadi warna merah pada suspensi biakan. Cara yang sama dilakukan juga untuk biakan bakteri yang lain.