Seminar Nasional Biologi 2010 SB/P/BF/08 GREEN FLUORESCENT PROTEIN PADA UBUR-UBUR LOKAL SEBAGAI ALTERNATIF MARKA DNA Cahya Kurnia Fusianto 1, Zulfikar Achmad Tanjung 1,Nugroho Aminjoyo 1, dan Endang Semiarti 1 1 Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada; email: cahya.fusianto@gmail.com PENDAHULUAN Gen Green Fluorescent Protein (GFP) terdapat pada beberapa jenis uburubur. Gen ini mengkode protein yang mampu berpendar memancarkan warna hijau jika dieksitasi dengan sinar ultraviolet. Hal ini membuat GFP dapat dimanfaatkan sebagai gen pelapor yang bersifat non-destruktif dan dapat digunakan untuk mendeteksi ekspresi gen target secara langsung. Sifat-sifat unggul ini menjadikan GFP sering digunakan dalam penelitian biologi sel dan molekuler [2],[4]. Dengan memanfaatkan GFP diharapkan mampu meningkatkan penelitian tentang cara mengamati proses dalam tubuh untuk berbagai kepentingan IPTEK dan medis. Hanya sebagian anggota Kelas Hydrozoa (ubur-ubur) yang memiliki GFP antara lain genus Aequorea, Mitrocoma, Obelia, dan Phialidium [1]. Di Indonesia terdapat banyak jenis ubur-ubur namun belum pernah ada penelitian mengenai keberadaan gen GFP pada ubur-ubur lokal. Di Pantai Marina Semarang, didapatkan informasi dari nelayan setempat bahwa banyak terdapat ubur-ubur yang mampu berpendar pada malam hari sehingga diduga memiliki gen GFP. Selama ini digunakan gen GFP yang berasal dari Aequorea victoria yang dikemas dalam bentuk plasmid misalnya plasmid pcambia yang harganya mahal. Oleh karena itu, utnuk mengurangi biaya penelitian, diperlukan adanya alternatif baru sumber gen GFP yang berasal dari ubur-ubur asli Indonesia. Sehingga dapat menekan biaya penelitian GFP khususnya di Indonesia.. BAHAN DAN CARA KERJA Sampling dan Identifikasi Penelitian dilakukan pada bulan Januari sampai April 2010. Pengambilan sampel ubur-ubur di Pantai Marina Semarang. Ubur-ubur yang diperoleh diambil Fakultas Biologi UGM, Yogyakarta 24-25 September 2010 1051

Seminar Nasional Biologi 2010 gambarnya kemudian diletakkan di dalam ice box untuk dibawa ke laboratorium sebagai bahan penelitian. Identifikasi uburubur dilakukan dengan pengamatan morfologi. Setelah itu, dicocokkan dengan literatur Marine Conservation Society Jellyfish Survey yang diakses pada www.mcsuk.org tanggal 15 April 2010. Isolasi DNA Genom Ubur-Ubur Sebanyak 200 mg ubur-ubur diberi liquid nitrogen kemudian digerus sampai berbentuk serbuk. Setelah itu DNA genom dari serbuk ubur-ubur diisolasi sesuai protokol Qiagen Genomic Midi Kit (QIAGEN GmBH, Jerman). DNA hasil isolasi dicek dengan gel elektroforesis agarosa 0,8%, 50 ma, selama 45 menit. Kuantifikasi DNA dilakukan dengan spektrofotometer λ260/280 nm. Identifikasi gen Green Fluorescens Protein (GFP) dengan Polymerase Chain reaction (PCR) DNA genom ubur-ubur diamplifikasi menggunakan empat macam oligo nukleotida primer spesifik untuk gen GFP dengan PCR. Oligo DNA primer didesain secara spesifik berdasarkan sekuen gen GFP pada Aequoria victoria [5] (Tabel 1). Keempat primer ini akan menempel di lokasi-lokasi spesifik pada gen GFP. DNA ubur-ubur yang telah diekstraksi dikeluarkan dari freezer -20 o C lalu dicairkan dengan digenggam menggunakan tangan kemudian divortex dan spindown. DNA ubur-ubur ini digunakan sebagai cetakan (template). Tahap selanjutnya dibuat campuran reaksi untuk PCR yang terdiri dari DNA genom, PCR kit (Roche ), serta primer spesifik untuk gen GFP. PCR dilakukan dengan Thermalcycler menggunakan program predenaturasi 94ºC selama 4 menit sebanyak satu siklus, denaturasi 94ºC, annealing suhu bervariasi, dan elongasi 72ºC masing-masing selama 1 menit sebanyak 30 siklus serta tahap terakhir elongasi 72ºC selama 1 menit sebanyak satu siklus. Pada reaksi PCR digunakan plasmid pcambia yang membawa gen GFP sebagai kontrol positif. Tabel 1. Primer spesifik gen GFP 1052 Fakultas Biologi UGM, Yogyakarta 24-25 September 2010

Seminar Nasional Biologi 2010 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil amplifikasi fragmen DNA dari ubur-ubur lokal gen GFP menunjukkan adanya perbedaan urutan pasangan basa di beberapa bagian ketika dibandingkan dengan gen GFP Aequorea victoria kontrol positif (plasmid pcambia). Perbedaan itu antara lain berada di bagian ujung depan, ujung belakang dan tengah gen. Pada sampel tidak terdapat urutan primer A diujung depan dan diujung belakang (Gambar 2). Hal ini ditunjukkan dengan pasangan primer A tidak menghasilkan fragmen DNA (hasil negatif) (Gambar 1). Perbedaan selanjutnya yaitu pada bagian tengah gen (Gambar 2). Pada sampel tidak memiliki urutan nukleotida primer B (Fw) dan D (rev). Hal ini ditunjukkan dengan tidak munculnya fragmen dari kedua primer tersebut (Gambar 1). Perbedaan yang terakhir yaitu pada sampel letak primer C (fw) berbeda dengan kontrol. Pada kontrol letak primer tersebut berada lebih di tengah sedangkan pada sampel letaknya lebih dekat ke ujung belakang (Gambar 2). Hal ini ditunjukkan menggunakan primer B (rev) dan C (Fw) pada sampel ukurannya lebih kecil dari pada kontrol, pada sampel sekitar 100 kb sedangkan pada sampel sekitar 400 kb (Gambar 1). Sedangkan persamaanya memiliki urutan primer B yaitu didekat ujung depan dan urutan didekat ujung belakang, hasil amplifikasi menunjukkan ukuran yang sama yaitu sekitar 700 kb. Berdasarkan hasil analisis fragmen DNA hasil amplifikasi gen GFP dengan empat primer tersebut dapat diketahui bahwa Rhizostoma sp. dari pantai Marina memiliki gen GFP yang strukturnya berbeda dengan gen GFP A.victoria. Perbedaan pada urutan nukleotida tersebut akan membuat struktur tiga dimensi dari protein GFP yang dihasilkan berbeda dan merupakan ciri khas GFP ubur-ubur lokal Semarang Rhizostoma sp. Hal ini merupakan penemuan baru yang berpotensi untuk dipatenkan sebagai gen GFP asli Indonesia dan dapat menjadi alternatif marka DNA yang murah. Fakultas Biologi UGM, Yogyakarta 24-25 September 2010 1053

Seminar Nasional Biologi 2010 Gambar 1. Hasil amplifikasi dengan primer spesifik GFP pada A. Victoria (pcambia) dan Rhizostoma sp. M, marka λ/styi; lajur 1, pcambia dengan primer A; lajur 2, Rhizostoma sp. dengan primer A; lajur 3, pcambia dengan primer B; lajur 4, Rhizostoma sp. dengan primer B; lajur 5, pcambia dengan primer B (fw) dan D (rev); lajur 6, Rhizostoma sp. dengan primer B (fw) dan D (rev); lajur 7, pcambia dengan primer B (rev) dan C (fw); lajur 8, Rhizostoma sp. dengan primer B (rev) dan C (fw). D R1 Gambar 2. Peta struktur gen GFP pada Aequoria victoria dan Rhizostoma sp. Dari hasil penelitian yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa ubur-ubur Semarang (Rhizostoma sp.) memiliki gen GFP yang memiliki struktur yang berbeda dengan gen GFP Aequorea victoria dan berpotensi sebagai alternatif marka DNA. 1054 Fakultas Biologi UGM, Yogyakarta 24-25 September 2010

Seminar Nasional Biologi 2010 UCAPAN TERIMA KASIH Penelitian ini didanai DIKTI melalui Program Kreatifitas Mahasiswa 2009. Keluarga dan teman kami Kelompok Studi Kelautan atas bantuan dan supportnya. DAFTAR PUSTAKA [1] Chalfie, M. and S.R. Kain. 2006. Green Fluorescent Protein Properties, Applications, and Protocols. John Wiley and Sons, Inc. New Jersey, pp. 4, 40. [2] Chalfie, M., T. Y. Euskirchen, W.W. Ward, and D.C.Prasher. 1994. Green Fluorescent Protein as a Marker for Gene Expression. Science 263: 802-805. [3] Hajra, S. 2008. Use of Living Colors in Biology. University Of Texas, p. 2. [4] Watkins,J.N. and A.K. Campbell. 1995. GFP gene; green-fluorescent protein. http://getentry.ddbj.nig.ac.jp/searc h/ get_entry?mode=view&type=flatfil e&database=ddbj&accnumber=x8 3959. tanggal akses 16 April 2010. Fakultas Biologi UGM, Yogyakarta 24-25 September 2010 1505 1051

SEMINAR NASIONAL BIOLOGI 2O1O @Ss SERTIFII(AT Diberikan Kepada: Cahya Kurnia Fusianto sebagai PEMAKALAH Dalam acara SEMINAR NASIONAL BIOLOGI 2010 dengan tema "Prrs7"k( 8,i/oV, {a/a^ Prryrloku S*l"rlaya #ayat' &uol*lagiotu " yang diselenggarakan dalam rangka Lustrum Xl Fakultas Biologi UGM sekaligus menghantarkan purna tugas bagi Prof. Dr. Jusup Subagja, M.Sc., Prof. Dr. Mammed Sagi, M.S., dan Prof. Dr. lssirep Sumardi pada24-25 September 2010 di Fakultas Biologi UGM Yogyakarta, 25 September 2010 Dekan Fakultas Biologi Universitas Gadjah Mada Lustrum Xl F Ketua Panitia Ketua Panitia 20to Dr. Suwarno Hadisusanto, S.U NtP. 19550929 19A203 2 002 NrP. 19541116 198303 1002