BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

Transkripsi

1 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN Pada bab ini akan disajikan hasil dan pembahasan berdasarkan langkah-langkah penelitian yang telah diuraikan dalam bab sebelumnya dalam empat bagian yang meliputi; sampel mtdna, fragmen kb daerah D-loop hasil PCR, hasil sekuensing, serta hasil analisis urutan nukleotida dan mutasi. IV.. Sampel mtdna Pada penelitian ini dianalisis sampel sel yang bersumber dari lima individu dengan umur berbeda. Lima individu tersebut tidak memiliki hubungan kekerabatan antara satu individu dengan individu yang lain (Tabel IV.) Tabel IV.. Data duabelas sampel mtdna yang dianalisis pada lima individu dengan umur berbeda. Nomor Individu Umur Individu (Thn) Jenis Kelamin Jenis sel Yang dianalisis Perempuan Darah (TR) Rambut (TD) Laki-laki Darah (TD) Rambut (TR) Darah (TD) Laki-laki Epitel (TE) Rambut (TR) Darah (TD) Laki-laki Epitel (TE) Rambut (TR) 5 Perempuan Darah (TD) Rambut (TR) TOTAL Jumlah sampel Ket : Kelima individu tersebut tidak memiliki hubungan kekerabatan antara satu individu dengan individu dengan yang lain.

2 Berdasarkan Tabel IV. di atas, sampel-sampel sel tersebut dikelompokkan ke dalam bentuk matriks yang menunjukkan pola distribusi sampel yang dianalisis pada lima individu dengan umur berbeda (Tabel IV.) : Tabel IV.. Pola distribusi sampel yang dianalisis pada lima individu yang berbeda umur dalam bentuk matriks Nomor Umur Jenis Sel individu (Tahun) Darah Rambut Epitel Td Td 5 Td *Td= Tidak dianalisis MtDNA templat disiapkan menggunakan metode lisis sel. Lisis sel dilakukan dalam buffer lisis yang mengandung Tween- (Merck). Tween- adalah detergen non ionik yang dalam larutannya membentuk micelles. Struktur molekul Tween- memiliki bagian hidrofilik yang tersusun oleh senyawa ester atau alkohol dan bagian hidrofobik yang merupakan senyawa hidrokarbon. Interaksi bagian hidrofobik micelles Tween- dengan senyawa fosfolipid dari membran sel membuat senyawa fosfolipid membran larut membentuk campuran micelles dengan Tween-. Inkubasi pada suhu 5 o C selama jam menyebabkan struktur membran sel menjadi rusak. Penambahan enzim proteinase K sebanyak, unit bertujuan untuk mendegradasi enzim-enzim DNAase dan protein lainnya. Enzim proteinase K selanjutnya dideaktivasi pada suhu 5 o C selama 5 menit. Ekstrak DNA hasil lisis langsung dijadikan templat untuk PCR (Noer et al., )

3 IV.. Fragmen kb Daerah D-loop mtdna Hasil PCR Amplifikasi fragmen kb daerah D-loop mtdna untuk semua sampel dilakukan dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) menggunakan primer M dan HVR. Analisis fragmen hasil PCR dilakukan dengan elektroforesis gel agarosa % menggunakan standar puc yang dipotong-potong oleh enzim restriksi HinfI (puc/hinfi), menghasilkan lima fragmen DNA berukuran, 5,,, dan 5 pb (Gambar IV. ). 5 pb 5 pb pb pb 5 pb kb Gambar IV.. Contoh fragmen kb daerah D-loop mtdna. Standar dalam penentuan ukuran fragmen hasil amplifikasi digunakan puc/hinfi, ditunjukkan pada lajur. Kontrol positif dan kontrol negatif masing-masing ditunjukkan pada lajur dan. Lajur, 5,, menunjukkan fragmen kb hasil amplifikasi daerah D-loop mtdna dengan teknik PCR. Amplifikasi PCR berhasil diamati dengan bantuan gel agarosa sebagai pita tunggal DNA yang diperkirakan berukuran kb (Gambar IV.). Proses PCR dikontrol oleh dua macam kontrol, kontrol positif dan kontrol negatif. Kontrol positif mengandung templat DNA yang telah pernah berhasil diamplifikasi. Seperti terlihat pada lajur, kontrol positif menghasilkan satu pita fragmen berukuran kb. Hasil ini menunjukkan bahwa proses PCR yang dilakukan berhasil. Kontrol negatif tidak mengandung templat mtdna dan seperti ditunjukkan pada lajur, kontrol negatif tidak menghasilkan pita. Hal ini

4 5 menunjukkan bahwa hasil amplifikasi yang diperoleh bukan berasal dari kontaminan. Ukuran fragmen hasil PCR dapat dihitung berdasarkan selisih total pasang basa dalam mtdna (5) dengan posisi awal primer M (L5) dan posisi akhir HVR (H) +. Berdasarkan perhitungan tersebut diperoleh ukuran fragmen hasil PCR adalah pasang basa. Posisi ukuran fragmen tersebut pada daerah D-loop dapat digambarkan dalam bentuk diagram (Gambar IV.) : M HVR nt 5 nt 5 nt 5 pb pb nt nt nt pb 5 nt HV HV (pb) pb Gambar IV.. Posisi ukuran fragmen hasil PCR pada daerah D-loop. Fragmen 5 menunjukkan selisih total pasang basa dalam mtdna (5 pb) dengan posisi awal primer M (L5), fragmen pb merupakan posisi akhir HVR (H). Fragmen pb menunjukkan ukuran fragmen hasil PCR. Primer M ditunjukkan dengan warna biru, primer HVR ditunjukkan dengan warna merah. Daerah HV ditunjukkan dengan warna hijau, daerah HV ditunjukkan dengan warna kuning. Warna coklat menunjukkan daerah antara HV dan HV Selanjutnya, fragmen kb hasil PCR sebanyak pb pada sampel dianalisis urutan nukleotidanya. IV.. Hasil Sekuensing Fragmen kb D-loop mtdna Hasil sekuensing diperoleh fragmen kb D-loop mtdna sekitar - pb pada sampel sel. Mengingat bahwa pada daerah HV jumlah variasi mutasi (polimorfik) lebih tinggi dari pada daerah HV, maka pengamatan yang menitikberatkan pada keseluruhan HV dan sebagian HV telah cukup

5 representatif dalam penentuan urutan nukleotida daerah D-loop mtdna. Hasil sekuensing terhadap sampel sel mtdna berasal dari lima individu yang umurnya berbeda diperoleh dalam bentuk elektroforegram. Pada individu umur tahun menunjukkan puncak-puncak elektroforegram yang sama pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut (Gambar IV., Gambar IV., Gambar IV.5 ) : Gambar IV.. Contoh hasil sekuensing berupa elektroforegram daerah D-loop mtdna pada sel darah individu umur tahun (TD) Gambar IV.. Contoh hasil sekuensing berupa elektroforegram daerah D-loop mtdna pada sel epitel individu umur tahun (TE) Gambar IV.5. Contoh hasil sekuensing berupa elektroforegram daerah D-loop mtdna pada sel rambut individu umur tahun (TR)

6 Pada elektroforegram terdapat deretan puncak-puncak dengan warna berbedabeda yang menunjukkan deretan basa dengan notasi A, C, T, G. Puncak warna hijau melambangkan basa adenin (A), Puncak warna biru melambangkan basa sitosin (C), puncak warna merah melambangkan basa timin (T), dan puncak warna hitam melambangkan basa guanin (G). Hasil sekuen daerah D-loop menggunakan primer M menunjukkan bahwa panjang nukleotida beberapa sampel ada yang sama, akan tetapi ada juga yang berbeda. Untuk sampel yang panjang nukleotidanya sama, langsung dilakukan penjajaran, akan tetapi untuk sampel yang panjang nukleotidanya berbeda dalam satu individu, dilakukan pemotongan nukleotida hingga panjangnya sama (lampiran ). Hasil sekuen dalam bentuk elektroforegram kemudian diterjemahkan menjadi urutan nukleotida. Urutan nukleotida daerah D-loop mtdna (Tabel IV.) menunjukkan bahwa urutan nukleotida pada sel darah, epitel, dan rambut individu umur tahun adalah sama. Tabel IV.. Urutan nukleotida daerah D-loop mtdna pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut pada individu umur tahun. Sampel Darah (TD) Posisi nukleotida Urutan nukleotida Epitel (TE) Rambut (TR) Berdasarkan Tabel IV. di atas, urutan nukleotida menunjukkan sama pada sel darah, epitel, dan rambut individu umur tahun. Demikian juga, pada individu

7 dengan umur yang lain yaitu urutan nukleotida menunjukkan sama pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut individu umur tahun. Selain itu, urutan nukleotida sel darah dan sel rambut menunjukkan sama pada masing-masing individu umur,, dan tahun (Lampiran ). Dengan demikian, urutan nukleotida daerah D- loop mtdna pada sel yang berbeda, yaitu sel darah, sel epitel, dan sel rambut menunjukkan urutan nukleotida yang sama tiap individu dengan umur tertentu. IV.. Mutasi D-loop mtdna Sampel Sel yang Berbeda Analisis mutasi pada setiap sampel dilakukan dengan cara membandingkan urutan nukleotida dan elektroforegram sampel terhadap standar CRS yang berfungsi sebagai satandar primer dan sampel lain sebagai standar sekuender. Analisis mutasi menggunakan program komputer Seqman DNASTAR. Hasil analisis terhadap sampel dari lima individu memberikan informasi jumlah, jenis dan posisi mutasi pada urutan nukleotida daerah D-loop mtdna. IV... Mutasi D-loop mtdna Sampel Sel yang Berbeda untuk Satu Individu Hasil analisis mutasi pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut menunjukkan mutasi yang sama pada individu berumur tahun (Gambar IV.). Elektroforegram daerah D-loop mtdna menunjukkan mutasi transisi TC dan mutasi transisi CT yang sama pada sel darah, epitel, dan rambut individu umur tahun. Demikian pula, elektroforegram daerah D-loop mtdna yang menunjukkan mutasi transversi AC dan AC, dan mutasi transisi TC sama pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut pada individu umur tahun dibandingkan standar primer (CRS) dan standar sekunder yang berasal dari sampel pada individu lain (Gambar IV.). Sampel lain yang difungsikan sebagai standar sekunder memiliki posisi nukleotida yang sama dengan sampel yang dianalisis mutasinya. Standar sekunder tersebut digunakan untuk membandingkan mutasi yang terjadi pada sampel yang dianalisis tersebut dengan mutasi yang terjadi pada sampel lain terhadap CRS pada posisi nukleotida yang sama.

8 CRS a). b). c). d). TD TD TE TR Gambar IV.. Elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan a).mutasi transisi TC, b). mutasi transisi CT, c). mutasi transversi AC dan AC, dan d). mutasi transisi TC sama pada sel darah (TD), sel epitel (TE), dan sel rambut (TR) pada individu umur tahun dibandingkan standar primer (CRS) dan standar sekunder (sampel lain, TD) Dengan demikian, individu umur tahun memiliki lima mutasi yang sama pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut. Satu mutasi transisi diantaranya CT yang menyebabkan timbulnya poli C yang juga sama pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut (Tabel IV.). Urutan nukleotida poli C menunjukkan bahwa urutan nukleotida selanjutnya tidak dapat dibaca lagi dengan jenis primer sekuensing yang sama yaitu primer M. Oleh karena itu, dilakukan sekuensing menggunakan primer M menghasilkan enam mutasi yang sama pada sampel darah dan rambut individu umur tahun (Tabel IV.). Tabel IV.. Ringkasan mutasi pada sampel sel darah, sel epitel, dan sel rambut individu umur tahun Primer sekuensing M M Posisi nukleotida CRS T C A T A A C - C - Darah C T C C C G G T C C C Epitel C T C C C Rambut C T C C C G G T C C C 5

9 Sementara itu, individu umur tahun memiliki delapan mutasi pada daerah D- loop yang sama pada sel darah, sel rambut, dan sel epitel. Elektroforegram daerah D-loop menunjukkan mutasi transisi TC sama pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut pada individu umur tahun dibandingkan dengan standar primer (CRS) dan standar sekunder yang berasal dari sampel pada individu lain (Gambar IV.). CRS a). b). c). d). TD TE TR TD Gambar IV.. Contoh elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan a). mutasi transisi TC, dan b). mutasi transisi CT, c). mutasi transisi CT dan d). mutasi transisi C5T yang sama pada sel darah (TD), sel epitel (TE), dan sel rambut (TR) pada individu umur tahun dibandingkan dengan CRS sebagai standar primer dan sampel lain (TD) yang difungsikan sebagai standar sekunder Demikian juga, elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan mutasi transisi C5T dan CT sama pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut pada individu umur tahun dibandingkan dengan CRS sebagai standar primer dan sampel lain (TD) yang difungsikan sebagai standar sekunder. Elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan mutasi lain pada sampel individu umur tahun secara lengkap pada lampiran. Dengan demikian, individu umur tahun memiliki delapan mutasi pada daerah D-loop yang sama pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut (Tabel IV.5).

10 Tabel IV.5. Ringkasan mutasi pada sampel sel darah, sel epitel, dan sel rambut individu umur tahun Primer sekuensing Posisi nukleotida 5 M CRS T C C C C G A G Darah C T T T T A G A Epitel C T T T T A G A Rambut C T T T T A G A 5 IV... Mutasi D-loop mtdna sampel sel yang berbeda untuk beberapa individu dengan umur yang berbeda Elektroforegram daerah D-loop mtdna pada sel berbeda untuk individu umur tahun dan tahun, menunjukkan bahwa tiap individu tersebut memiliki mutasi yang sama pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut. Individu umur tahun memiliki lima mutasi yang sama pada sel darah, sel rambut dan sel epitel, satu mutasi transisi diantaranya TC yang menyebabkan timbulnya poli C yang juga sama pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut. Urutan nukleotida poli C menunjukkan bahwa urutan nukleotida selanjutnya tidak dapat dibaca lagi dengan jenis primer sekuensing yang sama yaitu primer M. Oleh karena itu, dilakukan sekuensing menggunakan primer M menghasilkan enam mutasi yang sama pada sel darah dan sel rambut individu umur tahun (Tabel IV.). Berdasarkan hasil analisis mutasi pada sel darah dan sel rambut individu umur tahun yang disekuensing dengan primer M, ditemukan satu mutasi transisi AG yang merupakan komplemen dari mutasi transisi TC. Jenis mutasi yang dominan pada kedua sampel tersebut adalah mutasi transisi, satu mutasi insersi C yang sama pada sel darah dan rambut. Dengan demikian, daerah D-loop mtdna telah berhasil ditentukan varian mutasi yang menunjukkan mutasi yang sama pada sampel sel darah dan sel rambut individu umur tahun (Tabel IV.). Demikian pula, individu umur tahun memiliki

11 delapan mutasi pada daerah D-loop yang sama pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut. Elektroforegram daerah D-loop menunjukkan mutasi transisi TC sama pada sel darah, sel epitel, dan sel rambut pada individu umur tahun dibandingkan dengan standar primer (CRS) dan standar sekunder yang berasal dari sampel pada individu lain (Gambar IV.). Sementara itu, elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan mutasi yang sama pada sel darah dan sel rambut ditemukan pada tiap individu umur,, dan tahun (lampiran ). Individu umur tahun memiliki tiga mutasi yang sama pada sel darah dan sel rambut. Elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan satu mutasi transisi CT, satu mutasi insersi pada posisi C, dan satu mutasi transisi TC masing-masing menunjukan mutasi yang sama pada sel darah dan sel rambut pada individu umur tahun dibandingkan standar primer (CRS) dan sampel lain (TD) yang difungsikan sebagai standar sekunder (Gambar IV.). CRS a). b). c). TD TR TD Gambar IV.. Elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan a). mutasi transisi CT, b). mutasi insersi C, dan c). mutasi delesi T sama pada sel darah (TD) dan sel rambut (TR) pada individu umur tahun dibandingkan standar primer (CRS) dan standar sekunder (sampel lain, TD)

12 Satu mutasi insersi C menyebabkan pembacaan urutan nukleotida pada urutan CRS bergeser satu basa ke kiri, sehingga mutasi yang ditunjukkan sebagai mutasi delesi T (Gambar IV.c) bergeser pembacaannya menjadi mutasi transisi TC yang menyebabkan timbulnya urutan nukleotida poli C. Namun demikian, ketiga mutasi pada sampel tersebut menunjukkan sama pada sel darah dan sel rambut individu umur tahun. Tabel IV.. Ringkasan mutasi pada sampel sel darah dan sel rambut individu umur tahun Primer sekuensing M Posisi nukleotida CRS C A T Darah T C C Rambut T C C Demikian pula, individu umur tahun menunjukkan mutasi yang sama pada sel darah dan rambut. Elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan mutasi insersi G, mutasi transisi TC, mutasi transversi CA, mutasi delesi A, dan mutasi transisi TC yang sama pada sel darah dan rambut pada individu umur tahun dibandingkan standar primer (CRS) dan sampel pada individu lain (TD) yang difungsikan sebagai standar sekunder (Gambar IV.).

13 CRS a). b). c). d). e). TD TD TR Gambar IV.. Elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan a). mutasi insersi G, b). mutasi transisi TC, c). mutasi transversi CA, d). mutasi delesi A, e). mutasi transisi TC yang sama pada sel darah (TD) dan sel rambut (TR) pada individu umur tahun dibandingkan standar primer (CRS) dan standar sekunder (sampel lain, TD) Satu mutasi insersi G menyebabkan pembacaan urutan nukleotida berikutnya pada urutan CRS bergeser satu basa ke kiri, sehingga mutasi yang ditunjukkan sebagai mutasi transisi TC (Gambar IV.e) bergeser pembacaannya menjadi mutasi transisi TC yang menyebabkan timbulnya urutan nukleotida poli C. Namun demikian, lima mutasi pada sampel tersebut menunjukkan mutasi yang sama pada sel darah dan sel rambut individu umur tahun (Tabel IV.). Tabel IV.. Ringkasan mutasi pada sampel sel darah dan sel rambut individu umur tahun Primer M sekuensing Posisi nukleotida CRS - T C A T Darah G C A - C Rambut G C A - C

14 5 Sementara itu, individu umur tahun menunjukkan tujuh mutasi yang sama pada sel darah dan sel rambut. Elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan mutasi transisi CT, mutasi transisi GA, mutasi transisi TC, mutasi transisi TC, dan mutasi transisi CT yang sama pada sel darah dan sel rambut pada individu umur tahun dibandingkan standar primer (CRS) dan standar sekunder yang berasal dari sampel individu lain (TR) yang difungsikan sebagai standar sekunder (Gambar IV.). CRS a). b) c). d). e) TR TD TR Gambar IV.. Elektroforegram daerah D-loop yang menunjukkan a). mutasi transisi CT, b). mutasi transisi GA, c). mutasi transisi TC, d). mutasi transisi TC, e). mutasi transisi CT yang sama pada sel darah (TD) dan sel rambut (TR) pada individu umur tahun dibandingkan standar primer (CRS) dan standar sekunder (sampel lain, TR) Mutasi transisi GA (Gambar IV.b) menunjukkan sama pada sel darah dan sel rambut individu umur tahun, jenis mutasi ini juga ditemukan pada pasien osteosarcoma (Guo Guang, ). Mutasi transisi GA tersebut di atas hanya ditemukan pada individu umur tahun yang menunjukkan mutasi yang sama pada sel darah dan sel rambut. Demikian juga, elektroforegram yang menunjukkan mutasi transisi TC dan T5C menunjukkan mutasi yang sama pada sel darah dan sel rambut individu umur tahun (lampiran ). Dengan demikian, pada individu umur tahun ditemukan tujuh mutasi yang sama pada sel darah dan sel rambut (tabel IV.).

15 Tabel IV.. Ringkasan mutasi pada sampel sel darah dan sel rambut individu umur tahun. Primer sekuensing M Posisi nukleotida 5 CRS C G T T C T T Darah T A C C T C C Rambut T A C C T C C Posisi dan jenis mutasi pada sel darah dan sel rambut individu umur tahun di atas adalah sama. Dengan demikian, urutan nukleotida daerah D-loop mtdna pada sel yang dianalisis, dengan CRS sebagai standar menunjukkan mutasi yang sama pada sel berbeda tiap individu (Tabel IV.). Tabel IV.. Total mutasi mtdna D-loop pada sampel yang dianalisis. Mutasi dengan CRS sebagai standar pada dua belas sampel sel terdiri dari sel darah, sel epitel dan sel rambut berasal dari lima individu dengan umur,,,, dan tahun. Primer sekuensing M Posisi nukleotida Posisi nukleotida 5-5 CRS C T G - T T C C C C A - A T C C T C G A T G Darah T C C Rambut T C C Darah G C A - C Rambut G C A - C Darah C T C C C Epitel C T C C C Rambut C T C C C Darah C T T T T A G A Epitel C T T T T A G A Rambut C T T T T A G A Darah T A C C T C C Rambut T A C C T C C 5 5 5

16 Dalam mtdna, mutasi adalah perbedaan nukleotida yang terdapat pada sampel dibandingkan dengan standar CRS karena CRS belum tentu wild type. Jenis mutasi yang dominan pada kedua belas sampel dari lima individu tersebut adalah mutasi transisi yaitu mutasi yang disebabkan oleh perubahan dari basa Purin menjadi basa Purin yang lain yaitu dari basa Adenin menjadi basa Guanin, dan atau perubahan dari basa Pirimidin menjadi basa Pirimidin yang lain yaitu basa Timin menjadi basa Sitosin, atau sebaliknya. Mutasi transversi selalu lebih sedikit dibandingkan dengan mutasi transisi. Hal ini karena tahapan reaksi mutasi transversi lebih panjang dibandingkan dengan mutasi transisi. Hasil analisis penentuan urutan nukleotida yang ditentukan dengan metoda dideoksi Sanger untuk semua sampel berjumlah kurang lebih 5.5 pb, telah berhasil diperoleh. Hasil analisis urutan nukleotida menggunakan program seqman DNASTAR dengan CRS sebagai rujukan menunjukkan bahwa untuk tiga sel yang berbeda, yaitu sel darah, sel epitel, dan sel rambut, pada individu berumur tahun dan tahun, posisi dan jenis mutasi masing-masing individu tersebut adalah sama. Sementara itu, analisis urutan nukleotida sel darah dan sel rambut individu berumur,, dan tahun juga menunjukkan posisi dan jenis mutasi yang sama.urutan nukleotida D-loop mtdna sama pada sel berbeda tiap individu. Hal ini disebabkan oleh karena sel-sel tersebut bersumber dari satu sel telur yang memiliki satu jenis mtdna kemudian terdiferensiasi seiring dengan perkembangan embrio. Pada fase perkembangan selanjutnya menjadi manusia dewasa, diferensisasi ini tidak menyebabkan adanya perubahan pada urutan nukleotida mtdna pada sel rambut, epitel, dan darah dalam satu individu. Dengan demikian, ketiga jenis sel tersebut dapat dikatakan mewakili keseluruhan jenis sel yang ada pada tubuh manusia. Berdasarkan hal tersebut di atas, dapat diusulkan untuk menggunakan salah satu dari sel darah atau sel epitel atau sel rambut dalam keperluan identifikasi forensik. Hal ini didasarkan pada temuan penelitian ini bahwa urutan nukleotida D-loop mtdna sama pada ketiga sel tersebut untuk berbagai individu dengan umur berbeda.