Pengujian DNA, Prinsip Umum

Transkripsi

1 Pengujian DNA, Prinsip Umum Pengujian berbasis DNA dalam pengujian mutu benih memang saat ini belum diregulasikan sebagai salah satu standar kelulusan benih dalam proses sertifikasi. Dalam ISTA Rules, beberapa pengujian mutu benih telah mencantumkan pilihan metode dengan berbasis DNA, contohnya pengujian deteksi kesehatan benih dan deteksi Genetically Modified Organism (GMO). Balai Besar Pengembangan Pengujian Mutu Benih Tanaman Pangan dan Hortikultura sendiri, sudah sejak lama melaksanakan kegiatan pengembangan metode pengujian verifikasi varietas dengan berbasis DNA. Pada tahun 2014 dan 2015 melaksanakan pengembangan metode pengujian kesehatan benih cendawan dengan metode DNA yaitu cendawan Colletothricum pada cabai (2014, semangka dan melon (2015). Pada tahun 2014, sebagai penyelenggara pelatihan internasional dengan narasumber dari ISTA, juga mengakomodir pengujian deteksi cendawan Colletothricum. Secara teknis, prinsip umum pengujian DNA baik untuk verifikasi varietas, pengujian kesehatan benih maupun deteksi GMO adalah sama. Pengujian terdiri dari tiga tahapan yaitu isolasi DNA, amplifikasi DNA hasil isolasi menggunakan marka tertentu, dan terakhir adalah elektroforesis hasil PCR dan visualisasi. A. Isolasi DNA Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA. Prinsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik dan bahan yang digunakan. Bahkan beberapa teknik menjadi lebih mudah dengan menggunakan kit. Isolasi DNA pada tanaman dapat dilakukan dari berbagai organ baik daun, batang, akar maupun duri, namun umumnya jaringan yang diambil adalah jaringan yang masih muda karena belum mengandung banyak metabolit sekunder yang mengotori DNA hasil isolasi. Tahap pertama dalam isolasi DNA adalah proses perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel untuk memecah sel dan mengeluarkan isi sel. Tahap ini dapat dilakukan dengan beberapa cara yakni dengan cara fisik seperti menggerus sampel dengan menggunakan mortar dan pestle dalam nitrogen cair atau cara kimiawi maupun enzimatik. Penghancuran dengan menggunakan kimiawi misalnya dengan menggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada membran sel sehingga terjadi destabilisasi membran sel, dan cara enzimatik seperti menggunakan proteinase K untuk melisiskan membran serta mendegradasi protein globular maupun rantai polipeptida dalam komponen sel. Tahap yang kedua yaitu ekstraksi DNA. Pada tahapan ekstraksi DNA, biasanya digunakan chelating agent seperti ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA) yang berperan menonaktivkan enzim DNase yang dapat mendenaturasi DNA. Larutan Fenol digunakan sebagai pendenaturasi protein, yang bertujuan menyebabkan protein kehilangan kelarutannya dan mengalami presipitasi yang selanjutnya dapat dipisahkan dari DNA melalui sentrifugasi. Selain fenol, dapat pula digunakan campuran fenol dan kloroform atau campuran fenol, kloroform, dan isoamil alkohol untuk mendenaturasi protein. Setelah proses ekstraksi, DNA yang didapat dapat dipekatkan melalui presipitasi dengan menggunakan etanol dan isopropanol. Kedua senyawa tersebut akan mempresipitasi DNA pada fase aquoeus sehingga DNA menggumpal membentuk

2 struktur fiber dan terbentuk pellet setelah dilakukan sentrifugasi. Setelah didapatkan pellet DNA, dilakukan pelarutan DNA dengan menggunakan buffer TE atau H2O setelah pellet terlebih dahulu dikeringkan. Larutan DNA ini selanjutnya dapat diuji kualitatif dan kuantitatif dengan sperktrofotometer atau nanodrop serta dengan elektroforesis. Uji dengan spektrofotometer atau nanodrop pada prinsipnya adalah dengan menghitung perbedaan penyerapan cahaya UV dimana pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedang kontaminan protein atau phenol dapat menyerap cahaya pada 280 nm. Nilai kemurnian DNA dihitung dengan cara absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 (Å260/Å280), dan nilai kemurnian DNA berkisar antara B. Proses Penggandaan DNA dengan menggunakan marka tertentu (Polymerase Chain Reaction/PCR) Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah teknik sintesis dan amplifikasi DNA secara in vitro yang digunakan untuk menyalin segmen DNA hingga jutaan kali dalam waktu yang cukup singkat. Pertama kali dikembangkan pada 1985 oleh Karry Mullis. Komponen komponen yang harus ada dalam sebuah reaksi PCR antara lain : a. DNA Template DNA merupakan DNA target yang nantinya akan diamplifikasi menggunakan PCR. DNA template didapat dari hasil isolasi dan ekstaksi DNA. Untuk proses PCR, DNA tempate dapat diencerkan ataupun tidak tergantung dari kuantitasnya. b. Primer Primer adalah sekuens DNA yang komplemen terhadap sekuens yang akan diamplifikasi dalam proses PCR. c. Deoxynucleoside triphosphates (dntps) dntps merupakan material utama yang dibutuhkan untuk sintesis DNA dalam proses PCR yang terdiri dari datp, dgtp, dctp dan dttp. d. Enzim DNA polimerase Fungsi dari enzim DNA polimerase adalah bekerjasama dengan dntp agar dapat melakukan proses polimerisasi primer e. Larutan penyangga (buffer) Salah satu fungsi dari larutan buffer dalam proses PCR adalah menyediakan lingkungan yang cocok untuk aktivitas optimum dan stabilitas DNA polimerase. Buffer ini mengandung ion Mg2+ yang sangat mempengaruhi setiap tahapan reaksi PCR. Tahapan yang terjadi dalam proses PCR sehingga terbentuk suatu pita adalah : 1. Pemisahan / Denaturasi DNA Template Denaturasi adalah proses pemisahan DNA dari double strand menjadi single stand. Proses denaturasi biasanya dilakukan pada suhu 94 atau 95 o C. 2. Penempelan/ annealing primer DNA yang terpisah pada proses denaturasi dan menjadi single strand selanjutnya akan berpasangan dengan primer yang susunannya komplemen dengan DNA tadi.

3 3. Pemanjangan/ Extension Hasil penempelan antara primer dan DNA template selanjutnya akan memperpanjang diri/ bereplikasi berkali kali dengan bantuan enzim DNA polimerase dan dntps sebagai sumber nukleotida. Proses PCR seperti pada gambar berikut Gambar 1. Proses PCR

4 Secara abstrak, proses penggandaan DNA dalam PCR seperti terlihat pada gambar berikut. Gambar 2. Proses terjadinya penggandaan DNA dalam PCR

5 C. Setelah proses PCR selesai, untuk mengetahui apakah proses PCR berhasil mengamplifikasi DNA atau tidak, maka dilakukan elektroforesis. Elektroforesis digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA. Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju dari kutub negatif ke kutub positif. Hasil elektroforesis yang terlihat adalah terbentuknya band yang merupakan fragmen DNA hasil amplifikasi dan menunjukkan potongan-potongan jumlah pasangan basanya. Elektroforesis menggunakan media berupa gel dari agarose ataupun akrilamid dengan pelarut menggunkan buffet Tris Asetat EDTA (TAE) atau Tris Borat EDTA (TBE). Gel dibuat dengan melarutkan agarose atau akrilamid dengan salah satu buffer tersebut dengan menggunakan cetakan khusus dan terdapat sumuran/ whell untuk menempatkan hasil PCR yang akan dirunning elektroforesis (Gambar 3). Sumuran Gambar 3. Gel agarose untuk elektroforesis. Selain produk hasil PCR, dalam elektroforesis juga dicampurkan loadind dye yang berfungsi sebagai pemberat agar DNA tidak keluar dari sumuran. Untuk megetahui ukuran pasang basa hasil amplifikasi, maka pada salah satu sumuran diisi marker DNA/ DNA Ladder dengan ukuran tertentu. DNA ladder yang digunakan biasanya menyesuaikan dengan besar pasang basa target yang dicari, misalnya untuk pita DNA dengan target 150 basepair (bp) digunakan DNA ladder dengan ukuran 50bp, dan untuk DNA target di atas 1000bp digunakan 1kb ladder. Elektroforesis dilakukan dengan menepatkan gel agarose dalam bak/chamber elektroforesis yang didalamnya berisi buffer yang sama dengan pelarut yang digunakan untuk membuat gel (TAE atau TBE) dan terhubung dengan power supply yang dapat diatur arusnya. Setelah elektroforesis selesai, umumnya dilakukan pewarnaan dengan merendam agar pada larutan Etidium bromida (Etbr) 1% selama 15 menit, kemudian membilasnya dengan merendam pada air selama 30 menit. Karena sifatnya yang karsinogenik, saat ini telah banyak pewarna pengganti Etbr yang lebih ramah lingkungan

6 dan aman. Staining atau pewarnaan dapat dilakukan pada saat pembuatan agarose yaitu dicampurkan setelah agarose larut/ masak ataupun dicampurkan pada loading dye yang digunakan dalam elektroforesis. Hasil elektroforesis divisualisasi dengan UV transiluminator dengan sinar infra red. Jika amplifikasi terjadi maka akan terlihat pita pita DNA yang berpendar oleh sinar infra red (Gambar 4.). Gambar 4. Pita DNA yang divisualisasi dengan menggunakan UV transilluminator Penulis : Alfin Widiastuti, S.P, M.Si Pengawas Benih Tanaman Balai Besar PPMB-TPH