IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

Transkripsi

1 24 IV. HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil Perhitungan Kepadatan Artemia dan Kutu Air serta Jumlah Koloni Bakteri Sebanyak 1,2 x 10 8 sel bakteri hasil kultur yang membawa konstruksi gen keratin-gfp ditambahkan ke dalam media perendaman Artemia dengan kepadatan ekor (202,17±0,12 mg berat basah) atau sekitar 100 ekor/ml (Tabel 4). Karena ukuran naupli Artemia dan kutu air berbeda, maka jumlah individu kutu air yang dimasukkan ke dalam media perendaman disesuaikan berdasarkan persamaan berat basah. Dengan berat basah yang sama, dalam 202,57±0,10 mg kutu air terdapat sebanyak ekor. Hasil ini menunjukkan bahwa dengan berat yang sama, perbandingan jumlah individu antara Artemia dan kutu air adalah sekitar 1:3. Tabel 4. Jumlah sel bakteri, kepadatan Artemia dan kutu air No Perlakuan Bobot Basah Jumlah Artemia (mg) (ekor) 1 Artemia 202,17 ± 0,12 a Kutu Air 202,57 ± 0,10 a Jumlah Sel Bakteri (cfu/ml) 1,2 x 10 8 Keterangan: huruf yang sama di belakang nilai bobot basah Artemia dan kutu air menunjukkan tidak berbeda nyata (p>0,05) Produk Isolasi DNA Genom Artemia dan Kutu Air Isolasi DNA genom dari Artemia dan kutu air telah berhasil dilakukan dengan kualitas (kemurnian) dan kuantitas berdasarkan spektrofotometer ditunjukkan pada Tabel 5. Analisis kualitas berdasarkan elektroforesis pada gel agarosa 0,7% ditunjukkan pada Gambar 5. DNA hasil isolasi genom Artemia dengan rasio berkisar antara 1,778-1,949 menunjukan bahwa DNA pada masingmasing perlakuan adalah bersih atau bebas kontaminan. Hal ini seperti dikatakan oleh Muladno (2002), bahwa DNA dikatakan murni apabila nilai rasio (λ 260 /λ 280 ) berkisar antara 1,8-2,0. Dengan demikian, DNA hasil isolasi tersebut layak digunakan untuk proses amplifikasi PCR. Konsentrasi DNA hasil isolasi berkisar antara ng/µl.

2 25 Tabel 5. Konsentrasi dan kemurnian DNA genom hasil isolasi dari Artemia Perlakuan [DNA] (ng/µl) Rasio (λ 260 /λ 280 ) Kemurnian (%) A1 96 1, A , A , A , A , A , NA 92 1, M A1 A2 A3 A4 A5 A6 NA 10 kb 8 kb 5 kb 3 kb 2 kb 1,2 kb Gambar 5. Elektroforesis hasil isolasi DNA Artemia. A1: perlakuan perendaman Artemia selama 30 menit, A2: selama 1 jam, A3: selama 1,5 jam, A4: selama 2 jam, A5: selama 2,5 jam, dan A6: selama 3 jam. NA: DNA Artemia tanpa perlakuan perendaman. M: Marker DNA 1 kb ladder. Angka di sebelah kiri gambar menunjukkan ukuran fragmen DNA marker. Seperti halnya Artemia, isolasi DNA genom dari kutu air pun telah berhasil dilakukan dengan kualitas (kemurnian) dan kuantitas berdasarkan spektrofotometer ditunjukkan pada Tabel 6, dan pengecekan kualitas berdasarkan elektroforesis pada gel agarosa 0,7% ditunjukkan pada Gambar 6. Rasio (1,722-1,925) dan kemurnian (95-100%) yang baik pun ditunjukan pada DNA genom hasil isolasi dari kutu air (Tabel 6). Kualitas DNA tersebut layak digunakan untuk proses amplifikasi PCR. Konsentrasi DNA hasil isolasi berkisar antara ng/µl, lebih tinggi dibandingkan dengan DNA genom dari Artemia.

3 26 Tabel 6. Konsentrasi dan kemurnian DNA genom hasil isolasi dari kutu air Perlakuan [DNA] (ng/µl) Rasio (λ 260 /λ 280 ) Kemurnian (%) D , D , D , D , D , ND 156 1, M D1 D2 D3 D4 D5 ND 10 kb 8 kb 6 kb 5 kb Gambar 6. Elektroforesis hasil isolasi DNA kutu air. D1: perlakuan perendaman kutu air selama 2 jam, D2: selama 4 jam, D3: selama 6 jam, D4: selama 8 jam, dan D5: selama 10 jam. NA: DNA kutu air tanpa perlakuan perendaman. M: Marker DNA 1 kb ladder. Angka di sebelah kiri gambar menunjukkan ukuran fragmen DNA marker Perancangan Primer β-aktin Artemia dan Kutu Air Primer β-aktin Artemia dan kutu air dirancang sebagai kontrol internal loading DNA dalam amplifikasi PCR. Baik primer β-aktin Artemia maupun kutu air dirancang dengan memilih lokasi potensial primer hasil penyejajaran basa nukloetida yang memiliki tingkat homologi paling tinggi (Gambar 7). Panjang sekuen berkisar basa nukleotida. Sekuen basa nukleotida untuk primer β- aktin Artemia adalah BAr-F (5 -GCCATGTATGTTGCCATCCARG-3 ) dan BAr-R (5 -TCAGCAGTGTGGTGGTRAARGA-3 ), sedangkan sekuen primer β- aktin kutu air adalah BDa-F (5 -GACATCAAGGAGAARYTBTGCTAY-3 ) dan BDa-R (5 -GTACAGATCCTTACGGATGTCGAC-3 ). Primer forward dan reverse untuk Artemia, dan forward untuk kutu air merupakan primer mix, dengan R=A+G; Y=C+T; dan B=C+G+T.

4 27 Artemia franciscana.txt 361 ACTCAGATTATGTTTGAGACCTTCAACAGCCCAGCCATGTATGTTGCCATCCAAGCCGTA CAGAT ATGTT TTCAACA CC GCCATGTATGTTGCCATCCA GC GT 420 Artemia sp.txt 360 ACTCAGATCATGTTCGAAACATTCAACACCCCTGCCATGTATGTTGCCATCCAAGCCGTG CAGAT ATGTT TTCAACA CC GCCATGTATGTTGCCATCCA GC GT 419 Calanus.txt 124 ACCCAGATCATGTTCGAGACCTTCAACATGCCCGCCATGTATGTTGCCATCCAGGCTGTC CAGAT ATGTT TTCAACA GCCATGTATGTTGCCATCCA GC GT 183 Artemia franciscana.txt 421 CTTTCACTCTACGCTTCCGGTCGTACAACTGGTATTGTCCTCGACTCTGGTGATGGTGTT TC CTCTA TC GG G ACTGGTAT GT T GA TC GG GATGGTGT 480 Artemia sp.txt 420 CTTTCCCTCTACGCATCTGGTAGAACTACTGGTATCGTTCTTGATTCAGGCGATGGTGTC TC CTCTA TC GG G ACTGGTAT GT T GA TC GG GATGGTGT 479 Calanus.txt 184 CTCTCCCTCTATGCTTCCGGCCGTACCACTGGTATCGTCATGGACTCTGGAGATGGTGTC CTCTA GG G AC ACTGGTAT GT T GA GG GATGGTGT 243 Artemia franciscana.txt 481 TCTCACACCGTTCCCATCTATGAAGGTTATGCCCTTCCTCATGCCATTCTCCGTCTTGAC CA CCC TCTA GAAGG TA GC CTTCC CA GC ATT T G T GA 540 Artemia sp.txt 480 TCACATACCGTACCCATCTACGAAGGCTACGCTCTTCCACACGCAATTTTGAGATTGGAT CCC TCTA GAAGG TA GC CTTCC GC ATT T G T GA 539 Calanus.txt 244 TCCCACGGTGTCCCCGTCTATGAAGGTTATGCCCTTCCCCATGCCATTGTCCGTCTTGAT CA GT TCTA GAAGG TA GC CTTCC CA GC ATT T G T GA 303 Artemia franciscana.txt 541 CTTGCTGGCCGTGACTTGACTGATTATTTGATGAAAATCTTGACTGAACGAGGTTACTCT CG GA T A TA TGATGAA ATC T GA CG GG TA TC 600 Artemia sp.txt 540 CTTGCTGGTCGAGATTTAACCGATTATTTGATGAAAATCCTAACCGAGCGAGGATATTCC CG GA T AC A TA TGATGAA ATC T AC GA CG GG TA TC 599 Calanus.txt 304 CTTGCTGGACGTGAGCTCACCAACTACCTGATGAAGATCCTCACTGAGCGTGGCTACTCT CG GA T A TA TGATGAA ATC T GA CG GG TA TC 363 Artemia franciscana.txt 601 TTCACCACCACTGCTGAGCGTGAAATTGTCCGTGACATAAAGGAAAAACTTTGCTATGTC G GA ATTGT CGTGA AT AA GA AA CTTTG TATG 660 Artemia sp.txt 600 TTTACCACCACTGCTGAAAGAGAAATTGTTCGTGATATCAAAGAAAAACTTTGTTATGTC G GA ATTGT CGTGA AT AA GA AA CTTTG TATG 659 Calanus.txt 364 TTCACCACCACTGCTGAGCGCGAGATTGTCCGTGACATCAAGGAGAAGCTTTGCTATGAA G GA ATTGT CGTGA AT AA GA AA CTTTG TATG 423 BAr R BAr F Gambar 7. Alignment sekuen parsial β-aktin Artemia fransciscana (no. Aksesi Bank Gen: AM ), β-aktin Artemia sp. (no. Aksesi Bank Gen: X ), dan β-aktin Calanus finmarchicus (no. Aksesi Bank Gen: U ). Posisi primer forward BAr-F (5 -GCCATGTATGT- TGCCATCCARG-3 ) dan primer reverse BAr-R (5 -TCAGCA- GTGTGGTGGTRAARG-A-3 ) ditunjukan dengan tanda panah.

5 28 BDa F Daphnia magna Daphnia magna Daphnia magna Daphnia magna Daphnia magna 601 TTCACCACCACCGCTGAGCGTGAAATCGTCCGTGACATCAAGGAGAAATTGTGCTATGTC GAGCGTGAAATCGT CG GACATCAAGGAGAA T TGCTA GTC TTCACCACCACTGCCGAGCGTGAAATCGTTCGTGACATCAAGGAGAAACTTTGCTATGTC GAGCGTGAAATCGT CG GACATCAAGGAGAA T TGCTA GTC TTAACCACCACCGCCGAGCGTGAAATCGTTCGTGACATCAAGGAGAAATTGTGCTACGTCACCACCAC GAGCGTGAAATCGT CG GACATCAAGGAGAA T TGCTA GTC TTCACCACCACCGCTGAGCGTGAAATCGTCCGTGACATCAAGGAGAAATTGTGCTATGTC GAGCGTGAAATCGT CG GACATCAAGGAGAA T TGCTA GTC TTCACCACCACCGCCGAGCGTGAAATCGTTCGCGACATCAAGGAGAAGCTCTGCTATGTC GAGCGTGAAATCGT CG GACATCAAGGAGAA T TGCTA GTC GCCCTTGACTTTGAACAGGAAATGGCCACTGCTGCTGCCTCCACCTCTTTGGAGAAATCC GACTT GAACA GA ATG CCAC G CCTCCAC TC TGGA AA TC GCTTTGGACTTCGAACAAGAGATGGCCACTGCTGCCTCCTCCACTTCATTGGAGAAGTCTT GACTT GAACA GA ATG CCAC G CCTCCAC TC TGGA AA TC GCCCTAGACTTCGAACAGGAAATGGCCACCGCCGATGCCTCCACCTCCTTGGAGAAATCC GACTT GAACA GA ATG CCAC G CCTCCAC TC TGGA AA TC GCCCTGGACTTTGAACAGGAAATGGCCACTGCTGCTGCCTCCACCTCTTTGGAGAAATCC GACTT GAACA GA ATG CCAC G CCTCCAC TC AA TC GCCCTCGACTTTGAACAGGAGATGCCCACCGCCGCCTCCTCCACCTCCCTGGAAAAGTCG GACTT GAACA GA ATG CCAC G CCTCCAC TGGA AA TATGAATTGCCCGATGGTCAGGTCATCACCATTGGCAACGAGCGATTCCGCTGCCCCGAG T GG CAGGTCATCACCAT GG AA CG TT CG TGCCC TACGAACTCCCCGACGGTCAGGTCATCACCATTGGCAATGAGCGATTCCGTTGCCCAGAG T CCCGA GG CAGGTCATCACCAT GG AA TT TGCCC TACGAATTGCCCGATGGCCAGGTCATCACCATCGGTAACGAACGTTTCCGTTGCCCCGAA T CCCGA GG CAGGTCATCACCAT GG AA TT TGCCC TATGAATTGCCCGATGGTCAGGTCATCACCATTGGCAACGAGCGATTTCGCTGCCCCGAG T GG CAGGTCATCACCAT GG AA CG TT CG TGCCC TACGAGCTTCCCGACGGTCAGGTCATCACCATCGGCAATGAGCGATTCCGTTGCCCCGAG T CCCGA GG CAGGTCATCACCAT GG AA TT TGCCC GCCCTCTTCCAGCCCTCATTCTTGGGTATGGAATCTTGCGGTATCCACGAGACCGTCTACCTCTTCCA TTCTTGGGTATGGA TCTTGCGG T CA GAGAC CTAC GCCCTCTTCCAGCCTTCATTCTTGGGTATGGAGTCTTGCGGTCTGCATGAGACTACCTACCTCTTCCA TTCTTGGGTATGGA TCTTGCGG T CA GAGAC CTAC GCCCTCTTCCAACCCTCATTCTTGGGTATGGAATCTTGCGGCATACACGAGACGGTCTACCTCTTCCA TTCTTGGGTATGGA TCTTGCGG T CA GAGAC CTAC GCCCTCTTCCAGCCCTCATTCTTGGGTATGGAATCTTGCGGTATCCACGAGACCGTCTACCTCTTCCA TTCTTGGGTATGGA TCTTGCGG T CA GAGAC CTAC GCTCTCTTCCAGCCCAGCTTCTTGGGTATGGAGTCTTGCGGCATCCACGAGACCACCTACCTCTTCCA CC TTCTTGGGTATGGA TCTTGCGG T CA GAGAC CTAC AACTCGATCATGAAGTGCGACGTCGACATCCGTAAGGATCTGTACGCCAACACTGTCTTG GTCGACATCCGTAAGGATCTGTACGC A TGTC T AACTCGATCATGAAGTGCGATGTCGACATCCGTAAGGATCTGTACGCCAACACTGTCCTT GTCGACATCCGTAAGGATCTGTACGC A TGTC T AGCTCGATCATGAAGTGTGACGTCGACATCCGTAAGGATCTGTACGCCAACAATGTCCTC GA GTCGACATCCGTAAGGATCTGTACGC A TGTC T AACTCGATCATGAAGTGCGACGTCGACATCCGTAAGGATCTGTACGC---AACTGTCTTG GTCGACATCCGTAAGGATCTGTACGC A TGTC T AACTCGATCATGAAGTGCGACGTCGACATCCGTAAGGATCTGTACGCCAACACTGTCCTG GTCGACATCCGTAAGGATCTGTACGC A TGTC T 900 BDa R Gambar 8. Alignment sekuen parsial β-aktin Daphnia magna (no. Aksesi Bank Gen: AJ ) dan beberapan sekuen β-aktin (no. Aksesi Bank Gen: AJ ; AJ ; AJ ; AJ Posisi primer forward BDa-F (5 -GACATCAAGGA- GAARYTBTGCTAY-3 ) dan primer reverse BDa-R (5 - GTACAGATCCTTACGGATGTCGAC-3 ) ditunjukan dengan tanda panah Visualisasi Produk PCR DNA Artemia dan Kutu Air Produk PCR yang dihasilkan dengan menggunakan primer GFP berukuran 600 bp (Gambar 9). Secara umum pada Artemia, produk ini terlihat di setiap perlakuan. Sementara pada kutu air, produk PCR hanya terlihat pada 6 jam setelah pemberian bakteri. Produk PCR menggunakan primer β-aktin diperoleh pada semua perlakuan Artemia dan kutu air. Hal ini menunjukkan bahwa terdapat DNA genom sebagai cetakan dalam proses amplifikasi PCR.

6 29 0,7 kb 0,5 kb M A1 A2 A3 A4 A5 A6 P NA R (i) GFP pada perlakuan Artemia 0,5 kb 0,2 kb 0,1 kb M A1 A2 A3 A4 A5 A6 NA R (ii) β-aktin pada perlakuan Artemia 0,8 kb 0,5 kb 0,4 kb M D1 D2 D3 D4 D5 P ND R (iii) GFP pada perlakuan kutu air 0,4 kb M D1 D2 D3 D4 D5 R ND 0,3 kb 0,2 kb (iv) β-aktin pada perlakuan kutu air Gambar 9. Visualisasi hasil PCR dengan target gen GFP pada Artemia (i) dan pada kutu air (iii) serta dengan target β-aktin pada Artemia (ii) dan pada kutu air (iv). M = Marker DNA; A1 = Perlakuan perendaman Artemia 30 menit; A2 = Perlakuan perendaman Artemia 1 jam; A3 = Perlakuan perendaman Artemia 1,5 jam; A4 = Perlakuan perendaman Artemia 2 jam; A5 = Perlakuan perendaman Artemia 2,5 jam; A6 = Perlakuan perendaman Artemia 3 jam; NA = Artemia tanpa perlakuan perendaman; D1 = Perlakuan perendaman kutu air 2 jam; D2 = Perlakuan perendaman kutu air 4 jam; D3 = Perlakuan perendaman kutu air 6 jam; D4 = Perlakuan perendaman kutu air 8 jam; D5 = Perlakuan perendaman kutu air 10 jam; P= Kontrol positif (plasmid pkrt-gfp); R= Hanya mengandung reagen PCR, dan ND= Kutu air tanpa perlakuan perendaman.

7 Jumlah Copy DNA Asing dalam Artemia dan Kutu Air Seperti ditunjukkan pada Gambar 10 bahwa jumlah copy DNA asing yang terdapat dalam Artemia yaitu berkisar antara 1,43 x s.d. 2,37 x 10 12, sedangkan dalam pada kutu air hanya dapat terdeteksi pada jam ke-6 setelah perendaman yaitu berjumlah 0,02x10 12 (Gambar 11). Detil perhitungan jumlah copy DNA asing dalam Artemia dan kutu air ditampilkan pada Lampiran 6. Gambar 10. Jumlah copy DNA asing yang terdapat dalam Artemia. Gambar 11. Jumlah copy DNA asing dalam kutu air.

8 Pembahasan Aplikasi protein rekombinan seperti rekombinan growth hormone (rgh) dan DNA rekombinan seperti halnya DNA vaksin, membutuhkan metode pemberian yang tepat. Dalam penelitian ini digunakan pakan alami sebagai vektor penyampaian DNA asing dalam bentuk konstruksi gen keratin-gfp sebagai model bagi vaksin DNA. Metode ini juga telah dibuktikan oleh Lin et al. (2005) bahwa Artemia mampu mengkonsumsi bakteri E. coli yang membawa konstruksi pet24a-gfp. Lebih lanjut Lin et al. (2005) melaporkan bahwa terdapat 10 5 bakteri yang terkandung dalam 1 ekor Artemia dan sekitar 80-90% mengandung antigen setelah 2 jam diberikan bakteri terkonstruksi pet24a-nnv VP. Penelitian ini mengacu kepada penelitian Lin et al. (2005). Pada penelitian ini digunakan ekor naupli Artemia diberi bakteri sebanyak 15 x 10 8 cfu/ml yang membawa konstruksi gen pkrt-gfp (keratin-gfp). Selain itu, pada penelitian ini juga digunakan kutu air (Daphnia dan Moina) yang mewakili pakan alami untuk komoditas ikan air tawar. Jumlah kutu air dalam penelitian ini adalah sebanyak ekor dengan cara menyamakan bobot basah dari ekor Artemia yaitu 202,17 ± 12 mg, sehingga dapat dikatakan bahwa bobot Artemia berbanding kutu air adalah 1:3. Hasil isolasi DNA genom dari Artemia dan kutu air termasuk bersih atau kontaminasi dari protein atau fenol sangat rendah, karena rasio λ 260 /λ 280 adalah mendekati 1,800 (Muladno, 2002) dan kemurniannya lebih dari 95%. Selanjutnya, dengan menggunakan DNA genom hasil isolasi tersebut, produk PCR menggunakan primer β-aktin juga berhasil diperoleh dengan ukuran fragmen DNA sesuai dengan yang diprediksi yaitu sekitar 240 bp pada Artemia. Namun demikian pada kutu air terdapat tiga pita DNA yaitu sekitar 240 bp, 300 bp, dan antara bp. Jumlah pita DNA lebih dari 1 ini diduga disebabkan karena primer didisain dari penyejajaran sekuen β-aktin dari Daphnia magna dan, sementara DNA yang digunakan berasal dari kutu air yang merupakan campuran antara Daphnia dan Moina. Diduga bahwa primer β-aktin yang digunakan mempunyai situs annealing berbeda antara Daphnia dan Moina. Semua perlakuan waktu perendaman pada Artemia mengandung bakteri yang membawa DNA asing, sedangkan pada kutu air hanya terdapat pada

9 32 perlakuan 6 jam (Gambar 9i dan Gambar 9iii). Selain itu, waktu yang diperlukan oleh Artemia untuk memakan bakteri dalam jumlah tinggi lebih cepat dibandingkan dengan kutu air. Perbedaan ini diduga berhubungan dengan perilaku makan dari kedua spesies tersebut. Artemia bersifat non selective filter feeder sehingga mampu memakan apapun yang terdapat disekitarnya yang berukuran <50 mikron (Isnansetyo & Kurniastuty, 1995), sedangkan kutu air bersifat selective filter feeder artinya ukuran suspensi bahan organik yang dilalui dan masuk ke dalam tubuhnya adalah sama dengan ukuran mulutnya atau organ penyaringnya (Djarijah, 1996). Dengan demikian, dari segi jumlah bakteri atau dengan kata lain jumlah copy DNA asing yang dapat dimakan, maka Artemia lebih potensial digunakan sebagai pembawa DNA vaksin dibandingkan dengan kutu air. Jumlah copy DNA asing yang terdapat dalam Artemia mencapai nilai tertinggi pada perendaman 1,5 jam (2,37x10 12 copy DNA dalam 100 ekor Artemia). Jumlah copy DNA ini sebanding dengan 22,19 µg DNA (Lampiran 6). Zheng et al. (2006), melaporkan dosis yang digunakan pada uji ekspresi vaksin DNA terhadap ikan Japanese flounder Paralichthys olivaceus adalah 15µg. Begitu pula dengan penelitian Zahro (2010), mengatakan bahwa dosis vaksin DNA terbaik yang digunakan pada uji tantang terhadap sintasan ikan mas yang diinfeksi koi herpes virus (KHV) adalah 12,5 µg (dengan jumlah copy DNA yaitu 13 x ). Jika dikaitkan dengan hasil penelitian Zahro (2010) tersebut, dapat dikatakan jumlah copy DNA pada 100 ekor Artemia belum cukup dibanding dengan injeksi vaksin KHV sebesar 12,5 µg per ekor ikan mas dengan bobot ratarata gram. Hasil yang sebanding diperoleh jika 1 ekor ikan mas dengan umur dan ukuran yang sama, memakan 500 ekor Artemia atau sekitar 5 kali lipat dari jumlah copy DNA yang ada. Namun, dalam penelitian ini penyampaian konstrusksi DNA pkrt-gfp cukup efektif mengingat pakan alami dapat diberikan pada larva yang berumur lebih dari 2 minggu. Hal ini sesuai dengan Kordi (2004), menyatakan bahwa vaksin DNA kurang efektif diberikan pada ikan yang digunakan kurang dari 2 minggu dan berat badannya kurang dari 1 gram. Hal ini karena organ tubuh yang merespon kekebalan belum sempurna memproduksi

10 33 antibodi. Organ tubuh ikan yang berfungsi merespon kekebalan, akan tercapai sempurna setelah 2 minggu. Kordi (2004), juga menganjurkan melakukan vaksinasi pada umur tersebut dan kemudian dapat diulangi pada saat ikan berumur 2 bulan. Lin et al. (2005) melakukan pemberian vaksin VNN VP pada larva ikan kerapu melalui Artemia. Artemia yang telah disisipkan vaksin VNN VP diberikan pada larva kerapu yang berumur 18 hari. Pemberian Artemia tersebut dilakukan selama 17 hari sampai terbentuk sistem imun. Sehingga penelitian menggunakan konstruksi pkrt-gfp ini dengan perendaman 1,5 jam bisa dikatakan cukup sebanding untuk menginduksi sistem imun ikan mas. Selanjutnya, Artemia diduga berhenti sementara untuk makan setelah 1,5 jam. Sebagian dari bakteri dilisis dan plasmid DNA dirusak oleh enzim restriksi endogenus sehingga jumlah copy DNA menurun menjadi 1,67 x copy pada perlakuan 2 jam perendaman. Dugaan tersebut diperkuat dengan munculnya pola yang sama apabila perendaman dilanjutkan, meskipun rentang waktunya lebih singkat dibandingkan dengan perlakuan 30 menit - 1,5 jam. Jumlah copy DNA meningkat kembali pada perlakuan 2,5 jam (2,27 x copy DNA) dan menurun pada perlakuan 3 jam (2,16 x copy DNA). Dalam hubungannya dengan vaksinasi melalui Artemia, lama waktu perendaman dan tingkat pemberian pakan yang efektif dalam arti memberikan induksi imunitas terbaik masih perlu diteliti. Pada kutu air, keberhasilan dalam uptake bakteri yang mengandung DNA dengan konstruksi pkrt-gfp muncul pada 2 jam ketiga atau pada 6 jam setelah perendaman yaitu sebanyak 0,02 x copy DNA dengan konsentrasi 0,15 µl. Hal ini karena kutu air memiliki proses pencernaan internal yang mampu melisiskan sel bakteri (Hadas, 1983) dan diduga memotong DNA pkrt-gfp.