BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan pada bulan Desember 2012 sampai Mei 2013 yang meliputi kegiatan di lapangan dan di laboratorium. Pengambilan ikan kakap merah dilakukan di beberapa pasar tradisional Kabupaten Bone Bolango. Analisis sampel kandungan merkuri (Hg) pada ikan kakap merah dilakukan di Laboratorium Pembinaan dan Pengujian Mutu Hasil Perikanan (LPPMHP) Propinsi Gorontalo. 3.2 Alat dan Bahan Adapun alat dan bahan yang digunakan dalam proses pengujian Hg sebagai berikut : 3.2.1 Alat Alat-alat yang digunakan untuk proses pengujian Hg adalah: Aluminium foil, beaker gelas (ml), homogenizer, corong plastik, desikator, gelas ukur (ml), labu takar (ml), labu alas bulat (ml), oven, pipet, pisau, refrigerator, sendok, timbangan analitik dengan ketelitian ± 0,000 1 g, mantle hating, seperangkat alat spektrofotometer AAS (Anatomic Absorption Spectrophotometer). 3.2.2 Bahan Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan kakap merah dari tiga pasar tradisional Kabupaten Bone Bolango. Bahan-bahan yang digunakan untuk melakukan pengujian Hg adalah asam nitrat (HNO 3 ) 65% general produk reagen, asam sulfat (H 2 SO 4 ) 95% general produk reagen, hidrogen peroksida (H 2 O 2 ) general produk reagen, HNO 3.H 2 SO 4 20%, vanadium
pentaoksida (V 2 O 5 ) general produk reagen, aquabidest, batu didih, larutan primer merkuri 1000 ppm. 3.3 Metode Penelitian Metode peneltian yang digunakan adalah metode deskriptif (Jauhari, 2010). Pengambilan sampel ikan kakap merah dilakukan secara sampling yaitu pengambilan sampel ikan dari polulasi dilakukan secara acak tanpa memperhatikan strata yang ada dalam populasi. Menurut SNI (2010), metode pengambilan contoh produk perikanan jika besarnya lot (N) 4.800 atau kurang maka besarnya jumlah contoh (n) yang diambil adalah 6 sampel. Sampel ikan kakap merah diambil dari 3 stasiun yaitu stasiun I pasar Bilungala, stasiun II pasar Mupuya dan stasiun III pasar Tombililato. Sampel diambil masingmasing 6 ekor dari masing-masing stasiun. kemudian ikan yang terkumpul diawetkan menggunakan es batu dalam box untuk mempertahankan tingkat kesegaran, sehingga diharapkan pada saat pengambilan daging sampel, daging masih tetap dalam kondisi yang sama dengan pada saat ditangkap. Setelah itu ikan dibawa ke LPPMHP untuk diuji kandungan Hg. Pengujian Hg pada ikan kakap merah berdasarkan Standar Nasional Indonesia tahun 2006. Penelitian dilakukan 2 kali ulangan. Parameter yang diuji yaitu kandungan logam berat merkuri (Hg) menggunakan metode AAS (Atomic Absorption Spectrophotometer).
Pengujian Merkuri (Hg) Berdasarkan SNI (01-2354-2006) Prinsip pengujian merkuri adalah unsur merkuri (Hg) dilepaskan dari jaringan sampel melalui tahap digesti dengan menggunakan asam sulfat pekat (H 2 SO 4 ) dan nitrat pekat (HNO 3 ) dengan bantuan pemanas listrik untuk mendapatkan unsur merkuri bermuatan positif (Hg + atau Hg ++ ). Penetapan jumlah merkuri dilakukan dengan spektrofotometer serapan atom tanpa nyala (flameless SSA) dimana unsur merkuri positif ini selanjutnya direduksi dengan natrium borohidrid menjadi Hg netral dalam bentuk kabut uap merkuri. Kabut uap merkuri didorong oleh gas mulia argon menuju sel penyerapan pasa AAS, dan berinteraksi dengan sinar yang berasal dari lampu katoda merkuri (Hallow Cathode Lamp). Interaksi tersebut berupa serapan sinar yang besarnya dapat dilihat pada layar monitor AAS. Jumlah serapan sinar sebanding dengan kadar merkuri yang ada dalam sampel. 1. Preparasi sampel Preparasi sampel adalah tahap awal dalam pengujian Hg dimana sampel dibersihkan dari sisik dan dicuci bersih. Hal tersebut bertujuan untuk mempermudah dalam pengambilan daging. Daging organ sampel yang diambil adalah pada punggung dan ekor, karena pada bagian tersebut adalah bagian pengakumulasi Hg selain pada organ hati dan ginjal, selanjutnya daging sampel dihomogenasi dan ditempatkan dalam cawan petri untuk mempermudah tahap selanjutnya, secara lebih rincih preparasi sampel dapat dilihat pada Gambar.7
Sampel ikan kakap Dibersihkan dari sisik dan dicuci Diambil bagian punggung dan ekor Dihomogenasi Ditempatkan dalam cawan petri Gambar.7 Preparasi sampel 2. Pengeringan sampel Pengeringan sampel berfungsi untuk menghilangkan kadar air bebas yang terkandung dalam daging ikan. Proses pengeringan menggunakan metode oven. Sampel yang sudah dipreparasi di masukan kedalam cawan petri, diratakan dan ditutup dengan aluminium foil setengah dari seluruh permukaan cawan. Hal tersebut berfungsi untuk mengurangi kontaminasi. Selanjutnya sampel dikeringankan dalam oven selama 18 jam pada suhu 103 C ± 1 C. Sebelumnya cawan petri yang digunakan sudah dipanaskan dalam oven dengan suhu 103 C ± 1 C selama 2 jam. Hal tersebut bertujuan untuk menghilangkan kadar air dan mensterililsasikan alat. Setelah kering dan steril cawan didinginkan dalam desikator selama 30 menit. Selanjutnya cawan petri di timbang sebagai berat A, cawan petri yang sudah berisi sampel di timbang sebagai berat B, dan cawan petri dan sampel kering ditimbang sebagai berat C. Kemudian di hitung kadar air dengan rumus: Kadar air (%) = %
Selanjutnya presentasi kadar air dihitung untuk mengetahui berat basah sampel dengan rumus: Wd X 100 % Ww = 100 % kadar air (%) Didmana Ww adalah berat sampel basah (g) dan Wd: adalah berat sampel kering (g). selanjutnya sampel kering dihaluskan dan ditempatkan dalam wadah tertutup. Secara rinci proses pengeringan sampel dapat dilihat pada Gambar.8 berikut. Cawan petri disterilkan dengan suhu 103ºC selam 2 jam Cawan didinginkan dalam desikator selama 30 menit Cawan petri kosong ditimbang sebagai berat A Cawan yang sudah berisi sampel di timbang sebagai berat B Sampel dikeringan dalam oven suhu 103ºC selama 18 jam Cawan dan sampel kering ditimbang sebagai berat C Sampel dihaluskan Gambar.8 Pengeringan sampel
3. Tahap Digesti Digesti adalah proses perombakan jaringan daging ikan dengan menggunakan senyawa asam (H 2 SO 4 dan HNO 3 ) dan suhu tinggi. Tahap awal dalam proses digesti adalah Labu alas bulat 250 ml dikeringan dalam oven pada suhu 103 C ± 1 C selama 2 jam hal tersebut bertujuan untuk menghilangkan kadar air dan mensterilisasikan alat. Selanjutnya Labu alas bulat didinginkan dalam desikator selama 30 menit. Sampel halus sebanyak 0,2 gr dimasukan dalam labu alas bulat, kemudian ditambahkan vanadium pentaoksida (V 2 O 5 ) yang berfungsi untuk katalisator dalam proses digesri. Ditambah tiga buah batu didih yang berfungsi untuk meredam buih yang besar pada saat proses pemanasan. Selanjutnya berturut-turut ditambah asam nitrat (HNO 3 ) dan asam sulfat (H 2 SO 4 ) yang berfungsi untuk merombak jaringan daging ikan. Selanjutnya dilakukan tahap pemanasan. Pemanasan dilakukan 2 tahap karena untuk mencegah tumpahan yang besar. Suhu pada tahap pertama 30ºC selama 6 menit dan suhu pada tahap kedua 80ºC selama 10 menit, selama proses pemanasan berlangsung sampel akan berwarna cokelat kekuningan. Hal tersebut terjadi karena asam nitrat telah melepaskan ion nitritnya, semakin bening larutan cokelat kekuningan maka menandakan proses digesti berlangsung baik, selanjutnya sampel didinginkan. Setelah dingin larutan ditambah dua tetes hidrogen peroksida (H 2 O 2) 30% untuk menstabilkan larutan yang telah terbentuk pada proses digesti. Kemudian ditambah 15 ml aquabides untuk membilas dinding pendingin yang terpapar larutan pada saat proses digesti. Selanjutnya larutan disaring menggunakan kertas saring whatman kedalam labu takar 100 ml dan ditepatkan dengan aquabides. Secara rinci proses digesti dapat dilihat pada Gambar.9 berikut.
Labu alas bulat 250 ml dikeringkan dalam oven selama 2 jam suhu 103ºC Labu alat bulat didinginkan dalam desikator selama 30 menit Sampel halus 0,2 gr dimasukan dalam labu alas bulat Ditambah V 2 O 5 dan 3 buah batu didih Ditambah HNO 3 DAN H 2 SO 4 Dipanaskan pada suhu 30ºC sampai 80ºC secara bertahap Larutan didingikan ± 4 menit Ditambah H 2 O 2 dan aquabides Larutan disaring dalam labu takar 100 ml dan ditepatkan Gambar.9 Proses digesti 4. Pembuatan Larutan Standar Dan Blanko Larutan standar adalah patokan dalam pembacaan absorban Hg sampel. Larutan standar merkuri dibuat berdasarkan prinsip pengenceran dimana larutan standar primer 1000 mg/l diencerkan dengan menggunakan larutan H 2 SO 4 dan HNO 3 20%, penggunaan larutan tersebut karena H 2 SO 4 dan HNO 3 dapat mengikat merkuri.
Proses pengeceran H 2 SO 4 dan HNO 3 20% yaitu dengan cara memipet masingmasing 10 ml H 2 SO 4 dan HNO 3 dimasukan dalam labu takar 100 ml dan tepatkan dengan aquabides. Rumus pengenceran yang dipakai dalam pembuatan larutan standar adalah V1.N1=V2.N2 Dimana V1 adalah jumlah volume larutan yang akan diambil dari larutan awal, N1 adalah konsentrasi larutan awal, V2 adalah jumlah volume akhir (ml) setelah diencerkan dan N2 adalah konsentrasi larutan yang diinginkan. Berikut proses pembuatan larutan standar: Larutan standar primer Hg 1000 mg/l dipersiapkan, kemudian dipipet sebanyak 10 ml, lalu dimasukan kedalam labu takar 100 ml kemudian diencerkan dengan HNO 3.H 2 SO 4 20% sampai 100 ml sehingga diperoleh larutan standar sekunder pertama (i) dengan konsentrasi 100 mg/l. Larutan (i) dipipet sebanyak 1 ml, kemudian dimasukan kedalam labu takar 100 ml kemudian diencerkan dengan HNO 3.H 2 SO 4 20% sampai 100 ml sehingga diperoleh larutan standar sekunder kedua (ii) dengan konsentrasi 1 mg/l. Larutan (ii) dipipet sebanyak 10 ml, kemudian dimasukan kedalam labu takar 100 ml, kemudian diencerkan dengan HNO 3.H 2 SO 4 20% sampai 100 ml sehingga diperoleh larutan standar sekunder ketiga (iii) dengan konsentrasi 0,1 mg/l. Larutan (ii) dipipet sebanyak 5 ml, 10 ml, 20 ml dan dimasukan kedalam 3 buah labu takar 100 ml. kemudian diencerkan dengan HNO 3.H 2 SO 4 20% sampai 100 ml sehingga diperoleh larutan standar kerja dengan konsentrasi 0,005 mg/l, 0,01 mg/l, 0,02 mg/l. Larutan standar kerja kemudian dibaca pada alat AAS, berikut diagram alir pembuatan larutan standar kerja dapat dilihat pada gambar.10
Blanko merupakan campuran pelarut yang didalamnya tidak terdapat merkuri atau sampel. Blanko berfungsi untuk mengetahui ada atau tidak Hg pada bahan-bahan yang digunakan dalam kegiatan pengujian. Primer Hg 1000 mg/l Pipet 10 ml Masukan dalam labu takar 100 ml Encerkan dengan HNO 3.H 2 SO 4 20% Standar pertama dengan konsentrasi 100 mg/l Pipet 1 ml Masukan dalam labu takar 100 ml Encerkan dengan HNO 3.H 2 SO 4 20% Standar kedua dengan konsentrasi 1 mg/l Pipet 10 ml Masukan dalam labu takar 100 ml Encerkan dengan HNO 3.H 2 SO 4 20% Standar ketiga dengan konsentrasi 0,1 mg/l Pipet 5 ml,10 ml, 20 ml Masukan dalam labu takar 100 ml Encerkan dengan HNO 3.H 2 SO 4 20% Standar kerja dengan konsentrasi 0,005 mg/l, 0,01 mg/l dan 0,02 mg/l Gambar.10 Pembuatan larutan standar kerja
5. Pembacaan pada AAS Dalam pembacaan pada AAS, larutan sampel, standar dan blanko disiapkan. Tahap awal dalam proses pembacaan adalah perangkat AAS dihidupkan, diatur posisi optimum untuk pengujian Hg dengan mengatur posisi lampu katoda Hg dan kedudukan sel absorban dan panjang gelombang untuk uji Hg. Selanjutnya larutan standar dihubungkan dengan selang kecil yang bermuara pada sebuah tabung didalam sistem AAS, kemudian reduktor (SnCl 2 ) dialirkan kedalam tabung tersebut. Reduktor tersebut yang akan memodifikasi larutan staadar sehingga akan terbentuk kabut uap merkuri. Kabut uap merkuri akang didorong oleh campuran gas argon menuju ke sel absorbans, didalam sel absorban, uap Hg akan menyerap sinar dari lampu katoda Hg pada panjang gelombang 253,7 nm. Besarnya absorban yang diserap akan langsung dibaca pada layar monitor. Setelah larutan standar kerja dibaca, maka akan terbenruk kurva standar absorban (Y) konsentrasi Hg (ug/l) (X), sehingga terbentuk kurva linier seperti terlihat pada lampiran hasil pembacaan AAS. Selanjutnya pembacaan blanko dan sampel sepetri tahap pada pembacaan larutan standar, secara rinci tahap pembacaan pada AAS dapat dilihat pada Gambar. 11 Berdasarkan pembacaan di AAS maka, konsentrasi Hg dihitung dengan rumus: Dimana D adalah konsetrasi sampel ug/l dari hasil pembacaan AAS, E adalah kadar blanko sampel ug/l dari hasil perbacaan AAS, V adalah volume akhir larutan sampel yang disiapkan (ml), Fp adalah faktor pengenceren, Ww: adalah berat basah sampel (g). Kadar Hg ug/g = ( ) ( )
AAS dihidupkan AAS diatur pada posisi Hg untuk lampu katoda dan panjang gelombang Larutan stadar, blanko dan sampel secara berturut-turut dihubungkan dalam selang kecing yang bermuara pada tabung AAS SnCl 2 dialirkan dalam tabung tersebut Kabut uap Hg Uap Hg berinteraksi dengan lampu katoda Besarnya absorban dapat dilihat pada kurva standar Gambar.11 Pembacaan pada AAS
3.4 Prosedur Penelitian Prosedur kerja pelaksaan penelitian dapat dilihat pada diagram dibawah ini: Pengambilan sampel secara sampling Stasiun 1 Pasar Bilungala Stasiun 2 Pasar Mupuya Stasiun 3 Pasar Tombulilato Ikan kakap merah (Lutjanus argentimaculatus) Uji merkuri (Hg) Hasil (analisis deskriptif) Gambar.12 Diagram alir penelitian
3.5 Rancangan Matriks Hasil Penelitian Tabel.2 Input data kandungan merkuri (Hg) pada ikan kakap merah di tiga pasar tradisional Stasiun Ulangan Merkuri (Hg) K1 K2 K3 1 x 2x Rata-rata 1x 2x Rata-rata 1 x 2 x Rata-rata Keterangan: k1=pasar Bilungala k2=pasar Mupuya k3=pasar Tumbililato 3.6 Rancangan Analisis Data Analisis statistik yang digunakan adalah analisis data one-way anova yaitu suatu prosedur uji pembedaan mean dari satu faktor. Adapun model statistika yang digunakan adalah menurut Hanafiah (2011) dalam penelitian ini yaitu: Y = µ + τ + ε Keterangan : µ = Nilai rerata (mean) τ = Pengaruh stasiun/lokasi pengambilan sampel terhadap konsentrasi Hg pada ikan kakap merah ε = Pengaruh galat