LAMPIRAN
Lampiran 1 Bagan alir penelitian Biawak air bagian duodenum, jejenum, ileum, kolon Cuci dengan akuades dan kerok lapisan atasnya (mukosa Ekstraksi enzim protease Analisis kadar protein Pencirian enzim SDS-PAGE Analisis aktivitas keratinase (in vitro)
Lampiran 2 Prosedur pembuatan pereaksi kimia Pereaksi untuk analisis aktivitas enzim dan kadar protein Kasein Hammarsten 2% b/v Sebanyak 1 g kasein ditimbang, lalu dilarutkan dalam 40 ml bufer fosfat 50 mm, ph 7,0 kekeruhan larutan dihilangkan dengan penambahan NaOH 1 M, lalu diatur hingga ph 7 dengan penambahan HCl 1 M dan ditera dengan akuades hingga volume total 50 ml. Tirosin 5 mm Sebanyak 0,0453 g tirosin dilarutkan dalam 40 ml akuades dan ditambahkan NaOH 1 M hingga larut, lalu dinetralkan hingga ph 7,0 dengan HCl 1 M. Selanjutnya, larutan ditera dengan akuades hingga volume 50 ml. TCA 0.1 M Larutan stok TCA 1 M dibuat dengan cara melarutkan 16,339 g TCA dalam 100 ml akuades, lalu diaduk dengan pengaduk magnetik hingga homogen. Larutan kerja TCA 0,1 M dibuat dengan cara mengencerkan 10 ml larutan TCA 1 M dengan akuades hingga volume 100 ml. Na 2 CO 3 0,4 M Sebanyak 4,2397 g Na 2 CO 3 dilarutkan dalam 100 ml akuades, lalu diaduk dengan pengaduk magnetik hingga homogen. Pereaksi Folin-Ciocalteau (1:2) Sebanyak 10 ml pereaksi Folin-Ciocalteau diencerkan dengan akuades hingga volume 30 ml. Pereaksi Bradford Stok larutan Bradford dibuat dengan cara melarutkan 0,1 g Coomassie Brilliant Blue G-250 dalam 50 ml etanol 95% v/v dan 100 ml asam fosfat 85% v/v, lalu ditera dengan akuades hingga volume 200 ml. Larutan kerja Bradford dibuat dengan cara mengencerkan 5 ml larutan stok Bradford dengan akuades hingga volume total 50 ml. Pereaksi untuk analisis SDS-PAGE dan zimografi Larutan A (40% (b/v) akrilamida; 2 % (b/v) bis-akrilamida) Sebanyak 4,38 ml akrilamida dan 2,40 bis-akrilamida untuk gel pemisah dan Sebanyak 0,48 ml akrilamida dan 0,26 ml bis-akrilamida untuk gel penahan. Larutan B (bufer gel pemisah, Tris-HCl 1,5 M ph 8,8) Sebanyak 3,75 ml larutan Tris-HCl ph 8,8 dan 0,15 ml larutan SDS 10% (b/v) untuk gel pemisah.
Larutan C (bufer gel penahan, Tris-HCl 1,5 M ph 6,8) Sebanyak 1,26 ml larutan Tris-HCl ph 6,8 dan 50 µl larutan SDS 10% (b/v) untuk gel penahan. Ammonium persulfat 10% (b/v) Sebanyak 0,1 g ammonium persulfat dilarutkan hingga homogen dengan 1 ml akuades. Bufer elektroforesis Sebanyak 1.803 g Tris, 8,648 g glisin, dan 0,6 g SDS dilarutkan dengan 600 ml akuades, lalu ditera hingga ph 8,3 dengan HCl 1 M. Bufer sampel 1. SDS-PAGE Sebanyak 0,3 ml Tris-HCl 1 M ph 6,8, 2,5 ml gliserol 50% (v/v), 1 ml SDS 10% (b/v), 0,25 ml 2-merkaptoetanol, 0,5 ml bromfenol biru 1% (b/v), dan 0,45 ml akuabides sampai volume total 5 ml. 2. Zimografi Sebanyak 0,5 g SDS, 1 ml gliserol 50% (v/v), 1 ml bromfenol biru 1% (b/v), 0,625 ml Tris-HCl 1 M ph 6,8, dan 2.,75 ml akuabides sampai volume total 5 ml. Larutan pewarna Sebanyak 0,5 g Coomassie Brilliant Blue R-250 dilarutkan dalam campuran 225 ml metanol, 50 ml asam asetat glasial, dan 225 ml akuades sampai volume total 500 ml. Larutan peluntur Komposisi larutan peluntur terdiri atas 50 ml metanol, 50 ml asam asetet glasial, dan 400 ml akuades sampai volume total 500 ml. Larutan berbagai bufer Larutan kerja bufer 50mM dibuat dengan cara mengencerkan 25 ml larutan stok bufer 0,2 M dengan akuades hingga volume total 100 ml.
Lampiran 3 Pembuatan kurva standar Bradford. Absorbansi [BSA] (mg/ml) 0,10 0,064 0,20 0,070 0,30 0,074 0,40 0,079 0,50 0,080 0,60 0,082 0,70 0,087 0,80 0,089 0,90 0,090 1,00 0,092 Sampel Absorbansi kadar protein duodenum 0,115 1,6956 jejenum 0,108 1,4615 ileum 0,106 1,3946 kolon 0,081 0,5585 Absorbansi 0,100 0,090 0,080 0,070 0,060 0,050 0,040 0,030 0,020 0,010 y = 0,0299x + 0,0643 R 2 = 0,9614 0,000 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 [BSA]mg/ml
Lampiran 4 Penentuan absorbansi enzim maksimum protease dari bagian usus biawak air Suhu 45 C (menit) A Blanko A Standar A Sampel Duodenum Jejenum Ileum Kolon 5 2,115 2,354 2,783 2,642 2,609 2,616 10 2,291 2,312 2,414 2,396 2,385 2,380 15 2,398 2,429 2,602 2,613 2,481 2,480 20 2,014 2,149 2,512 2,404 2,428 2,413 Suhu 55 C (menit) A Blanko A Standar A Sampel Duodenum Jejenum Ileum Kolon 5 2,129 2,299 2,745 2,685 2,684 2,645 10 2,186 2,287 2,548 2,546 2,484 2,479 15 2,150 2,226 2,506 2,497 2,363 2,361 20 2,265 2,468 2,528 2,277 2,596 2,436 Suhu 65 C (menit) A Blanko A Standar A Sampel Duodenum Jejenum Ileum Kolon 5 2,118 2,273 2,396 2,332 2,316 2,255 10 2,259 2,326 2,516 2,519 2,559 2,545 15 2,286 2,318 2,345 2,318 2,346 2,359 20 2,167 2,338 2,372 2,329 2,325 2,324
Lampiran 5 Penentuan aktivitas maksimum enzim spesifik dari bagian usus biawak air Suhu 45 (menit) Aktivitas enzim (U/ml) Aktivitas enzim Spesifik (U/mg) Duodenum Jejenum Ileum Kolon Duodenum Jejenum Ileum Kolon 5 3,3540 2,6460 2,4803 2,5155 1,9780 1,8104 1,7785 4,5038 10 3,5143 3,0000 2,6857 2,5428 2,0725 2,0526 1,9257 4,5527 15 2,6322 2,7742 1,0710 1,0581 1,5523 1,8981 0,7679 1,8944 20 1,1066 0,8666 0,9200 0,8867 0,6526 0,5929 0,6597 1,5875 Suhu 55 (menit) Aktivitas enzim (U/ml) Aktivitas enzim Spesifik (U/mg) Duodenum Jejenum Ileum Kolon Duodenum Jejenum Ileum Kolon 5 4,3482 3,9247 3,9176 3,0353 2,5643 2,6853 2,8091 5,4345 10 2,1505 2,1386 1,7703 1,7406 1,2682 1,4633 1,2693 3,1164 15 1,8737 1,8263 1,1215 1,1105 1,1050 1,2496 0,8041 1,9883 20 0,3887 0,0177 0,4892 0,2527 0,2292 0,0121 0,3507 0,4525 suhu 65 (menit) Aktivitas enzim (U/ml) Aktivitas enzim Spesifik (U/mg) Duodenum Jejenum Ileum Kolon Duodenum Jejenum Ileum Kolon 5 2,1523 1,6567 1,5330 1,0606 1,2693 1,1335 1,0992 1,8990 10 2,3015 2,3284 2,6865 2,5612 1,3573 1,5931 1,9263 4,5856 15 0,7375 0,4000 0,7500 0,9125 0,4349 0,2737 0,5378 1,6338 20 0,3596 0,2842 0,2772 0,2754 0,2121 0,1945 0,1988 0,4932
Lampiran 6 Contoh perhitungan aktivitas enzim (U/ml) dan aktivitas spesifik (U/mg). Perhitungan aktivitas enzim (U/ml) Asampel Ablanko Aktivitas protease (U/ml) = Χ As tan dar Ablanko faktorpengenceran waktuinkubasi Contoh perhitungan pada suhu 45 C selama 5 menit sampel duodenum 2,783 2,115 6 Aktivitas keratinase (U/ml) = Χ 2,351 2,115 5 =3,3540 U/ml Perhitungan kadar protein (mg/ml) Persamaan dari kurva standar: y = 0,0299x + 0,0643 x = [BSA] mg/ml Y = Absorbansi Contoh perhitungan pada sampel duodenum dengan nilai absorbansi 0,115 y = 0,0299x + 0,0643 0,115 = 0,0299x + 0,0643 x = 1,6356 mg/ml [protein] (mg/ml) = 1,6356 mg/ml Perhitungan aktivitas spesifik enzim (U/mg) aktivitasenzim( U / mg) Aktivitas Enzim spesifik (U/mg) = [Protein]( mg / ml) Contoh perhitungan pada suhu 45 C selama 5 menit sampel duodenum 3, 3540 Aktivitas Enzim Spesifik (U/mg) = 1, 6356 =1,9779 U/mg
Lampiran 7 Data Pengaruha Suhu, ph dan ion logam pada aktivitas enzim maksimum dari ekstrak kasar enzim protease lapisan atas (mukosa) usus biawak air (Varanus salvator). Pengaruh suhu Suhu Blanko ( C) Standar Sampel Aktivitas enzim (U/ml) Duodenum Jejenum Ileum Colon Duodenum Jejenum Ileum Colon 45 2,115 2,354 2,783 2,642 2,609 2,616 3,354 2,6460 2,4803 2,5154 55 2,129 2,299 2,745 2,685 2,684 2,645 4,3482 3,9247 3,9176 3,0353 65 2,118 2,273 2,396 2,332 2,316 2,255 2,1523 1,6568 1,5329 3,0353 Pengaruh ph Blanko ph Standar Sampel Aktivitas enzim (U/ml) Duodenum Jejenum Ileum Colon Duodenum Jejenum Ileum Colon 3 1,340 1,980 1,696 1,689 1,652 1,695 0,668 0,654 0,585 0,666 4 1,307 1,932 1,705 1,759 1,715 1,727 0,764 0,868 0,783 0,806 5 1,275 1,981 1,767 1,836 1,765 1,770 0,836 0,954 0,833 0,841 6 1,283 1,941 1,818 1,871 1,803 1,838 0,976 1,072 0,948 1,012 7 1,301 1,979 1,873 1,893 1,823 1,879 1,012 1,048 0,924 1,023 8 1,362 1,982 1,892 1,918 1,846 1,883 1,026 1,076 0,937 1,008 9 1,217 2,116 2,056 2,002 1,982 1,998 1,120 1,048 1,021 1,042 10 1,328 1,984 1,883 1,813 1,844 1,724 1,015 0,887 0,944 0,724 11 1,285 1,935 1,716 1,780 1,831 1,542 0,796 0,914 1,008 0,474 12 1,266 1,996 1,708 1,750 1,699 1,529 0,727 0,796 0,712 0,432 Pengaruh ion logam ion Blanko Standar Sampel Aktivitas enzim (U/ml) Duedenum Jejenum Ileum Colon Duedenum Jejenum Ileum Colon NaCl 0,095 0,313 0,164 0,134 0,153 0,132 0,0317 0,0179 0,0266 0,0170 Cacl2 0,064 0,239 0,068 0,066 0,073 0,069 0,0023 0,0011 0,0051 0,0029 MgCl2 0,097 0,325 0,101 0,102 0,098 0,104 0,0018 0,0022 0,0004 0,0031 KCl 0,071 0,321 0,148 0,141 0,132 0,112 0,0308 0,0280 0,0244 0,0164 Kontrol 0,114 0,531 0,256 0,235 0,243 0,202 0,0341 0,0290 0,0309 0,0211
Lampiran 8 Pembuatan kurva standar SDS-PAGE. Standar Sampel BM (KDa) Log BM Rf (cm) Rf (Cm) Log BM BM 203 2,3075 0,0794 0,1666 1,8231 66,54 118 2,0719 0,1508 0,2381 1,7605 57,61 86 1,9345 0,2143 0,3190 1,6897 48,94 51,6 1,7126 0,3809 0,3238 1,6855 48,47 34,1 1,5327 0,5714 0,4603 1,5659 36,80 29 1,4624 0,6984 0,6666 1,3853 24,28 19,2 1,2833 0,9127 0,9841 1,1073 12,80 2,5 2 Log BM 1,5 1 0,5 y = -1,142x + 2,2486 R 2 = 0,9404 0 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 Rf (cm)