BAB 4 HASIL PERCOBAAN DAN BAHASAN Pengukuran serapan harus dilakukan pada panjang gelombang serapan maksimumnya agar kepekaan maksimum dapat diperoleh karena larutan dengan konsentrasi tertentu dapat memberikan sinyal (respon) yang kuat pada panjang gelombang tersebut dan perbedaan serapan sangat minimal dengan berubahnya panjang gelombang di sekitar panjang gelombang serapan maksimum sehingga kesalahan pengukuran menjadi lebih kecil. Pada penentuan panjang gelombang serapan maksimum malachite green, diperoleh serapan maksimumnya pada panjang gelombang 618 nm. Penentuan panjang gelombang serapan maksimum ini sangat penting untuk menentukan selektivitas, sensitivitas, dan kualitas spektrum serapan yang diperoleh selama pengukuran. Spektrum serapan malachite green dengan kondisi optimum dapat dilihat pada gambar 4.1. Gambar 4.1 Spektrum serapan larutan baku malachite green Validasi merupakan proses penilaian terhadap parameter analitik tertentu berdasarkan suatu percobaan laboratorium untuk membuktikan bahwa metode tersebut memenuhi syarat sesuai tujuan penggunaannya. Validasi metode analisis meliputi parameter kelinieran, kepekaan (batas deteksi dan batas kuantisasi), kecermatan, dan keseksamaan (ICH, 1996). 21
22 Pengujian kelinieran dilakukan untuk membuktikan bahwa larutan sampel memberikan respon yang berada dalam rentang konsentrasi dengan adanya hubungan linier antara respon analit dengan konsentrasi (Ibrahim, 2005). Parameter kelinieran dihitung dengan menggunakan data tiga kali pengukuran larutan baku malachite green dibuat pada rentang konsentrasi 0,9 sampai 2,7 bpj yang kemudian dibuat kurva kalibrasi yang merupakan hubungan linier antara konsentrasi dengan serapan. Hubungan linier antara konsentrasi dan serapan dinyatakan dalam persamaan y = 0,2331x + 0,0393 dengan koefisien korelasi (r) sebesar 0,9991 dan koefisien variasi fungsi regresi (V xo ) sebesar 1,74%. Harga koefisien korelasi (r) yang mendekati nilai 1 menunjukkan hubungan kelinieran yang baik antara serapan dengan konsentrasi malachite green pada rentang tersebut. Syarat koefisien variasi fungsi regresi (V xo ) untuk bahan aktif dalam sediaan atau bahan baku maksimal sebesar 2% dan untuk senyawa dalam metabolit dan bahan biologis atau cemaran maksimal sebesar 5% (Ibrahim, 2005). Hasil percobaan menunjukkan V xo masih berada dalam batas yang diperbolehkan. Nilai t hitung sebesar 47,1274 dari data pada kurva kalibrasi menunjukkan nilai yang lebih besar jika dibandingkan dengan nilai t tabel pada aras 0,05 yaitu 2,776. Nilai t hitung yang lebih besar dari t tabel menunjukkan adanya korelasi antara konsentrasi malachite green dengan respon serapan. Makin besar nilai t hitung menunjukkan adanya korelasi yang makin besar. Gambar hubungan linier antara konsentrasi malachite green dan serapan dapat dilihat pada gambar 4.2. Serapan 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 Konsentrasi malachite green (bpj) y = 0.2331 x + 0.0393 r 2 = 0.9983 r = 0.9991 Gambar 4.2 Hubungan linier antara konsentrasi malachite green dan serapan
23 Kepekaan analisis ditunjukkan oleh parameter batas deteksi dan batas kuantisasi. Batas deteksi adalah konsentrasi analit terkecil yang memberi sinyal instrumen yang berbeda secara nyata dari sinyal blanko dan sinyal latar belakang. Batas kuantisasi adalah konsentrasi analit terendah yang dapat dikuantisasi secara cermat dan seksama. Dari hasil perhitungan secara statistika diperoleh batas deteksi sebesar 0,11 bpj dan batas kuantisasi sebesar 0,32 bpj. Kecermatan merupakan ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analisis dengan kadar sebenarnya yang dinyatakan dengan persen perolehan kembali. Kecermatan penentuan malachite green diperoleh dari persen perolehan kembali dengan menambahkan larutan baku malachite green ke dalam sampel. Masing-masing sampel diukur sebanyak tiga kali pengukuran. Hasil persen perolehan kembali dapat dilihat pada tabel 4.1. Tabel 4.1 Kecermatan Metode Analisis Malachite Green Penambahan baku (bpj) Perolehan kembali (%) KV (%) Rata-rata perolehan kembali (%) 1,5 93,19 ± 7.05 3,04 92,69 ± 8,79 2,1 95, 96 ± 3,17 1,33 2,7 88, 93 ± 11,94 5,41 Persen perolehan kembali pada masing-masing penambahan larutan baku dinyatakan sebagai rata-rata persen perolehan kembali dengan memperhitungkan skor baku dan keberartian pada aras 0,05. Rata-rata perolehan kembali yang didapat pada penentuan kecermatan ini adalah 92,69 ± 8,79 %. Hasil perhitungan tersebut menunjukkan rentang perolehan kembali adalah 83,90-101,48 % (berada dalam rentang yang diperbolehkan yaitu 80-110 %) sehingga dapat dinyatakan bahwa kecermatannya baik. Keseksamaan merupakan ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil individual dengan hasil rata-rata pengukuran berulang pada sampel yang sama dan kondisi pengukuran yang relatif sama. Penentuan keseksamaan dilakukan terhadap larutan baku dan larutan sampel yang ditambahkan malachite green. Keseksamaan larutan baku dilakukan terhadap rentang konsentrasi larutan baku antara 0,9 sampai 2,7 bpj yang diukur
24 selama tiga hari sebanyak tiga kali untuk masing-masing hari. Hasil keseksamaan larutan baku dapat dilihat pada tabel 4.2. Tabel 4.2 Keseksamaan Metode Analisis Malachite Green pada Berbagai Konsentrasi Larutan Baku Konsentrasi Serapan KV Kriteria KV (%) F F tabel (bpj) Hari I, II, III (%) (antar hari) hitung (95%) 0,9 0,2415 ± 0,0472 7,87 16,26 2,66 5,14 1,2 0,2945 ± 0,0335 4,58 15,57 2,53 5,14 1,8 0,4430 ± 0,0343 3,12 14,65 2,61 5,14 2,1 0,5141 ± 0,0291 2,28 14,31 2,65 5,14 2,4 0,5800 ± 0,0402 2,79 14,02 2,65 5,14 2,7 0,6579 ± 0,0402 2,46 13,78 2,64 5,14 Penentuan keseksamaan terhadap larutan baku diperoleh dari pengukuran serapan berbagai konsentrasi larutan baku selama tiga hari sebanyak tiga kali untuk masing-masing hari. Pengujian nilai koefisien variasi menunjukkan bahwa koefisien variasi memenuhi kriteria yaitu berada di bawah batas koefisien variasi yang diperbolehkan (batas KV dihitung dengan rumus 2 ( 1 0,5 log C) ) menunjukkan keseksamaan yang dapat diterima. Nilai F hitung yang lebih kecil dibandingkan dengan F tabel dengan batas kepercayaan 95% pada masingmasing konsentrasi menunjukkan bahwa pengukuran pada hari I, II, dan III tidak berbeda secara bermakna. Keseksamaan pada larutan sampel yang ditambahkan malachite green dengan tiga konsentrasi dilakukan dengan pengukuran masing-masing sebanyak tiga kali. Koefisien variasi yang diperoleh memenuhi kriteria koefisien variasi (masih berada di bawah batas KV yang diperbolehkan). Data keseksamaan terhadap larutan sampel dapat dilihat pada tabel 4.3. Tabel 4.3 Keseksamaan pada Larutan Sampel yang Ditambahkan Malachite Green Konsentrasi yang ditambahkan (bpj) Konsentrasi yang diperoleh (bpj) KV (%) Kriteria KV (%) [2 (1-0,5log C) ] Simpangan baku (S) 1,5 1,39 ± 0,11 3,04 15,05 0,04 2,1 2,02 ± 0,07 1,33 14,31 0,03 2,7 2,41 ± 0,32 5,41 13,78 0,13
25 Seperti yang telah disebutkan sebelumnya bahwa malachite green biasa dikenal dalam bentuk kromatik yaitu sebagai zat pewarna. Jika diberikan kepada ikan sebagai antijamur, antiparasit atau antibakteri, malachite green akan diubah menjadi bentuk lain melalui mekanisme tubuh ikan. Bentuk pertama adalah basa karbinol yang dapat melewati membran sel dengan cepat. Ketika berada di dalam sel, basa karbinol ini dimetabolisme menjadi leucomalachite green (Andersen, 2006). Hal tersebut menunjukkan bahwa leucomalachite green yang merupakan metabolit dari malachite green dapat juga ditemukan pada ikan yang diberi malachite green. Oleh sebab itu, pada penelitian ini ditentukan residu malachite green total pada ikan yang meliputi malachite green dan leucomalachite green yang telah dioksidasi dahulu menjadi malachite green Sampel yang digunakan adalah ikan air tawar yaitu ikan mas karena ikan ini relatif murah, mudah diperoleh dan dipelihara, serta dikonsumsi oleh masyarakat luas. Sebelum dilakukan analisis, ikan-ikan itu diberi 2 perlakuan yaitu direndam dalam larutan malachite green 2 bpj selama 1 jam dan diberi makanan sebanyak 30 g yang mengandung malachite green (dengan perbandingan 10 g per 1 kg makanan ikan) selama 3 hari. Perlakuan I dan II tersebut dilakukan sebagai simulasi berbagai macam kemungkinan pemaparan malachite green ke dalam jaringan ikan. Sampel ikan dihaluskan dengan blender untuk meningkatkan luas permukaan kontak sehingga proses ekstraksi akan lebih baik. Berdasarkan informasi bahwa di dalam jaringan ikan terdapat sejumlah malachite green yang diubah menjadi leucomalachite green, maka sebelum diekstraksi dengan asetonitril, sampel direaksikan dahulu dengan 2,3-dikloro-5,6- disiano-1,4-benzokuinon (DDQ) untuk mengubah leuco malachite green yang mungkin ada di dalam sampel menjadi malachite green dengan mekanisme oksidasi. Oksidator yang dipilih adalah DDQ karena DDQ dapat mengoksidasi golongan leuco-trifenilmetana (termasuk leucomalachite green) lebih cepat dibandingkan oksidator dari golongan kuinon lainnya (Lewis, 1970). Setelah leucomalachite green dioksidasi, dilakukan ekstraksi dengan asetonitril karena malachite green yang bersifat polar itu larut dan stabil dalam asetonitril. Ekstraksi cair-cair dilakukan dengan diklorometana. Namun, mengingat syarat ekstraksi cair-cair adalah menggunakan dua pelarut yang tidak saling bercampur. Diklorometana merupakan pelarut yang bercampur dengan asetonitril. Oleh sebab itu, sebelum dilakukan ekstraksi cair-cair,
26 larutan sampel hasil ekstraksi dengan asetronitril ditambahkan dahulu dengan air suling agar asetonitril dan diklorometana menjadi tidak bercampur. Setelah itu, lapisan diklorometana diambil, diuapkan dengan rotary evaporator, dan dilarutkan kembali dalam asetonitril, kemudian diukur dengan spektrofotometer sinar tampak pada panjang gelombang serapan maksimum yaitu 618 nm. Hasil pengukuran dapat dilihat pada tabel 4.4. Tabel 4.4 Residu Malachite Green Total dalam Sampel Ikan Mas Sampel Ikan mas yang direndam dalam larutan malachite green 2 bpj Ikan yang diberi makanan yang telah ditambahkan malachite green (dengan perbandingan 10 g malachite green per 1 kg makanan ikan) Residu malachite green total (bpj) 0,58 ± 0,05 2,64 ± 0,09