BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN 4.1 Hasil 4.1.1 Pengembangan Metode Pengembangan metode dapat dilakukan dalam semua tahapan ataupun hanya salah satu tahapan saja. Pengembangan metode dilakukan karena metode tersebut belum terstandarisasi ataupun dilakukan agar diperoleh hasil yang optimal dibandingkan dengan metode sebelumnya. Pada penentuan kadar kalsium (Ca) dalam tanaman kubis metode spektrofotometri serapan atom (SSA) pengembangan metode dilakukan pada tahapan pembuatan deret larutan standar. Pada metode sebelumnya pembuatan deret larutan standar dilakukan dengan pemipetan langsung dari larutan induk 1000 ppm, masing-masing dipipet dan dimasukan ke dalam labu ukur lalu di tanda bataskan dengan larutan asam perklorat 0,1 M dan dihasilkan larutan deret standar 0-100 ppm. Kemudian setiap larutan deret standar dipipet sebanyak 0,5 ml dan di tambahkan larutan lanthan nitrat 4,5 ml hingga menjadi 5 ml. Pada metode yang dikembangkan, deret larutan standar dibuat dengan pemipetan dari larutan induk 1000 ppm yang telah terlebih dahulu diencerkan menjadi 100 ppm. Kemudian dari larutan 100 ppm dipipet masing-masing ke dalam labu ukur 10 ml, untuk membuat deret larutan standar 0-140 ppm, lalu tambahkan larutan lanthan nitrat 4,5 ml dan di tanda bataskan dengan larutan asam perklorat 0,1 M. 30
Dari kedua metode tersebut didapatkan nilai serapan absorbansi yang berbeda. Deret larutan deret standar untuk metode sebelumnya menghasilkan nilai absorbansi yang lebih rendah dibandingkan dengan metode yang dikembangkan. Hal ini disebabkan karena pada metode sebelumnya terjadi pengenceran secara sistematik, sehingga serapan yang dihasilkan menjadi lebih rendah dan tidak sesuai dengan Hukum Lambert-Beer yang memiliki rentang kerja dengan absorbansi pada 0,2-0-8. Rentang kerja untuk pengukuran dengan SSA berada pada rentang absorbansi 0,2 sampai 0,8 atau 15% sampai 70% jika dibaca sebagai transmitans. Anjuran ini berdasarkan anggapan bahwa pada kisaran nilai absorbansi tersebut kesalahan fotometrik yang terjadi adalah paling minimal, sehingga penyimpangan yang terjadi semakin kecil, hal ini sesuai dengan hubungan antara absorbansi dengan persen kesalahan relatif sesuai dengan Gambar 4.1 (Pecsock, R.R, et al., 1976). Gambar 4.1 Grafik Hubungan antara Absorbansi dengan Persen Kesalahan Relatif. 31
Hasil pengukuran absorbansi untuk deret larutan standar metode sebelumnya dan metode yang dikembangkan terdapat pada Tabel 4.1. Tabel 4.1 Hasil Pengukuran Deret Larutan Standar Metode Sebelumnya dan yang Dikembangkan No Konsentrasi (ppm) Absorbansi (metode sebelumnya) Absorbansi (metode yang dikembangkan) 1. 0-0,0002 2. 20 0,0416-3. 40 0,0752-4. 60 0,1153 0,2812 5. 80 0,1449 0,3798 6. 100 0,1780 0,4705 7. 120-0,5041 8. 140-0,6684 Perubahan yang dilakukan pada pembuatan deret larutan standar menghasilkan absorbansi yang lebih baik dibandingkan dengan metode sebelumnya. Absorbansi yang dihasilkan lebih mendekati daerah kerja untuk SSA adalah antara 0,2-0,8. 4.1.2 Perbandingan Hasil Analisis Kadar Kalsium pada Tanaman Kubis. Penentuan kadar Ca pada tanaman kubis dilakukan dengan metode spektrofotometri serapan atom (SSA). Penentuan kadar Ca yang terdapat dalam SNI hanya berlaku untuk kalsium dalam air, sedangkan untuk kalsium dalam tanaman kubis belum tersedia metode standarnya. Kadar Ca total didapat dengan mengekstrak seluruh bagian tanaman antara lain daun, batang dan akar tanamana kubis tersebut. Untuk perhitungan kadar Ca melibatkan faktor koreksi kadar air, karena kubis memiliki kadar air 32
yang sangat tinggi yaitu 93,60-94,20%. Perbandingan hasil analisis kadar Ca dalam tanaman kubis melalui metode sebelumnya dan metode yang dikembangkan terdapat pada Tabel 4.2. Tabel 4.2 Perbandingan Hasil Analisis Kadar Ca dalam Tanaman Kubis No Hasil Kadar Ca dengan Metode Sebelumnya (%) Hasil Kadar Ca dengan Metode yang Dikembangkan (%) 1. 1,57 1,65 2. 1,55 1,66 3. 1,50 1,65 4. 1,67 1,62 5. 1,50 1,64 6. 1,53 1,64 7. 1,61 1,66 Rata-Rata 1,56 1,64 Kadar Ca Standar (%) 1,00 - >3,50 Tahapan yang dilakukan pada analisis kadar Ca dalam tanaman kubis adalah melakukan preparasi sampel terlebih dahulu. Tanaman kubis yang digunakan adalah kubis daun yang berusia 100 hari dan jumlah sampel yang digunakan adalah 7 buah sesuai dengan persyaratan minumim untuk sampel validasi metode. Ekstraksi dilakukan dengan proses destruksi basah dengan pelarut asam nitrat dan asam perklorat dengan perbandingan 1:1. Destruksi dilakukan untuk memutuskan ikatan antara senyawa organik dengan logam yang akan dianalisis yaitu Ca. Untuk menentukan kadar kalsium dalam sampel tanaman kubis tersebut tahapan selanjutnya yang dilakukan adalah analisis Ca dalam sampel dengan menggunakan SSA. Analisis kadar Ca dalam tanaman kubis dengan metode yang dikembangkan menghasilkan kadar yang lebih besar dibandingkan dengan metode 33
sebelumnya. Data perhitungan penentuan kadar Ca dalam tanaman kubis terdapat pada Lampiran 7 dan 8. 4.1.3 Validasi Metode Analisis Ca dengan Metode Spektrofotometri Serapan Atom 4.1.3.1 Penentuan Rentang Kerja (Linieritas dan Working Range) Rentang kerja spektrofotometer serapan atom ditentukan dengan cara membuat kurva hubungan antara absorbansi pada sumbu y dan konsentrasi standar pada sumbu x. Konsentrasi yang digunakan pada metode sebelumnya adalah 0-100 ppm dan metode yang dikembangkan adalah 0-140 ppm. Adapun kurva kalibrasi untuk kedua metode tersebut terdapat pada Gambar 4.2. 0.8 0.7 0.6 B y B = 0.0047x + 0.0032 R = 0.9999 y A = 0.0017x + 0.003 R = 0.9990 0.5 Deret Standar Metode yang Dikembangkan Absrobansi 0.4 0.3 0.2 0.1 0-0.1 A 0 20 40 60 80 100 120 140 Konsentrasi Ca (ppm) Deret Standar Metode Sebelumnya Linear (Deret Standar Metode yang Dikembangkan) Linear (Deret Standar Metode Sebelumnya) Gambar 4.2 Persamaan Regresi untuk Larutan Deret Standar Metode A (Sebelumnya) dan B (yang Dikembangkan) Pada uji linearitas ini digunakan deret larutan standar, untuk mengetahui pengaruh matriks deret larutan standar terhadap linearitas. Dari hasil uji linearitas untuk deret larutan standar didapat persamaan regresi untuk deret larutan standar 34
metode sebelumnya adalah Y = 1,712. 10-3 x + 0,003 dengan nilai koefisien korelasi sebesar 0,9990 dan data deret larutan standar pada metode yang dikembangkan didapat persamaan regresi Y = 4.57. 10-3 x + 0,0032 dengan nilai koefisien korelasi sebesar 0,9999. Hasil uji linearitas ini juga menunjukkan bahwa perbedaan metode pada kedua pembuatan larutan deret standar dapat berpengaruh terhadap linearitas. Pada kedua metode dilakukan perhitungan uji kesamaan beberapa rata-rata (Anava) konsentrasi pada larutan deret standar Ca sebagai uji titik nol metode pada kedua metode. Kedua metode dengan 6 derajat kebebasan menghasilkan nilai 1,126 untuk metode sebelumnya dan 0,50 untuk metode yang dikembangkan dengan gawat t adalah 2,45 (P= 0,05) maka untuk metode yang dikembangkan menghasilkan data uji titik nol yang lebih baik dibandingkan dengan metode sebelumnya. Peningkatan konsentrasi dan perubahan teknik pencampuran perekasi menyebabkan absorbansi terukur menjadi lebih tinggi sehingga menyebabkan konsentrasi terukur lebih besar. Dampak lain dari pengembangan metode yang telah dilakukan adalah memiliki sensitivitas yang lebih baik seperti yang ditunjukan oleh kemiringan kurva. Hal ini berpengaruh lebih lanjut pada besarnya batas deteksi dan batas kuantitasi metode. Perhitungan untuk linearitas terdapat pada Lampiran 2 dan 4. 4.1.3.2 Penentuan Batas Deteksi (LOD) dan Batas Kuantitasi (LOQ) Batas deteksi dan batas kuantitasi ditentukan dari persamaan regresi linear kurva standar hasil penentuan linieritas. Parameter ini ditentukan untuk 35
mengetahui jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat dideteksi yang masih memberikan respon signifikan. Kedua parameter ini mempunyai nilai yang bergantung pada metode dan instrumentasi yang digunakan. Untuk perhitungan LOD dan LOQ data blanko tidak menghasilkan sinyal sehingga SD (standar deviasi) dari blanko tersebut adalah nol maka SD diganti dari data larutan deret standar dengan rumusan : LOD = 3(SD/b).4.1 LOQ = 10 (SD/b)..4.2 Keterangan: SD = Simpangan baku deret standar b = Kemiringan garis regresi (Y=bx+a) Nilai LOD yang diperoleh dari metode sebelumnya adalah 11,04 (mg/l) sedangkan pada metode yang dikembangkan nilai LOD yang diperoleh adalah 17,72 (mg/l). Nilai ini menunjukkan bahwa respon Ca dapat dibedakan pada konsentrasi terendah dalam dua metode yang berbeda. Instrumen tidak dapat membedakan respon Ca pada konsentrasi dibawah nilai 11,039 (mg/l) dan 17,72 (mg/l). Perbedaan nilai LOD pada metode sebelumnya dan metode yang dikembangkan disebabkan karena perbedaan kisaran deret larutan standar antara kedua metode tersebut dan nilai kemiringan yang dihasilkan. Angka kisaran yang lebih besar dan nilai kemiringan yg besar akan mengakibatkan bertambahnya nilai LOD yang didapat. Nilai LOQ berdasarkan hasil penelitian dengan metode sebelumnya nilai yang diperoleh adalah 36,79 (mg/l) dan metode yang dikembangkan nilai yang 36
diperoleh adalah 59,08 (mg/l). Konsentrasi analit yang terukur di bawah nilai yang tersebut akan memberikan ketelitian dan ketepatan yang kurang baik. Angka kisaran yang lebih besar dan nilai kemiringan yg besar akan mengakibatkan bertambahnya nilai LOQ yang didapat. Perhitungan LOD dan LOQ terdapat pada Lampiran 5 dan 6. 4.1.3.3 Penentuan Ketelitian (Presisi) Ketelitian atau presisi adalah pengukuran bias random dari suatu metode. Dengan demikian makin besar jumlah ulangan yang dilakukan, kualitas hasil uji makin mengalami peningkatan. Ketelitian metode spektrofotometri serapan atom pada penentuan kadar kalsium pada tanaman kubis ditentukan dengan pengulangan sebanyak 7. Ketelitian ditentukan melalui keterulangan perlakuan oleh operator, instrumen, peralatan, dan laboratorium yang sama. Keterulangan dilakukan untuk mengetahui adanya galat acak yang berasal dari penyiapan larutan sampel maupun instrumen. Selain itu, keterulangan dapat pula digunakan untuk mengetahui adanya galat acak yang berasal dari semua tahapan baik itu preparasi sampel tahap ekstraksi, dan pengujian. Keterulangan menunjukan ketelitian operator, instrument yang baik dan laboratorium yang memadai. Bila hal tersebut dapat terpenuhi maka akan menghasilkan perbedaan nilai keterulangan yang rendah dari suatu metode yang divalidasi. Nilai keterulangan diperoleh dari nilai koefisien variasi (%RSD) kadar kalsium pada tanaman kubis tersebut. Nilai yang baik diperoleh dengan RSD (%) dibawah 5%. Untuk menentukan nilai RSD (%) rumus yang digunakan adalah sebagai berikut: 37
SD =.4.3 % RSD = x 100%...4.4 Keterangan: Xi = kadar sampel X = kadar rata-rata sampel n = jumlah perlakuan Nilai RSD yang dihasilkan dari metode sebelumnya adalah 0,575% dan dari metode yang dikembangkan adalah 0,132 % Nilai RSD yang dihasilkan dari penggunaan metode yang dikembangkan lebih kecil dibandingkan dengan metode sebelumnya hal tersebut menunjukkan bahwa galat acak yang berasal dari semua proses penentuan kadar kalsium dalam kubis pada metode baru tidak mempengaruhi hasil analisis. Metode yang dikembangkan pada penentuan kadar kalsium pada tanaman kubis merupakan metode yang memiliki kriteria yang seksama pada setiap tahap pengujiannya dibandingkan dengan metode sebelumnya. Perhitungan penentuan ketelitian terdapat pada Lampiran 9 dan 10. 4.1.3.4 Penentuan Ketepatan (Akurasi) Ketepatan atau akurasi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya dinyatakan dengan nilai sebenarnya (true value) atau nilai yang dianggap benar (accepted value). Untuk mencapai ketepatan yang tinggi hanya dapat dilakukan dengan cara mengurangi galat sistematik tersebut seperti menggunakan peralatan yang telah dikalibrasi, menggunakan pereaksi dan pelarut yang baik, pengontrolan suhu, dan pelaksanaannya yang cermat, taat asas sesuai prosedur. 38
Penentuan ketepatan atau akurasi dilakukan dengan uji perolehan kembali (%Recovery) yang didapat dari hasil bagi antara konsentrasi sampel yang terukur oleh alat dengan konsentrasi sampel sebenarnya dengan menggunakan rumus: % Recovery = x 100%...2.6 Keterangan: A = Jumlah total analit setelah ditambahkan baku B = Jumlah total analit sebelum ditambahkan baku C = Baku yang ditambahkan ke dalam analit..(harmita, 2004:117). Perolehan kembali yang ditetapkan dengan cara menambahkan analit dalam jumlah sampel tertentu ke dalam tempat yang mengandung analit yang sama dan ditentukan harga persen perolehan kembali. Untuk analisis harga persen perolehan kembali berkisar antara 95-102% untuk sampel dengan konsentrasi >10%. Semakin dekat hasil analisis yang diperoleh dengan nilai yang sebenarnya maka akurasinya semakin tinggi. Ketepatan dapat menunjukkan adanya galat sistematik yang dapat mempengaruhi metode analisis. Galat sistemik dapat menyebabkan hasil analisis menjadi lebih besar atau lebih kecil. Beberapa contoh penyebab galat sistemik diantaranya adalah galat pada saat pengambilan contoh, kurva kalibrasi yang tidak linear, serta galat yang disebabkan oleh instrumen dan peralatan kaca yang digunakan (Harvey, 2000: 57-58). Sejumlah sampel di tambahkan analit kalsium sebesar 20 ppm pada tahapan awal ekstraksi. Hal ini dilakukan agar analit yang ditambahkan ikut melalui serangkaian tahapan yang dilalui pada penentuan kadar kalsium dalam tanaman tersebut sehingga bisa diketahui apakah dengan perlakuan yang sama analit yang ditambahkan akan tetap kembali atau pada saat pengujian yaitu 39
sebesar 20 ppm atau tidak. Pada Tabel 4.3 menunjukan data perbandingan hasil perolehan kembali (% Akurasi). Tabel 4.3 Data Perbandingan Hasil Perolehan Kembali (% Akurasi) Metode Sebelumnya dan yang Dikembangkan Dibandingkan dengan Standar No % Akurasi Metode Sebelumnya % Akurasi Metode yang Dikembangkan 1. 63,964 107,1 2. 74,770 107,5 3. 89,663 91,70 4. 46,147 97,59 5. 85,283 102,70 6. 80,611 100,44 7. 44,104 95,07 Rata-Rata 69,220 100,3 % Akurasi Standar >10 % 95-102% Metode yang dikembangkan menghasilkan nilai akurasi yang lebih mendekati dengan nilai yang sebenarnya. Sedangkan untuk metode sebelumnya tidak menghasilkan nilai akurasi yang sesuai dengan nilai yang sebenarnya. Sehingga bisa disimpulkan hasil yang diperoleh metode yang dikembangkan mempunyai keakurasian yang tinggi. Perhitungan penentuan ketepatan terdapat pada Lampiran 11 dan 12. 4.1.3.5 Penentuan Selektifitas Penentuan selektifitas dilakukan dengan ditambahkannya bahan cemaran, hasil uraian, senyawa sejenis, senyawa asing lainnya, dan dibandingkan terhadap hasil analisis sampel yang tidak mengandung bahan lain yang ditambahkan. Dalam penelitian ini ke dalam sampel ditambahkan unsur asing yang telah terlebih dahulu diketahui konsentrasinya. 40
Unsur asing adalah Magnesium (Mg) sebanyak 1 ppm, pemilihan Mg dalam hal ini dikarenakan dalam tanaman Ca dan Mg mempunyai hubungan yang sangat erat. Sehingga diharapkan dengan penambahan Mg akan dapat mendetaksi apakah metode yang digunakan pada penentuan kadar Ca dalam sampel tanaman tersebut dapat secara selektif hanya mendeteksi Ca saja atau Mg yang ditambahkan bisa mempengaruhinya. Adapun hipotesis nol nya adalah (Ho): metode yang dikembangkan tidak selektif terhadap pengukuran Ca dan hipotetsis uji H 1 : metode yang dikembangkan selektif terhadap pengukuran Ca. Dari hasil penelitian didapatkan bahwa pada ke tujuh sampel yang ditambahkan Mg mengalami perbahan absorbansi, tetapi perubahan tidak terjadi secara signifikan sehingga dapat disimpulkan pada data yang mempunyai 6 derajat kebebasan dengan nilai 0,013 nilai gawat t adalah 2,45 (P= 0,05) karena nilai hitung t 2,45 maka t tabel > t hitung dan hipotesis uji dapat dipertahankan. Metode tersebut tidak memberikan nilai yang berbeda secara signifikan untuk kadar kalsium sehingga metode tersebut selektif untuk menggukur kadar kalsium pada tanamaan kubis. Untuk perhitungan uji statistik pada penentuan selektifitas tertera pada Lampiran 13. 4.1.3.6 Penentuan Ketangguhan (Ruggedness) Ketangguhan metode dapat diperoleh dari analisis sampel yang sama dalam berbagai kondisi uji normal, seperti laboratorium, analisis, instrumen, bahan pereaksi, suhu, hari yang berbeda. Sehingga dari perubahan tersebut dapat diketahui apakah metode tersebut akan tetap tangguh walau dilakukan pada kondisi yang berbeda. 41
Pada penelitian ini kondisi yang digunakan untuk menguji ketangguhan suatu metode adalah dengan perbedaan hari pengujian. Pengujiann diakukan pada deret larutan standar Ca agar bisa lebih terlihat dari perubahan nilai koefisien korelasi dari deret larutan standar tersebut. Larutan deret standar Ca yang sudah dibuat diuji pada hari yang berbeda yang berjarak selamaa 7 hari. Data perbandingan kurva absorbansi terhadap konsentrasi yang diperoleh pada tiga kali pengujian dapat dilihat pada Gambar 4.3. Absorbansi 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 20 40 60 80 100 120 140 Deret Standar Tahap 1 Deret Standar Tahap 2 Deret Standar Tahap 3 Konsentrasi (Ca) PPM Gambar 4.3 Kurva Perbandingan Larutan Deret Standar Analisis Kadar Ca dalam Tanaman Kubis Metode SSA Tahap 1, 2 dan 3 PadaUji Ketangguhan Dari hasil tiga kali pengujian pada hari yang berbeda diperoleh hasil yaitu terjadi perubahan nilai absorbansi pada deret larutan standar tersebut. Perubahan tidak terjadi secara signifikan dan nilai koefisien korelasi pada ketiga deret larutan standar tersebut masih sesuai dengan yang ditetapkan oleh ICH yaitu 0,9970. Pada deret larutan standar pertama nilai koefisien korelasi yang dihasilkan adalah 42
0,9999 dan pada deret standar yang kedua dan ketiga masing-masing sebsar 0,9998. Data perbandingan dan gambar untuk deret standar pada uji ketangguhan terdapat pada Tabel 4.4. Adapun untuk perhitungan lebih lengkap tertera pada Lampiran 17. Tabel 4.4 Data Perbandingan Kurva Deret Standar Analisis Kadar Ca dalam Tanaman Kubis Metode SSA PadaUji Ketangguhan No Konsentrasi Absorbansi Absorbansi Absorbansi (ppm) Tahap 1 Tahap 2 Tahap 3 1. 20 0,0852 0,0982 0,1218 2. 40 0,1822 0,2102 0,2583 3. 60 0,2812 0,3199 0,3926 4. 80 0,3798 0,4246 0,5312 5. 100 0,4705 0,5276 0,6493 6. 120 0,5641 0,6278 0,7771 7. 140 0,6684 0,7468 0,9117 4.2 Pembahasan Berdasarkan hasil validasi metode secara keseluruhan dari kedua metode yang dilakukan dapat disimpulkan bahwa metode yang dikembangkan menghasilkan data validasi yang secara umum lebih baik bila dibandingkan dengan data validasi metode sebelumnya seperti ditunjukkan pada Tabel 4.5. Tabel 4.5 Data Validasi Metode Sebelumnya dan Metode yang Dikembangkan untuk Analisis Ca dengan Teknik SSA. Parameter Metode yang Metode Dikembangkan Sebelumnya Acuan Linearitas R= 0,9999 R= 0,9990 R>= 0,997 LOD 17,72 (mg/l) 11,03 (mg/l) - LOQ 59,08 (mg/l) 36,79 (mg/l) - Presisi 0,132% 0,575% <= 5% Akurasi 100,3% 69,22% 95-102% Selektifitas 6 t (0,013) - t adalah 2,45 (P=0,05) Ketangguhan Baik - Baik 43
Peningkatan hasil terjadi pada semua parameter validasi. Peningkatan nilai koefisen korelasi terjadi pada metode yang dikembangkan hal ini terjadi karena terjadinya peningkatan nilai absorbansi yang terukur sehingga kemiringan kurva yang lebih baik dibandingkan dengan metode sebelumnya. Hal ini berpengaruh lebih lanjut pada besarnya batas deteksi dan batas kuantitasi metode yang terukur menjadi lebih baik pada metode yang dikembangkan. Pada penentuan kadar terjadi peningkatan pada metode yang dikembangkan hal ini disebabkan karena salah satunya adalah penggunaaan lanthan nitrat sebagai reagensia pelepas yang dapat menghilangkan gangguan dari pembentukan senyawa stabil yaitu hadirnya fosfat atau silikat pada saat pengukuran terjadi. Selain dari hal tersebut peningkatan kadar terjadi karena kurva deret standar yang dijadikan sebagai acuan untuk perhitungan kadar menghasilkan nilai koefisien korelasi dan persamaan garis yang lebih baik. Peningkatan kadar dengan penggunaan lanthan nitrat sebagai reagensia pelepas pada larutan sampel terdapat pada Tabel 4.6. Tabel 4.6 Hasil Pengukuran kadar Ca dalam Sampel Tanaman Kubis tanpa Pengunaan Lanthan (A) dan dengan Penggunaan Lanthan (B). Jumlah Peningkatan Kadar A Kadar B Sampel Kadar (%) 1. 0,92 1,65 79,34 2. 0,82 1,66 102.43 3. 0,78 1,65 111,53 4. 0,84 1,62 92,85 5. 0,79 1,64 108,86 6. 0,76 1,64 117,10 7. 0,83 1,66 101,20 Rata-rata 0,82 1,64 101,10 44