PENYIAPAN SAMPEL DAN ANALISIS KANDUNGAN ASAM AMINO DALAM TERIPANG HITAM (Holothuria edulis) DENGAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (TLC) DAN KROMATOGRAFI CAIR BERKINERJA TINGGI (HPLC) TESIS Karya tulis sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister dari Institut Teknologi Bandung Oleh MAZDA NAFTALIA PALALANGAN NIM: 20507093 (Program Studi Kimia) INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2009
PENYIAPAN SAMPEL DAN ANALISIS KANDUNGAN ASAM AMINO SAMPEL TERIPANG HITAM (Holothuria edulis) DENGAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (TLC) DAN KROMATOGRAFI CAIR BERKINERJA TINGGI (HPLC) Oleh MAZDA NAFTALIA PALALANGAN NIM: 20507093 (Program Studi Kimia) Institut Teknologi Bandung Menyetujui Pembimbing Jumat, 26 Juni 2009 (Dr. Suryo Gandasasmita, MT) NIP. 132163880 i
HALAMAN PERSEMBAHAN Kupersembahkan karya ini kepada kedua orang tua, kedua anak tercinta Nini Rismala Putri dan Geby Oktavia Sari, adik Selvi dan adik Hesti beserta keluarga v
ABSTRAK PENYIAPAN SAMPEL DAN ANALISIS KANDUNGAN ASAM AMINO DALAM TERIPANG HITAM (HOLOTHURIA EDULIS) DENGAN KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (TLC) DAN KROMATOGRAFI CAIR BERKINERJA TINGGI (HPLC) Oleh Mazda Naftalia Palalangan NIM : 20507093 Teripang hitam (Holothuria edulis) merupakan hewan laut yang mempunyai kandungan gizi yang cukup tinggi khususnya protein, oleh karena itu, sangat potensial untuk dikembangkan sebagai produk agrokimia baru yang dapat mendatangkan devisa bagi negara dan meningkatkan kesejahtraan masyarakat. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengungkapkan jenis dan kadar asam amino yang terkandung dalam protein teripang hitam (Holothuria edulis). Identifikasi asam amino dilakukan dengan kromatografi lapis tipis (TLC) dan kromatografi cair berkinerja tinggi (HPLC). Sebagai fasa diam pada kromatografi lapis tipis adalah pelat silika gel 60 F 254. Dua macam fasa gerak yang digunakan untuk analisis dengan kromatografi lapis tipis berupa, campuran butanol: asam asetat: air (4:1:1) dan campuran kloroform : metanol : air (2:2:1). Kromatogram memperlihatkan 7 jenis asam amino, yaitu arginin, histidin, leusin, lisin, metionin, feilalanin dan valin. Untuk analisis asam amino yang dilakukan dengan HPLC, digunakan fasa gerak berupa bufer A (campuran natrium asetat 0,025 M dengan ph = 6,5), NaEDTA 9% (V/V), metanol 1 % (V/V), THF (tetra hidro furan) dan pelarut B (metanol 95%), fasa diam berupa ultra Techspere ODC (oktadesil silan), serta sistem deteksi derivatisasi pre column. Hasil penelitian menunjukkan bahwa daging teripang hitam (Holothuria edulis) mengandung asam amino nonesensial sebanyak 17,41 % yang terdiri dari asam aspartat 3,20 %, asam glutamat 4,25 %, serin 1,39 %, glisin 2,73 %, arginin 2,81 %, tirosin 0,90 %, dan alanin 2,13%. Sementara itu asam amino esensial sejumlah 9,56 % terdiri dari histidin 0,33 %, treonin 1,41 %, metionin 0,71 %, valin 1,08 %, fenilalanin 1,03 %, isoleusin 0,80%, leusin 1,71 %, dan lisin 2,49%. Kata kunci: Teripang hitam (Holothuria edulis), asam amino, kromatografi Lapis tipis (TLC), kromatografi cair berkinerja tinggi (HPLC). ii
iii
ABSTRACT SAMPLE PREPARATION AND ANALYSIS AMINO ACID FROM BLACK CUCUMBER (HOLOTHURIA EDULIS) WITH THIN LAYER CHROMATOGRAPHY (TLC) AND HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY (HPLC) By Mazda Naftalia Palalangan NIM : 20507093 Program Studi Kimia, Institut Teknologi Bandung Black cucumber (Holothuria edulis) is a sea animal having high nutrition, especially protein. Thus it is very potential to cultivate as a new agrochemical product.the research aim is to determine amino acid qualitatively and quantitatively in black cucumber (Holothuria edulis). The identification and determination of amino acid was carried out by thin layer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography (HPLC). TLC operational condition was as follows silica gel plat 60 F 254 was used as stationary phase and two types of mobile phase were buthanol : acetic acid : water (4 : 1 : 1) and chloroform : methanol : water (2 : 2 : 1). The chromatogram showed 7 amino acid, arginine, histidine, leusine, lisine, methionine, phenylalanine and valine. Analysis by HPLC was carried out using buffer A (mixture of sodium acetate 0,025 M (ph = 6,5); NaEDTA 9%(v/v); methanol 1%(v/v); THF as mobile phase; and reagent B (methanol 95%(v/v) as mobile phase, ultra Techspere ODC was used as stationary phase, and pre column derivation detection system. The result demonstrates that black cucumber (Holothuria edulis) consists of 17,41% non essential amino acid and 9,56% essential amino acid. Composition of non essential amino acid are 3,20% aspartic acid; 4,25% glutamic acid; 1,39% serine; 2,73% glisine; 2,81% arginine; 0,90% tyrosine; 2,13% alanine. And composition of essential amino acid are 0,33% histidine; 1,41% threonine; 0,71% methionine; 1,08% valine; 1,03% phenylalanine; 0,80% isoleusine; 1,71% leusine; and 2,49% lysine. Keywords: Black cucumber (Holothuria edulis), amino acid, thin layer chromatography (TLC), high performance liquid chromatography (HPLC). iii
PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS Tesis S2 yang tidak dipublikasikan terdaftar dan tersedia di perpustakaan Institut Teknologi Bandung, dan terbuka untuk umum dengan ketentuan bahwa hak cipta ada pada pengarang dengan mengikuti aturan HaKI yang berlaku di Institut Teknologi Bandun. Referensi kepustakaan diperkenankan dicatat, tetapi pengutipan atau peringkasan hanya dapat dilakukan seizing pengarang dan harus disertai dengan kebiasaan ilmiah untuk menyebutkan sumbernya. Memperbanyak atau menerbitkan sebagian atau seluruh tesis haruslah seizin Direktur Program Pascasarjana, Institut Teknologi Bandung. iv
v
UCAPAN TERIMA KASIH Puji Syukur penulis panjatkan ke hadirat Tuhan Yang Maha Esa, karena atas kasih karunia-nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan tesis ini yang disusun berdasarkan hasil penelitian yang telah dilakukan untuk melengkapi salah satu syarat dalam menyelesaikan Pendidikan Magister Pengajaran pada Program Pascasarjana di Institut Teknologi Bandung. Pada kesempatan ini penulis menyampikan ucapan terima kasih yang sebesarbesarnya kepada semua pihak yang telah membantu menyelesaikan tesis ini, khususnya kepada yang terhormat Bapak Dr. Suryo Gandasasmita, MT selaku pembimbing atas semua saran, bimbingan dan nasihat kepada penulis selama melakukan penelitian hingga tesis ini dapat diselesaikan. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada berbagai pihak yang membantu penulis dalam menyelesaikan program Magister, yaitu kepada yang terhormat: 1. Menteri Pendidikan Nasional yang telah memberikan dukungan pembiayaan melalui program beasiswa unggulan hingga penyelesaian Tugas Akhir Tesis berdasarkan DIPA Sekretariat Jendral DEPDIKNAS tahun anggaran 2007-2009. 2. Wali Kota Palu dan Kepala Dinas Pendidikan dan Pengajaran Kota Palu yang telah memberikan izin kepada penulis untuk mengikuti pendidikan program Magister di Sekolah Pascasarjana ITB. 3. Bapak Drs. Abdul Chair A.M, selaku kepala SMA Negeri 3 Palu yang telah mengizinkan dan mendukung penulis untuk mengikuti program Magister Pengajaran di Program Pascasarjana ITB. 4. Dekan dan para wakil Dekan FMIPA-ITB beserta para staf yang telah mengelola pelaksanaan pendidikan program Magister. vi
5. Ketua Program Studi, Ketua pengelola Program Magister Pengajaran Kimia, Staf Pengajar dan Tata usaha yang telah membimbing, mengajar, dan membantu penulis dalam mengikuti dan menyelesaikan Program Magister. 6. Bapak Dr. Muh. Zulfikar selaku Kepala Laboratorium Analitik Kimia ITB yang telah mengizinkan menggunakan sarana dan prasarana di Laboratorium Analitik sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian ini dengan baik. 7. Rekan-rekan mahasiswa S-1 dan S-2 angkatan 2006-2007 Jurusan Kimia ITB khususnya jurusan Kimia Analitik atas kebersamaan dan kekompakannya. 8. Ayah, ibu, saudara, dan anak-anak tercinta Nini Rismala Putri, Geby Octavia Sary atas bantuan dan dorongannya yang selama ini tidak henti-hentinya memotivasi penulis dalam mengikuti pendidikan Program Magister di Sekolah Pascasarjana ITB. vii
DAFTAR ISI Halaman HALAMAN PENGESAHAN... i ABSTRAK... ii ABSTRACT... iii PEDOMAN PENGGUNAAN TESIS... iv HALAMAN PERSEMBAHAN... v UCAPAN TERIMA KASIH... vi DAFTAR ISI... viii DAFTAR LAMPIRAN... x DAFTAR GAMBAR... xi DAFTAR TABEL... xii Bab I Pendahuluan I.1 Latar Belakang Masalah... 1 I.2 Perumusan Masalah... 2 I.3 Tujuan Penelitian... 3 I.4 Manfaat Penelitian... 3 I.5 Sistematika Tesis... 3 Bab II Tinjauan Pustaka II.1 Teripang... 5 II.1.1 Tinjauan umum tentang teripang... 5 II.1.2 Sistematika dan ciri morfologi teripang hitam (Holothuria edulis)... 8 II.2 Protein... 10 II.2.1 Tinjauan umum protein... 10 II.2.2 Struktur Protein... 10 II.2.3 Sifat-sifat Protein... 12 II.2.4 Fungsi protein dalam tubuh... 13 II.3 Asam amino... 14 II.3.1 Asam amino esensial dan non esensial... 18 II.3.2 Reaksi metabolisme asam amino... 20 II.3.3 Sifat asam-basa asam amino... 21 II.3.4 Reaksi gugus amino... 22 II.4 Analisi asam amino... 24 II.4.1 Kromatografi... 24 II.4.2 Kromatografi lapis tipis (KLT)... 25 II.4.3 Kromatografi cairan kinerja tinggi (HPLC)... 26 BAB III Metodologi Penelitian III.1 Bahan dan Alat yang Digunakan dalam Penelitian... 27 III.2 Pengambilan dan Penyiapan Sampel... 29 III.3 Penyiapan Larutan Standar... 30 III.4 Penyiapan Fase Diam Dan Fase Gerak Kromatografi Lapis Tipis (KLT)... 31 viii
III.4.1 Prosedur Kromatografi Lapis Tipis... 31 III.4.2 Pengkondisian Kromatografi Lapis Tipis... 31 III.5 Analisis Protein dengan Mikro-Kjeldahl... 32 III.5.1 Analisis Asam Amino... 32 III.5.2 Analisis Data... 34 III.6 Diagram Alir penelitian... 35 III.7 Menentukan Jenis Asam Amino Esensial dan gugus Peptida dalam Protein untuk Pembelajaran Kimia di SMA dengan membuat Modul Praktikum... 36 BAB IV Hasil dan Pembahasan IV.1 Hasil Analisis Protein dengan cara Mikro-Kjeldahl... 37 IV.2 Analisis Kualitatif asam amino dengan Kromatografi lapis tipis (KLT)... 39 IV.3 Analisis Kuantitatif Asam Amino dengan HPLC... 45 IV.4 Studi Pemisahan Asam amino Esensial dalam Sampel Teripang Hitam(Holothuria edulis) dengan Kromatografi Kertas...47 IV.5 Nilai Gizi Teripang Hitam (Holothuria edulis)...49 BAB V Kesimpulan dan Saran V.1 Kesimpulan... 52 V.2 Saran... 53 DAFTAR PUSTAKA... 54 LAMPIRAN... 56 ix
DAFTAR LAMPIRAN LAMPIRAN Halaman A. Daftar urutan fasa gerak berdasarkan kepolaran... 56 B. Kromatogram Asam Amino Standar... 57 C. Kromatogram Sampel Teripang Hitam (Holothuria edulis)... 58 D. Komposisi Asam-asam Amino Esensial dan Nilai Kimia Beberapa Protein Makanan (milligram asam amino per gram nitrogen)... 59 E. Gambar HPLC... 60 F. Modul Praktikum... 61 G. Asapek Pembelajaran tentang Ikatan Peptida... 63 H. Perhitungan Hasil Analisis HPLC setelah dikonfersi ke satuan dalam milligram asam amino per gram Nitrogen... 65 x
DAFTAR GAMBAR GAMBAR Halaman II.1 Jenis-jenis Teripang Ekonomis... 7 II.2 Morfologi teripang hitam (Holothuria edulis)... 9 II.3 Struktur dasar asam amino... 11 II.4 Pembentukan ikatan peptida... 11 II.5 Asam amino dengan gugus R non polar... 15 II.6 Asam amino dengan gugus R polar... 16 II.7 Asam amino dengan gugus R polar bermuatan negatif... 17 II.8 Asam amino dengan gugus R polar bermuatan positip... 17 II.9 Struktur ion zwitter asam amino... 21 II.10 Struktur D-alanin dan L-alanin... 22 II.11 Reaksi ninhidrin dengan asam amino... 23 II.12 Reaksi OPA dengan asam amino... 23 II.13 Blok diagram peralatan pokok HPLC... 26 III.1 Diagram alir penelitian... 35 III.2 Diagram alir penentuan asam amino dan gugus peptida dalam protein secara kromatografi kertas... 36 IV.1 Kromatogram dengan noda-noda sampel dan noda-noda asam amino standar (BAA)... 40 IV.2 Kromatogram dengan noda-noda sampel dan noda-noda asam amino Standar (CMA)... 41 B Kromatogram Asam Amino Standar... 57 C Kromatogram Asam Amino Teripang Hitam (Holothuria edulis) (sampel)... 58 E Gambar HPLC... 60 xi
TABEL DAFTAR TABEL Halaman II.1 Komposisi kandungan gizi teripang kering... 6 II.2 Asam amino esensial dan non esensial... 19 III.1 Komposisi larutan standar yang digunakan pada percobaan analisa kualitatif secara Kromatografi lapis tipis (KLT)... 30 III.2 Profil gradien asam-asam amino hidrolisa... 33 IV.1 Data hasil analisis protein teripang secara mikro-kjeldhal... 37 IV.2 Data fasa gerak hasil analisis kromatografi lapis tipis(klt)... 39 IV.3 Data hasil Kromatografi Lapis Tipis produk hidrolisis protein dengan fasa gerak n-butanol : asam asetat : air (BAA) (4 :1 :1) dan kloroform : metanol: amoniak (KMA) (2 :2 : 1)... 42 IV.4 Hasil analisis macam dan komposisi asam amino daging teripang hitam (Holothuria edulis) dan kadar asam amino lainnya... 46 IV.5 Hasil Percobaan Penentuan Asam Amino Esensial dalam Protein teripang hitam (Holothuria edulis) secara Kromatografi kertas dengan fasa gerak butanol : asam asetat : air (5:2:5)... 48 xii