3 METODE PENELITIAN 3.1 aktu dan Tempat Penelitian Penelitian tentang Pengaruh Metode Pengolahan terhadap Kandungan Mineral Keong Matah merah (Cerithidea obtusa) dilaksanakan dari bulan Februari-Mei 2011 bertempat di Laboratorium Karakteristik dan Penanganan Hasil Perairan (preparasi sampel); Laboratorium Formulasi dan Diversifikasi Hasil Perairan (proses perlakuan pengolahan); Laboratorium Biokimia Hasil Perairan (uji proksimat); dan Laboratorium Mikrobiologi Hasil Perairan (proses homogenisasi), Departemen Teknologi Hasil Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Intitut Pertanian Bogor. Laboratorium Pengujian (analisis kandungan dan kelarutan mineral keong matah merah), Departemen Teknologi Industri Pertanian, Fakultas Teknologi Pertanian, Institut Pertanian Bogor. Laboratorium terpadu (proses sentrifuse), Fakultas Kedokteran Hewan, Institut Pertanian Bogor. 3.2 Bahan dan Alat Bahan baku yang digunakan dalam penelitian ini adalah keong matah merah (Cerithidea obtusa) yang diperoleh dari Muara Sungai Musi, Sumatra Selatan. Bahan kimia yang digunakan untuk uji proksimat antara lain: akuades; HCl 0,02 N; H 2 SO 4 pekat; NaOH; H 3 BO 3 ; indikator metilen merah; larutan heksana; kertas saring hatman no. 42; HCl 10% dan AgNO 3 sedangkan untuk analisis kandungan dan kelarutan mineral adalah HNO 3 ; HClO 4 ; akuades; kertas saring hatman no. 42; asam sitrat pekat dan larutan standar. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS) merk Perkin Elmer AAnalyst 100, Spectrophotometer UV-VIS merk Sedico, sentrifuse merk Himac CR 21G, homogenizer merk iggen Hauser, oven merk Memmert dan termometer tipe et Bulb. 3.3 Metode Penelitian Penelitian ini dibagi menjadi tiga tahapan. Tahap pertama, yaitu pengambilan dan preparasi sampel, analisis proksimat meliputi kadar air, abu, lemak, protein, karbohidrat (by difference) (AOAC 1995) dan kadar abu tidak
larut asam (SNI 2354.1-2010). Tahap kedua penetapan metode pengolahan dan tahap ketiga, yaitu analisis kandungan mineral meliputi kandungan mineral makro, mineral mikro dan logam berat serta kelarutan mineral. Diagram alir penelitian disajikan pada Gambar 2. Sampel Sampel segar Perebusan 100 o C, 15 menit Perebusan air garam 2,5% 100 o C, 15 menit Pengukusan 100 o C, 30 menit 5 gram 10 gram Air Preparasi sampel padat menjadi larutan Homogenisasi 10000 rpm, 2 menit Pengenceran larutan Pengukuran mineral dan logam berat Sentrifuse 7000 rpm 4 o C, 10 menit Filtrasi Kandungan mineral dan logam berat Supernatan Pengukuran Ca, Mg, Ca, P Kelarutan mineral Gambar 2 Diagram alir total mineral dan kelarutannya. Keterangan : = Input/output = Proses = Data
3.3.1 Pengambilan dan preparasi bahan baku Keong laut yang diperoleh dalam keadaan hidup, disimpan dalam sterofoam sebagai media transportasi. Sampel sebanyak 30 ekor dilakukan pengukuran morfometrik meliputi berat total, panjang, lebar dan tebal keong matah merah kemudian dilanjutkan dengan preparasi sampel dimulai dari memisahkan daging dan jeroan keong dari cangkang dengan cara memecahkan cangkangnya lalu dilakukan perhitungan rendemen (Metusalach 2007). Analisis yang dilakukan pada tahap ini yaitu analisis proksimat meliputi kadar air, abu, lemak, protein, karbohidrat (by difference) (AOAC 1995) dan kadar abu tidak larut asam (SNI 2354.1-2010). 3.3.2 Metode pengolahan Penelitian pendahuluan dilakukan untuk mengetahui lamanya proses pengolahan. Daging keong yang akan diuji total mineral dan kelarutannya, dimasak terlebih dahulu hingga matang (daging lunak), dilakukan pengecekan daging keong matah merah tiap 5 menit sekali. Hasil yang diperoleh dari penelitian pendahuluan adalah keong yang direbus tanpa garam dan dengan garam akan matang pada suhu 100 o C selama 15 menit dan keong yang dikukus matang pada suhu 100 o C selama 30 menit. Penentuan konsentrasi garam dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan rasa yang tepat pada proses perebusan dengan garam. Konsentrasi garam yang akan diuji hedonik (uji kesukaan) parameter rasa yaitu 1%; 1,5%; 2%; 2,5% dan 3% (b/v). Penimbangan bobot keong dilakukan sebelum dan setelah proses pengolahan untuk mengetahui adanya penambahan atau penyusutan berat keong (Lampiran 1). Tahapan uji hedonik (SNI 2346-2011) yaitu sampel disajikan dengan memberikan kode nomor secara acak dan panelis sebanyak 30 orang diminta memberikan penilaian tingkat kesukaan terhadap rasa dari keong matah merah. Uji skala hedonik dilakukan berdasarkan tingkat kesukaan panelis dalam 9 skala kesukaan (1= amat sangat tidak suka, 2=sangat tidak suka, 3= tidak suka, 4= agak tidak suka, 5= netral, 6= agak suka, 7=suka, 8=sangat suka, 9= amat sangat suka) (Lampiran 2). Analisis yang dilakukan pada tahap ini meliputi analisis mineral (APHA 2005) dan kelarutan mineral (Santoso 2003 modifikasi pelarut air).
3.3.3 Rancangan percobaan dan analisis data 1) Analisis data uji hedonik Konsentrasi garam untuk proses perebusan garam ditentukan menggunakan uji hedonik. Data hasil uji hedonik dianalisis menggunakan Kruskal allis distribusi nilai uji Chi Square. Apabila nilai x 2 hitung > x 2 tabel maka tolak Ho (perbedaan konsentrasi garam memberikan pengaruh nyata terhadap parameter rasa keong matah merah). Prosedur pengujian Kruskall allis menggunakan rumus sebagai berikut (Steel dan Torrie 1993): (1) H = (2) FK = (3) H = Keterangan n i = Banyaknya pengamatan tiap perlakuan atau jumlah panelis N = Banyaknya data R i = Jumlah rata-rata tiap perlakuan ke-i T = Banyaknya pengamatan yang seri dalam tiap ulangan H = H terkoreksi FK = Faktor terkoreksi Apabila hasil uji Chi Square memberikan pengaruh nyata terhadap rasa keong matah merah maka pengujian dilanjutkan dengan uji Multiple Comparison dengan rumus sebagai berikut (Steel dan Torrie 1993): Keterangan : R i = Rata-rata rangking perlakuan ke-i R j = Rata-rata rangking perlakuan ke-j N = Banyaknya data K = Banyaknya perlakuan n i = Jumlah data perlakuan ke-i = Jumlah dat perlakuan ke-j n j
2) Rancangan percobaan kandungan mineral dan kelarutan mineral Rancangan percobaan yang digunakan untuk menguji pengaruh metode pengolahan terhadap kandungan mineral dan kelarutan mineral adalah metode rancangan acak lengkap (RAL) dengan satu faktor dan 4 taraf (sampel segar, pengukusan, perebusan tanpa garam dan perebusan dengan garam). Data dianalisis dengan ANOVA (Analysis Of Variant) distribusi nilai uji F, sebelum dilakukan uji F terlebih dahulu di uji kenormalan data. Uji kenormalan data mengunakan uji Kolmogrov Simirnov. Kurva normal yang dihasilkan pada uji Kolmogrov Simirnov disertakan dengan nilai rata-rata dan standar deviasi (simpangan baku). Nilai rata-rata menggambarkan posisi kurva pada sumbu X, sedangkan standar deviasi menggambarkan sebaran varian. Koefisien keragaman dengan nilai dibawah 50% (median) dinyatakan cukup baik karena dapat membuktikan pada tingkat kepercayaan 95% (Hills dan Little 1998). Suatu data dapat menyebar normal pada: x z α/2 x + z α/2 (alpole 1992) x = Rata-rata z = 1,96 µ = (1-α) 100 % σ = Simpangan baku n = Banyak data Koefisien keragaman = x 100 Model rancangan analisis ANOVA (Analysis Of Variant) atau uji F adalah sebagai berikut (Steel dan Torrie 1993): Keterangan : Y ij μ τi ε ij Y ij = μ + τi + ε ij = Nilai pengamatan pada taraf ke-i dan ulangan ke-j (j=1,2) = Nilai tengah atau rataan umum pengamatan = Pengaruh metode pengolahan pada taraf ke-i (i=1,2,3) = Galat atau sisa pengamatan taraf ke-i dengan ulangan ke-j
Hipotesis terhadap data hasil uji kandungan mineral pada berbagai metode pengolahan adalah sebagai berikut: H 0 = Metode pengolahan tidak memberikan pengaruh nyata terhadap kandungan mineral. H 1 = Metode pengolahan memberikan pengaruh nyata terhadap kandungan mineral. Hipotesis terhadap data hasil uji kelarutan mineral pada berbagai metode pengolahan adalah sebagai berikut: H 0 = Metode pengolahan tidak memberikan pengaruh nyata terhadap kelarutan mineral. H 1 = Metode pengolahan memberikan pengaruh nyata terhadap kelarutan mineral. Jika uji F pada ANOVA memberikan pengaruh nyata terhadap kandungan mineral atau kelarutan mineral maka dilanjutkan dengan uji Duncan, dengan rumus sebagai berikut: Keterangan : KTS = Kuadrat tengah sisa dbs = Derajat bebas sisa r = Banyaknya ulangan 3.3.4 Analisis Duncan = tα/2; dbs 1) Perhitungan rendemen (Metusalach 2007) Rendemen (yield) merupakan rasio antara bagian tubuh bahan baku yang dapat dimanfaatkan dengan berat total tubuh dan biasanya dinyatakan dalam satuan persen. Perhitungan rendemen Berat sampel (gram) % Rendemen = x 100% Berat total (gram) 2) Analisis proksimat (AOAC 1995) Analisis proksimat bertujuan untuk menganalisis kandungan gizi dari suatu bahan. Analisis proksimat meliputi kadar air, abu, lemak, protein dan karbohidrat.
a) Analisis kadar air Tahap pertama yang dilakukan untuk menganalisis kadar air adalah mengeringkan cawan dalam oven pada suhu 102-105 o C selama 15 menit. Cawan tersebut diletakkan dalam desikator dan biarkan sampai dingin. Pengambilan cawan dalam desikator menggunakan gegep kemudian timbang cawan tersebut hingga konstan. Cawan dan daging keong seberat 5 gram ditimbang setelah terlebih dahulu dicacah lalu dimasukkan kedalam oven dengan suhu 102-105 o C selama 10-15 jam. Cawan tersebut dimasukkan kedalam desikator dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang. Perhitungan kadar air basis basah 1 2 - ( 1-2 ) %Kadar air = x 100% : Bobot contoh sebelum dikeringkan (gram) : Bobot contoh dengan cawan sesudah dikeringkan (gram) : Bobot cawan kosong kering (gram) b) Analisis kadar abu Tahapan untuk menganalisis kadar abu yaitu, cawan kosong dikeringkan dalam oven pada suhu 102-105 o C selama 15 menit. Cawan tersebut diletakkan ke dalam desikator dan dibiarkan sampai dingin. Pengambilan cawan tersebut dalam desikator menggunakan gegep kemudian timbang cawan hingga konstan. Cawan dan daging keong seberat 5 gram ditimbang setelah terlebih dahulu dicacah lalu cawan tersebut dikeringkan ke dalam oven dengan suhu 102-105 o C selama 10-15 jam kemudian dilakukan pembakaran di atas kompor listrik sampai asap hilang. Setelah dibakar, cawan tersebut dipindahkan ke tanur listrik pada suhu 599 o C selama 8 jam sampai pengabuan sempurna. Cawan didinginkan ke dalam desikator dan dibiarkan sampai dingin kemudian ditimbang.
Perhitungan kadar abu basis basah 1 2 1-2 %Kadar abu = x 100% - 2 : Bobot contoh dengan cawan sebelum diabukan (gram) : Bobot contoh dengan cawan sesudah diabukan (gram) : Bobot cawan kosong kering (gram) c) Analisis kadar lemak Analisis kadar lemak dengan metode Soxhlet. Tahap pertama yang dilakukan adalah mengeringkan labu lemak didalam oven suhu 102-105 o C selama 15 menit kemudian dinginkan dalam desikator. Sebanyak 5 gram sampel dibungkus dalam kertas saring bebas lemak dan ditutup dengan kapas lalu diletakkan didalam alat ekstraksi soxhlet. Heksana ditambahkan ke dalam labu lemak kemudian dilakukan refluks selama ± 5 jam sampai pelarut turun kembali ke labu lemak dan menjadi jernih. Selanjutnya labu lemak yang berisi lemak hasil ekstraksi dipanaskan dalam oven pada suhu 105 o C. Setelah kering, dinginkan dalam desikator lalu timbang labu beserta lemaknya. Perhitungan kadar lemak basis basah 1 2 1-2 %Kadar lemak = x 100% : Bobot contoh (gram) : Bobot labu lemak dengan lemak hasil ekstraksi (gram) : Bobot labu lemak kosong (gram) d) Analisis kadar protein Prinsip analisis kadar protein yaitu dengan menganalisis kandungan nitrogen yang ada didalam bahan makanan menggunakan metode Kjeldahl. Tiga tahapan yang dilakukan meliputi tahap destruksi, destilasi dan titrasi. Destruksi Daging keong yang sudah dicacah ditimbang seberat 2 gram kemudian dimasukkan ke dalam tabung Kjeldahl, lalu ditambahkan satu butir kjeltab dan 15 ml H 2 SO 4 pekat ditambahkan secara perlahan ke dalam tabung kemudian
dimasukkan ke dalam alat pemanas dengan suhu 410 o C selama kurang lebih 2 jam atau sampai cairan berwarna hijau bening. Destilasi Tahap ini dimulai dari memindahkan sampel dari tabung kjeltec ke alat destilasi kemudian mencuci tabung kjeltec dengan akuades lalu air tersebut dimasukkan ke dalam alat destilasi dan ditambahkan 10 ml NaOH pekat sampai berwarna coklat kehitaman dan dilakukan destilasi. Hasil destilasi ditampung dalam erlenmeyer 125 ml yang berisi 25 ml asam borat (H 3 BO 3 ) 4% yang mengandung indikator methyl red 0,1% dengan perbandingan 2:1. Titrasi Hasil destilasi dititrasi dengan HCl 0,2 N sampai terjadi perubahan warna merah muda yang pertama kalinya. Pembacaan volume titran kemudian dilanjutkan dengan perhitungan kadar protein. Perhitungan kadar protein basis basah fp (ml HCl - ml blanko) x N HCl x 14,007 x fp %Nitrogen = x 100% mg keong matah merah = Faktor pengenceran %Kadar protein= % Nitrogen x 6,25 e) Perhitungan kadar karbohidrat (by difference) Perhitungan karbohidrat dilakukan dengan metode by difference, yaitu hasil pengurangan dari 100% dengan kadar air, kadar abu, kadar protein dan kadar lemak. Perhitungan kadar karbohidrat basis basah % karbohidrat = 100% - (kadar air+kadar abu+kadar lemak+kadar protein) 3) Analisis kadar abu tidak larut asam (SNI 2354.1-2010) Abu hasil penetapan kadar abu total dilarutkan dalam 25 ml HCl 10% dan dididihkan selama 5 menit. Larutan tersebut kemudian disaring dengan kertas saring hatman bebas abu dan dicuci dengan air suling sampai bebas klorida (dengan pereaksi AgNO 3 ). Kertas saring hatman kemudian dikeringkan dalam oven. Abu yang telah kering kemudian diabukan kembali dalam tanur
menggunakan wadah cawan porselen. Cawan tersebut kemudian didinginkan dalam desikator dan ditimbang hingga beratnya tetap. Perhitungan kadar abu tidak larut asam basis basah 1 2 1-2 % Kadar abu tidak larut asam = x 100% : Bobot contoh sebelum diabukan (gram) : Bobot contoh dengan cawan sesudah diabukan (gram) : Bobot cawan kosong (gram) 4) Analisis mineral Pengujian total mineral meliputi lima mineral makro, empat mineral mikro dan dua logam berat. Lima mineral makro di antaranya kalsium (Ca), kalium (K), natrium (Na), magnesium (Mg) dan fosfor (P), sedangkan empat mineral mikro, yaitu selenium (Se), besi (Fe), seng (Zn) dam tembaga (Cu). Analisis logam berat meliputi timbal (Pb) dan merkuri (Hg). a) Pengujian total mineral Ca, K, Na, Mg, Se, Fe, Zn, Cu, Pb dan Hg (APHA 2005) Prinsip pengujian total mineral yaitu mengetahui nilai absorpsi logam menggunakan metode Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS). Sebanyak 2 gram sampel daging keong yang sudah dicacah dimasukkan ke dalam erlenmeyer 150 ml, kemudian ditambahkan 5 ml asam nitrat 65% yang bertujuan untuk melarutkan kandungan anorganik dan dipanaskan di atas hot plate lalu dinginkan. Setelah dingin ditambahkan ke dalam erlenmeyer asam peklorat 2 ml, hal ini bertujuan untuk menguapkan kandungan organik pada sampel lalu dipanaskan di atas hot plate dan dinginkan. Larutan diencerkan dengan akuades menjadi 100 ml dalam labu takar lalu larutan disaring dengan kertas saring hatman sampai didapatkan larutan yang jernih. Sejumlah larutan stok standar dari masing-masing mineral diencerkan dengan akuades sampai konsentrasinya berada dalam kisaran kerja logam yang diinginkan. Larutan standar, blanko dan contoh dialirkan ke dalam Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS) merk Perkin Elmer AAnalyst 100 dengan panjang gelombang dari masing-masing jenis mineral, kemudian diukur
absorbansi atau tinggi puncak standar, blanko, dan contoh pada panjang gelombang dan parameter yang sesuai untuk masing-masing mineral. Perhitungan kadar mineral (mg/kg) basis basah fp = Faktor pengencer ppm terbaca x fp Kadar mineral = x 100% Bobot sampel b) Pengujian fosfor (APHA 2005) Prinsip pengujian fosfor yaitu mengetahui nilai absorpsi logam fosfor dengan menggunakan metode Spektrofotometri. Sebanyak 2 gram sampel daging keong yang sudah dicacah dimasukkan ke dalam erlenmeyer 150 ml, kemudian ditambahkan 140 ml asam sitrat yang bertujuan melarutkan kandungan fosfor pada sampel, dipanaskan di atas hot plate lalu dinginkan. Setelah dingin ditambahkan ke dalam erlenmeyer asam peklorat 2 ml, hal ini bertujuan untuk menguapkan kandungan organik pada sampel lalu panaskan di atas hot plate dan didinginkan. Setelah dingin tambahkan 25 ml pereaksi vanadat molibdat ke dalam larutan sampel kemudian dilakukan pengenceran dengan akuades menjadi 100 ml dalam labu takar lalu larutan disaring dengan kertas saring hatman sampai didapatkan larutan yang jernih. Selanjutnya sampel didiamkan selama 10 menit. Sejumlah larutan stok standar dari mineral fosfor diencerkan dengan akuades sampai konsentrasinya berada dalam kisaran kerja logam yang diinginkan. Larutan standar, blanko dan contoh diukur ke alat spektrofotometer dengan panjang gelombang 660 nm. Perhitungan kadar mineral (mg/kg) basis basah fp = Faktor pengencer ppm terbaca x fp Kadar mineral = x 100% Bobot sampel
5) Analisis kelarutan mineral (Santoso 2003 modifikasi pelarut air) Analisis kelarutan mineral diuji pada mineral kalsium, natrium, magnesium dan fosfor. Sebanyak 10 gram sampel yang telah diberi perlakuan pengolahan dan kontrol dihomogenkan terlebih dahulu dengan 40 ml akuades lalu dihomogenisasi pada kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit untuk fraksi terlarut. Sampel yang sudah homogen, disentrifugasi dengan kecepatan 7.000 rpm, 4 o C selama 10 menit. Hasil dari sentrifugasi yang terdiri dari supernatan (filtrat) dan natan (residu). Supernatan dipipet lalu dipindahkan ke dalam botol film selanjutnya disaring menggunakan kertas saring hatman. Supernatan diukur sebagai mineral terlarut menggunakan Atomic Absorption Spectrophotometer (AAS) merk Perkin Elmer AAnalyst 100 (natrium, kalsium dan magnesium) dan spektrofotometer (fosfor) dihitung sebagai persentase terhadap kelarutan mineral. Perhitungan kelarutan mineral (%) kelarutan mineral % Kelarutan = x 100% kandungan mineral