Transformasi Artemisia cina dan Artemisia annua dengan Agrobacterium rhizogenes

Transformasi Artemisia cina dan Artemisia annua dengan Agrobacterium rhizogenes Tri Muji Ermayanti 1 *, E. Al Hafiizh 1, S. Rahmawati 1, Aryanti 2 1 Pusat Penelitian Bioteknologi-LIPI, Jl. Raya Bogor KM 46,Cibinong-Bogor 16911 2 Pusat Aplikasi dan Teknologi Isotop dan Radiasi-BATAN Abstrak Artemisia cina dan A. annua adalah dua jenis tanaman yang berkhasiat sebagai obat. Kedua jenis tanaman ini mempunyai beberapa senyawa bioaktif penting yang diproduksi di akar dan diakumulasikan pada bagian daun atau bunga tanaman. Kultur akar merupakan salah satu teknik untuk memproduksi senyawa bioaktif yang terdapat pada akar secara in vitro. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperoleh akar rambut baik dari tanaman A. cina dan A. annua dengan transformasi beberapa galur A. rhizogenes. Transformasi dilakukan terhadap daun, batang maupun tangkai daun dari tanaman in vitro. Sebanyak 10 galur bakteri diinfeksikan terhadap daun dan batang A. cina. Pada A. annua dipergunakan 9 galur bakteri untuk diinfeksikan terhadap batang, tangkai daun dan daun. Morfologi akar rambut diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya dan SEM. Konfirmasi adanya transformasi dilakukan dengan analisis PCR, dan stabilitas genetiknya diamati dengan menghitung jumlah kromosom di-ploidnya. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada A. cina dan A. annua frekuensi terjadinya transformasi sangat bervariasi tergantung dari galur bakteri dan tipe eksplan yang dipergunakan. Pada A. cina galur bakteri ATCC- 8196 merupakan galur bakteri yang mempunyai frekuensi transformasi tertinggi (100%) terhadap daun, sedangkan galur R-1000 merupakan galur terbaik untuk transformasi batang. Sedangkan pada A. annua, Agrobacterium galur 509 memperlihatkan frekuensi transformasi yang tertinggi terhadap tangkai daun dan batang, sedangkan bakteri galur ATCC-15834 mempunyai frekuensi transformasi yang tertinggi terhadap helai daun dibandingkan galur bakteri lainnya. Analisis PCR menunjukkan bahwa Tl-DNA terdeteksi pada beberapa klon akar, sedangkan analisis kromosom menunjukkan bahwa stabilitas jumlah kromosom diploid tergantung pada klon akar rambut yang dihasilkan dari transformasi galur bakteri yang berbeda dan tergantung juga pada media tempat tumbuh akar. *Correspondence to: Dr. Tri Muji Ermayanti Tel: +62 21 8754587; Fax: +62 21 8754588 Email: tmermayanti@hotmail.com Perbedaan morfologi, stabilitas genetik dan pertumbuhan klon akar kemungkinan sangat berhubungan erat dengan produkksi metabolit sekunder yang terkandung pada akar dari kedua jenis tanaman ini. Kata kunci: Artemisia cina, A. annua, Agrobacterium rhizogenes, Transformasi, Akar rambut. PENDAHULUAN Artemisia cina dan A. annua adalah dua jenis tanaman yang mengandung beberapa senyawa kimia penting seperti alkaloid, flavonoid, polifenol, santonin, resin, minyak atsiri, artemisinin, dan beberapa senyawa lain yang berkhasiat sebagai obat (Syamsuhidayat & Hutapea, 1991; Tan et al., 1998). Budidaya tanaman ini belum banyak dilakukan dan perbanyakan secara konvensional biasa dilakukan melalui stek anakan (untuk A. cina) atau melalui biji (untuk A. annua). Pada kedua jenis tanaman ini beberapa senyawa bioaktif penting diproduksi di akar dan diakumulasikan pada bagian daun atau bunga tanaman. Kultur akar merupakan salah satu teknik untuk memproduksi senyawa bioaktif yang terdapat pada akar secara in vitro (Bajaj & Ishimaru, 1999). Kultur akar rambut telah banyak dikembangkan selain untuk studi biosintesis senyawa-senyawa metabolit sekunder dan produksinya secara in vitro (Ermayanti, 1999; Saito et al., 2001). Akar rambut secara umum dihasilkan setelah transformasi antara eksplan tanaman dengan bakteri tanah Agrobacterium rhizogenes (Parr & Hamill, 1987). Tujuan dari penelitian ini adalah untuk memperoleh akar rambut baik dari tanaman A. cina dan A. annua dengan transformasi beberapa galur Agrobacterium. Transformasi dilakukan dengan cara menginfeksi daun, batang, maupun tangkai daun dari tanaman yang telah dikulturkan pada media MS padat. Untuk mengetahui frekuensi transformasi antara sel tanaman dan bakteri, beberapa galur bakteri diinfeksikan terhadap berbagai jenis eksplan. Morfologi akar rambut diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya, dan secara rinci diamati dengan menggunakan scanning electron microscopy (SEM). Transformasi Artemisia cina dan Artemisia annua dengan Agrobacterium rhizogenes 1

Konfirmasi adanya transformasi dilakukan dengan analisis PCR, selain itu stabilitas genetiknya juga diamati dengan menghitung jumlah kromosom diploidnya. Perbedaan morfologi, stabilitas genetik dan pertumbuhan klon akar kemungkinan sangat berhubungan erat dengan produkksi metabolit sekunder yang terkandung pada akar dari kedua jenis tanaman ini. METODOLOGI Transformasi tanaman dengan beberapa galur Agrobacterium: transformasi dilakukan dengan cara menginfeksikan suspensi beberapa galur Agrobacterium terhadap eksplan batang dan daun A. annua. Agrobacterium rhizogenes galur A4, MAFF-1724, 8196, 07-20001 dan ATCC-15834, dan Agrobacterium tumefaciens galur R-1000 dipergunakan dalam penelitian ini. Bakteri dikulturkan pada media padat LB (Gelvin et al., 1988) (untuk galur 8196, R-1000 dan MAFF-1724) atau media YMB (Gelvin et al., 1988) (untuk galur A4, 07-20001 dan ATCC-15834) pada 27 o C selama 2-3 hari, kemudian kultur dipindahkan pada media cair selama 1 malam sebelum ditransformasikan terhadap eksplan. Transformasi dilakukan dengan cara melukai daun (helai daun) dan batang A. cina serta batang, tangkai daun dan daun (helai daun) A. annua dengan menggunakan ujung skalpel yang telah dicelupkan pada suspensi bakteri. Eksplan kemudian dikulturkan pada media MS (Murashige & Skoog, 1962) padat dan disimpan di dalam ruang kultur dalam keadaan gelap. Setelah 2-3 hari, bakteri yang tumbuh pada eksplan dihilangkan dengan cara mencuci eksplan pada larutan yang mengandung antibiotik sefotaksim (100-200 mg/l). Pencucian diulangi beberapa kali sampai bakteri tidak tumbuh lagi pada media kultur. Setelah 2-3 minggu akar rambut yang terbentuk pada bagian eksplan yang terinfeksi dipisahkan untuk ditanam pada media baru. Konfirmasi terjadinya transformasi: isolasi DNA plasmid Agrobacterium dilakukan menurut metode Sambrook et al. (1989). Agrobacterium ditanam pada media cair LB atau YMB (tergantung dari galur bakterinya) selama 2 malam pada suhu 28 o C. Kemudian sel dikoleksi dengan cara sentrifugasi 8000 rpm selama 5 menit. Sel kemudian ditambah dengan 100 µl larutan I (25 mm Tris-Cl ph 8, 10 mm EDTA ph 8, 50 mm glukosa dan 2 mg/l lisozim) dicampur sampai semua sel tersuspensi dilanjutkan dengan inkubasi dalam keadaan dingin selama 10 menit. Selanjutnya ditambahkan 200 µl larutan II (0,25 M NaOH dan 1% SDS) dan tabung dibalik-balikkan, dilanjutkan lagi dengan inkubasi dingin selama 15 menit. Sampel kemudian ditambah dengan 150 µl NaOH ph 6,8, diinkubasikan lagi dalam keadaan dingin selama 15 menit dilanjutkan dengan sentrifugasi 10.000 rpm selama 10 menit pada suhu 4 o C. Setelah ditambahkan etanol, pelet DNA disimpan dalam larutan bufer TE ph 8 pada suhu 20 o C. Amplifikasi fragmen DNA dengan teknik PCR dilakukan mengikuti metode Hamill et al. (1991). Untuk deteksi bagian TL T-DNA dipergunakan pasangan primer rolb1 (5 ATGGATCCCAAATTGCTATTCCCCCACGA 3 ) dan rolb2 (5 TTAAGGCT TCTTTCATTCGGTTTACTGCAGC3 ) (Hamill et al., 1991), sedangkan untuk deteksi bagian TR T- DNA digunakan pasangan primer TR1 (5 GGAAATTGTGGCTCGTTGT GGAC3 ) dan TR2 (5 AATTCGTTCAGAGAGCGTCCGAAGTT3 ) (Aoki et al., 1997). Analisis PCR dilakukan terhadap beberapa sampel akar rambut untuk melihat adanya integrasi TL dan TR-DNA. Sebagai kontrol negatif dipergunakan sampel dari tanaman yang ditanam di rumah kaca, tunas dari tanaman in vitro dan akar nontransformasi. Sebagai kontrol positif digunakan DNA plasmid dari berbagai galur Agrobacterium. Pengamatan morfologi akar: morfologi akar rambut dan akar normat diamati dengan menggunakan mikroskop cahaya maupun Scanning Electron Microscopy (SEM) terhadap akar yang ditumbuhkan selama 1 minggu pada media MS padat. Ujung akar difoto dengan menggunakan mikroskop cahaya atau diberi perlakuan standar untuk pengamatan dengan menggunakan SEM. Penampakan rambut-rambut akar pada ujung akar rambut dan akar normal dibandingkan. Analisis kromosom: untuk mengetahui stabilitas atau variasi jumlah kromosom pada kedua tanaman, baik untuk akar rambut maupun akar normal, dilakukan penghitungan jumlah kromosom diploidnya dengan menggunakan metode dari Karp (1991). Penghitungan jumlah kromosom dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya terhadap sel-sel yang mempunyai penyebaran kromosom terbaik. Tidak dilakukan penghitungan terhadap sel-sel yang rusak dan kromosom yang tumpang tindih. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada A. cina dan A. annua frekuensi terjadinya transformasi sangat bervariasi tergantung dari galur bakteri yang dipergunakan. Pada A. cina galur bakteri A4 dan Ermayanti et al. 2

ATCC-8196 merupakan galur bakteri yang mempunyai frekuensi transformasi tertinggi (100%) terhadap eksplan daun, sedangkan galur R-1000 merupakan galur terbaik untuk transformasi eksplan batang (Tabel 1, Gambar 1). Galur bakteri 511 hanya mampu menginduksi akar dari eksplan daun, sedangkan galur bakteri 509, 510 dan MAFF-1724 tidak mampu menginduksi terbentuknya akar rambut dari eksplan daun maupun batang. Sedangkan pada A. annua, Agrobacterium galur 509 memperlihatkan frekuensi transformasi yang tertinggi terhadap eksplan tulang daun dan batang, sedangkan bakteri galur ATCC-15834 mempunyai frekuensi transformasi yang tertinggi dibandingkan galur bakteri lainnya. Galur bakteri 07-20001, ATCC-8196, MAFF- 1724 dan R1000 tidak mampu menghasilkan akar rambut dari 3 jenis eksplan yang dicobakan (Tabel 2). Tabel 1. Transformasi daun dan batang Artemisia cina dengan beberapa galur Agrobacterium. Galur Bakteri Jumlah eksplan yang ditransformasi Jumlah eksplan yang membentuk akar (%) Daun Batang Daun Batang Kontrol 10 10 0 0 15834 13 19 2 (15,4) 13 (68,4) 07-2001 13 23 12 (92,3) 8 (34,8) A4 20 24 19 (95) 18 (75) LBA-4404 17 10 12 (70,6) 6 (60) R-1000 10 9 4 (40) 9 (100) 8196 15 12 15 (100) 6 (50) 511 7 2 1 (14,3) 0 509 5 1 0 0 510 6 1 0 0 MAFF-1724 5 1 0 0 Tabel 2. Transformasi daun, tangkai daun dan batang Artemisia annua dengan beberapa galur Agrobacterium. Galur bakteri Jumlah eksplan yang membentuk akar Jumlah eksplan yang diinfeksi (%) Tangkai Tangkai Daun Batang Daun Batang daun daun Kontrol 11 7 4 4 (36,4) 1 (14,3) 0 07-20001 32 9 19 0 0 0 509 16 7 3 1 (6,25) 4 (57,1) 2 (66,7) 510 18 11 5 0 1 (9,1) 2 511 11 3 0 1 (9,1) 0 0 ATCC-15834 28 11 16 14 (50) 2 10 (62,5) A4 23 20 0 2 (8,7) 0 0 ATCC-8196 16 9 0 0 0 0 MAFF-1724 3 4 0 0 0 0 R-1000 14 8 0 0 0 0 Gambar 1. Akar rambut hasil transfromasi daun A. cina dengan bakteri galur R1000. Hasil analisis PCR menunjukkan adanya integrasi TL-DNA yang nampak dengan munculnya pita DNA pada posisi 0,78 kb, sedangkan adanya integrasi TR-DNA ditunjukkan dengan munculnya pita DNA pada posisi 1672 bp sesuai dengan posisi kedua fragmen DNA dari bakteri. Pada semua sampel dari tanaman yang ditanam di rumah kaca, tunas tanaman in vitro, dan akar nontransformasi, sebagai Transformasi Artemisia cina dan Artemisia annua dengan Agrobacterium rhizogenes 3

kontrol negatif, tidak ditemukan adanya pita DNA pada posisi tersebut di atas. Plasmid DNA bakteri galur A4 dan ATCC 15834 menunjukkan adanya kedua pita yang mempunyai posisi TL dan TR- DNA, namun galur 07-20001 belum memperlihatkan pita DNA yang menunjukkan adanya bagian TL maupun TR-DNA (Gambar 2). Gambar 2. Amplifikasi fragmen TL-DNA (Gambar 2A) dan TR-DNA (Gambar 2B) pada beberapa sampel tanaman, akar dan akar rambut. Baris 1-3 : tiga klon akar rambut dari bakteri galur 07-20001 Baris 4 : akar rambut dari galur ATCC 15834 Baris 5 : akar rambut dari galur A4 Baris 6 : blanko Baris 7 : daun tanaman yang ditanam di rumah kaca Baris 8 : daun tanaman in vitro Baris 9 : akar dari tanaman in vitro Baris 10 : DNA plasmid bakteri galur 07-20001 Baris 11 : DNA plasmid bakteri galur A4 Baris 12 : DNA plasmid bakteri galur ATCC 15834 Baris 13 : marker HindIII Sampel hasil transformasi yang sudah dianalisis adalah 3 klon akar rambut dari galur 07-20001 yang menunjukkan adanya integrasi TL-DNA, satu klon akar rambut dari galur A4 dan satu klon akar rambut dari galur ATCC-15834 yang keduanya juga menunjukkan adanya integrasi TL-DNA. Tidak satupun dari akar rambut dari ketiga galur bakteri yang dianalisis menunjukkan adanya integrasi TR-DNA. Tunas dari A. cina dan A. annua yang tumbuh secara in vitro mempunyai morfologi bentuk dan ukuran daun serta percabangan yang berbeda-beda. Pada A. cina planlet yang sudah diaklimatisasi menunjukkan pertumbuhan yang normal kembali. Bentuk daun yang berbeda pada tunas yang tumbuh secara in vitro berubah menjadi bentuk semula sama dengan tanaman induknya. Pada A. annua morfologi berdasarkan bentuk daun, ukuran daun, dan percabangan tunas dapat dikelompokkan menjadi 5 kategori yang berbeda. Belum dilakukan aklimatisasi terhadap planlet A. annua sehingga belum diketahui apakah morfologi tunas in vitro yang berbeda dengan induknya akan berubah kembali ke bentuk aslinya. Analisis kandungan zat bioaktif perlu dilakukan untuk mengetahui korelasi antara morfologi tunas yang berbeda dengan kandungan zat bioaktif yang dihasilkan. Hasil penghitungan jumlah kromosom diploid akar menunjukkan bahwa stabilitas dan variasi jumlah kromosom pada kedua spesies ini tergantung pada jenis media tempat tumbuh akar dan galur bakteri yang dipergunakan untuk transformasi. Secara umum akar rambut dari A. cina hasil transformasi dengan beberapa galur bakteri mempunyai jumlah kromosom yang lebih bervariasi dibandingkan dengan akar rambut A. annua. Pada akar rambut A. cina jumlah kromosom yang stabil (2n = 32) berkisar antara 40,4-60,5%, sedangkan pada A. annua stabilitas kromosom (2n = 18) berkisar antara 41,2-93,8%. Pada A. cina, penambahan IBA pada media mempengaruhi variasi jumlah kromosom. Variasi dan stabilitas jumlah kromosom ini kemungkinan berhubungan juga dengan kandungan zat bioaktif yang dihasilkan oleh klon-klon akar rambut tersebut. KESIMPULAN Jenis eksplan dan galur bakteri menentukan frekuensi keberhasilan transformasi pada A. cina dan A. annua. Deteksi adanya pita Tl- dan Tr-DNA pada akar rambut diperlukan unutuk konfirmasi terjadinya transformasi antara bakteri terhadap sel tanaman. Pengamatan morfologi tunas menunjukkan bahwa perbedaan morfologi pada A. cina bersifat tidak permanen, planlet yang telah diaklimatisasi dalam perkembangannya mempunyai morfologi yang sama dengan tanaman asalnya. Stabilitas dan variasi jumlah kromosom diploid pada akar rambut kedua jenis tanaman ini berbeda nyata tergantung dari media tempat tumbuh akar, galur bakteri dan eksplan yang dipergunakan untuk transformasi. Ucapan Terimakasih Penulis mengucapkan terimakasih kepada Adelina, S.T. atas bantuannya dalam mengerjakan isolasi DNA dan konfirmasi terjadinya transformasi dan Laela Sari, S.Si. atas bantuannya dalam Ermayanti et al. 4

mempersiapkan kultur tunas untuk bahan percobaan transformasi. Ucapan terimakasih juga ditujukan kepada Dra. Endang Purwaningsih dari Puslit Biologi-LIPI atas bantuannya pada persiapan dan pengamatan SEM, Dyah R. Wulandari, S.Si. dan Oktavia Yanti, SSi. atas bantuannya dalam persiapan dan pengamatan kromosom. Penelitian ini didanai oleh proyek RUT VIII No. kontrak 011.60/SK/RUT/2001 dan 097.63/SK/RUT/2002. Daftar Pustaka Aoki T, Matsumoto H, Asako Y, Matsunaga Y, Shimomura K (1997). Variation of alkaloid productivity among several clones of hairy roots and regenerated plants of Atropa belladona transformed with Agrobacterium rhizogenes 15834. Plant Cell Reports. 16 : 282-286. Bajaj YPS, Ishimaru K (1999). Genetic transformation of medicinal plants. In : Bajaj, Y.P.S. (Ed). Biotechnology in Agriculture and Forestry. 45. Transgenic Medicinal Plant. Springer. Pp : 1-29. Ermayanti TM (1999). Genetic transformation of Swainsona gelegifolia (Darling Pea). In: Bajaj, Y.P.S. (Ed). Biotechnology in Agriculture and Forestry. 45. Transgenic Medicinal Plant. Springer. Pp :328-335. Gelvin SB, Schilperoort RA, Verma DPS (1988). Plant Molecular Biology. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht. Hamill JD, Rounsley S, Spenser A, Todd G, Rhodes MJC (1991). The use of the polymerase chain reaction in plant transformation studies. Plant Cell Reports. 10 : 221-224. Murashige T, Skoog F (1962). A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum. 15 : 473-497. Parr AJ, Hamill JD (1987). Relationship between Agrobacterium rhizogenes transformed hairy roots and intact, uninfected Nicotiana plants. Phytochemistry. 26 : 3241-3245. Saito K, Sudo H, Yamazaki M, Koseki-Nakamura M, Kitajima M, Takayama H, Aimi N (2001). Feasible production of camptothecin by hairy root culture of Ophiorrhiza pumila. Plant cell Reports. 20 : 267-271. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T (1989). Molecular Cloning, a Laboratory Manual. 2 nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press. Syamsuhidayat SS, Hutapea JR (1991). Artemisia cina Berg. Inventarisasi Tanaman Obat Indonesia, I. Balai Penelitian dan Pengembangan Kesehatan. Departemen Kesehatan. Tan RX, Zheng WF, Thang, HQ (1998). Biological active substances from genus Artemisia. Planta Medica. 64 : 295-302. Transformasi Artemisia cina dan Artemisia annua dengan Agrobacterium rhizogenes 5