PENYISIPAN GEN FITASE PADA TEBU (Saccharum officinarum) VARIETAS PS 851 DAN PA 198 DENGAN PERANTARA Agrobacterium tumefaciens GV 2260

Transkripsi

1 PENYISIPAN GEN FITASE PADA TEBU (Saccharum officinarum) VARIETAS PS 851 DAN PA 198 DENGAN PERANTARA Agrobacterium tumefaciens GV 2260 ADE NENA NURHASANAH SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2007

2 Penyisipan Gen Fitase Pada Tebu (Saccharum officinarum) Varietas PS 851 dan PA 198 Dengan Perantara Agrobacterium tumefaciens GV 2260 ABSTRAK ADE NENA NURHASANAH. Penyisipan Gen Fitase pada Tebu (Saccharum officinarum) PS 851 dan PA 198 Dengan Perantara Agrobacterium tumefaciens GV Dibimbing oleh AGUS PURWITO dan DWI ANDREAS SANTOSA. Fitase mampu mengkatalisis hidrolisis senyawa fitat (myo-inositol hexakisphosphate) menjadi myo-inositol dan fosfat inorganik. Fitat merupakan bentuk penyimpanan fosfat yang paling banyak dalam tanah dan tanaman dan tidak dapat dimanfaatkan oleh tanaman. Transfromasi pada tebu (Saccharum officinarum) dengan gen fitase diharapkan mampu meningkatkan penggunaan P oleh tanaman dan meningkatkan hasil. Regenerasi merupakan tahapan penting dalam transformasi. PS 851 and PA 198 menunjukan pertumbuhan tunas dan daun yang baik pada media MS dengan penambahan 1 ppm NAA + 1 ppm BAP. Media terbaik untuk induksi dan pertumbuhan akar PS 851 adalah media MS dengan penambahan auksin 0.5 ppm NAA ppm IBA dan arang aktif, sedangkan untuk PA 198 pada media MS dengan auksin 0.2 ppm NAA ppm IBA dan arang aktif. Transformasi ini dilakukan pada kalus embriogenik tebu dengan metode modifikasi Santosa (2004). PS 851 menghasilkan sekitar 140 kalus yang dapat tumbuh pada media seleksi, sementara PA 198 hanya 20 kalus. Regenerasi kalus PS 851 yang telah ditransfromasi tumbuh menjadi planlet sekitar 129 dan hanya 105 planlet yang dapat dipindah ke media tanah. Beberapa tanaman transforman tersebut memiliki aktifitas fitase yang tinggi dibanding dengan tanaman nontransforman. Gen fitase terdeteksi pada klon PST dengan menggunakan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction). Key word: Sugarcane, phytase, tranformation, Agrobacterium tumefaciens

3 DAFTAR ISI Halaman DAFTAR ISI... iii DAFTAR TABEL... iv DAFTAR GAMBAR... v DAFTAR LAMPIRAN... vi PENDAHULUAN... 1 TINJAUAN PUSTAKA TanamanTebu... 3 Gen Fiatse... 4 Agrobacterium tumefaciens... 6 Vektor Plasmid... 9 Kultur in-vitro Analisis Molekuler BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Pelaksanaan Bahan dan Alat Metode Penelitian Sterilisasi Eksplan Percobaan 1. Regenerasi Tebu Optimasi Media Tunas Optimasi Media Akar Percobaan 2. Transformasi Tebu Uji Aktifitas Enzim Fitase Isolasi Total DNA dan Analisis PCR HASIL DAN PEMBAHASAN Sterilisasi Eksplan Percobaan 1. Regenerasi Kalus Optimasi Media tunas Optimasi Media Akar Percobaan 2. Transformasi Kalus Tebu Uji Aktifitas Fitase Analisis PCR... 34

4 SIMPULAN DAN SARAN DAFTAR PUSTAKA LAMPIRAN... 41

5 DAFTAR TABEL No. Halaman 1. Rata-rata jumlah tunas kultur in- vitro tebu varietas PS 851 pada minggu ke-3 sampai minggu ke Rata-rata jumlah tunas kultur in- vitro tebu varietas PA198 pada minggu ke-3 sampai minggu ke Rata-rata jumlah daun kultur in- vitro tebu varietas PS 851 pada minggu ke-3 sampai minggu ke Rata-rata jumlah daun kultur in-vitro tebu varietas PA198 pada minggu ke-3 sampai minggu ke Rata-rata jumlah akar kultur in-vitro tebu varietas PS Rata-rata panjang (cm) akar kultur in-vitro tebu varietas PS Rata-rata jumlah akar kultur in-vitro tebu varietas PA Rata-rata Panjang (cm) akar kultur in- vitro tebu varietas PA Hasil transformasi tebu dengan gen fitase Hasil uji aktifitas fitase tebu transforman dan nontransforman 33

6 DAFTAR LAMPIRAN No. Halaman 1. Komposisi Media LB Komposisi Media MS untuk Induksi Kalus dan Regenerasi Komposisi Media Transformasi Metode Modifikasi... 43

7 PENDAHULUAN Latar belakang Tebu merupakan salah satu komoditas penting pada bidang perkebunan di wilayah tropis dan subtropis termasuk Indonesia. Hampir sekitar 65% produksi gula di dunia berasal dari tebu. Selain untuk produksi gula, tebu juga dapat dimanfaatkan untuk industri farmasi, industri pangan, industri lain yang menggunakan bahan dari hasil industri gula seperti untuk pakan ternak, pabrik kertas dan sebagai bahan baku produksi biofuel (etanol). Prospek pasar gula di Indonesia cukup baik karena permintaan gula dalam negeri cukup tinggi. Hal ini dapat diketahui dari semakin tingginya impor gula yang dilakukan pemerintah. Meskipun produksi gula nasional mengalami peningkatan pada tahun terakhir yaitu dari 1.63 juta ton pada tahu 2003 menjadi 2.01 juta ton hingga akhir giling 2004 namun produksi tersebut tidak mampu mencukupi kebutuhan gula nasional sekitar 3.4 juta ton (Wiliarto, 2005). Adanya ketidakseimbangan antara konsumsi dan produksi gula disebabkan oleh rendahnya produktifitas tebu dan ketidakefisienan industri gula nasional serta peningkatan jumlah penduduk yang mengkonsumsi gula. Akibat lain dari peningkatan jumlah penduduk adalah terjadinya pergeseran pertanaman tebu dan pertanaman lainnya. Penanaman tebu pada lahan yang produktifitasnya rendah menimbulkan ketidakefisienan pemupukan terutama P. P yang diberikan pada tanaman biasanya tidak semuanya diserap dan digunakan dalam proses metabolisme. Beberapa bagian P tersebut akan disimpan dalam bentuk P organik (senyawa fitat). Dan jika pemupukan P terjadi secara berlebiham maka akumulasi senyawa fitat pun akan tinggi sehingga tanah tidak mampu lagi menyediakan P untuk diserap tanaman. Penggunaan varietas yang efisien dalam pemanfaatan P dapat dilakukan agar produktifitas tebu tinggi meskipun ditanam pada lahan yang relatif miskin hara P. Perakitan varietas secara konvensional melalui program persilangan telah banyak dilakukan. Namun hasil yang diperoleh sulit untuk diperkirakan dan waktu yang dibutuhkan untuk memperoleh hasil silangan cukup lama. Proses perakitan lain yang dapat dilakukan adalah penyisipan gen asing yang berguna ke

8 2 dalam sel tanaman. Pada tanaman tebu, dengan proses ini diharapkan gen yang disisipkan tersebut terekspresi sehingga diperoleh varietas baru dengan produktifitas tinggi dan mampu meningkatkan bobot tebu dan rendemen gula. Fitase merupakan suatu enzim yang mampu merombak fitat senyawa organik yang menyimpan unsur fosfat dalam sel tanaman menjadi ester yang berfosfat rendah dan melepaskan unsur fosfat inorganik. Unsur tersebut dapat dimanfaatkan tanaman untuk sintesis klorofil sehingga dapat meningkatkan fotosintesis dan metabolisme dalam tanaman yang secara tidak langsung dapat meningkatkan rendemen tebu. Fitase juga mampu meningkatkan ketersediaan hara mineral lain di dalam jaringan tanaman. Jika fitase dilepaskan ke lingkungan perakaran, akan terjadi peningkatan persediaan hara mineral di perakaran dan tanaman menjadi lebih efisien dalam pemanfaatan pupuk. Proses transfer fitase ke dalam tanaman tebu dilakukan secara tidak langsung dengan menggunakan Agrobacterium tumefaciens. Telah banyak diketahui strain dari Agrobacterium tumefaciens yang dapat digunakan untuk memasukkan gen tunggal yang ada pada T-DNA dari plasmid Ti menuju genom tanaman. Cara ini banyak dilakukan karena tingkat keberhasilan dan kestabilan gen yang tinggi. Dalam proses transformasi genetik penumbuhan jaringan tanaman tebu secara in-vitro untuk memperoleh kalus merupakan hal yang penting. Dalam metode kultur in-vitro ini terdapat beberapa hal yang perlu diperhatikan diantaranya komposisi media tumbuh, eksplan (genotipe tanaman) dan perimbangan zat pengatur tumbuh. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan tebu transforman yang mengandung gen fitase dan mendapatkan media yang sesuai untuk regenerasi tebu baik yang transforman ataupun tidak transforman.

9 TINJAUAN PUSTAKA Tanaman Tebu Tebu (Saccharum officinarum) diduga berasal dari Papua Nugini. Budidaya tebu pertama kali dilakukan di India dan kemudian menyebar ke China, Arab dan Eropa. Selanjutnya tebu yang termasuk famili Gramineae ini dibudidayakan sebagai tanaman budidaya komersial di hampir 60 negara yang menyebar luas di lima benua. Tebu merupakan bahan baku penting dan mendukung pertumbuhan produksi gula, alkohol, furfural dextrans dan lainnya. Beberapa senyawa farmasi alami berasal dari tebu, selain itu bidang pertanian dan industri yang membutuhkan produk dari proses produksi gula juga sering memanfaatkan tebu misalnya untuk pakan ternak, pembuatan makanan, produksi kertas dan bahan bakar (Gustavo et al., 1998). Produktifitas tanaman tebu tergantung pada rendemen yang akan diolah menjadi gula atau produk lainnya. Rendemen ini merupakan glukosa yang dihasilkan dari proses fotosintesis di daun dan ditranslokasikan ke seluruh bagian batang tebu (Wiliarto, 2005). Peningkatan rendemen ini dapat dilakukan melalui pemanfaatan teknologi dalam budidaya tanaman dan penggunaan bibit yang baik. Sementara itu, ploidi tebu yang tinggi (2n = ), fertilitas yang rendah, luasnya interaksi genotipe tanaman dengan lingkungan membuat pemuliaan tradisional dan penelitian genetik menjadi sulit (Gallo-Meagher dan Irvine, 1996). Kultivar tebu komersial, hibrida poliploidi yang kompleks, merupakan tanaman utama yang banyak terdapat di wilayah tropis (Blanco et al., 1997). Sebenarnya teknik pemuliaan tanaman tradisional, bersamaan dengan pendekatan bioteknologi klasik secara ekstensif telah digunakan untuk meningkatkan produksi tanaman dengan menyeleksi varietas yang telah diperbaiki yang lebih produktif dan resisten terhadap hama dan penyakit (Gustavo et al. 1998). PS 851 merupakan varietas unggul merupakan hasil persilangan antara PS 57 (varietas unggul yang dilepas P3GI tahun 1985) dengan B (varietas introduksi dari Barbados, Amerika Latin). PS 851 mempunyai perkecambahan baik dengan sifat pertumbuhan awal dan pembentukan tunas yang serempak,

10 4 berbatang tegak, diameter sedang, berbunga jarang, kadar sabut sekitar 14%. Daun tua mudah lepas dan tanaman tegak memberikan tingkat potensi rendemen tinggi. Kondisi tanah subur dengan kecukupan air sangat membantu pertumbuhan pemanjangan batang yang normal (Sugiyarta, 5 Januari 2007, komunikasi pribadi). Teknik perbanyakan tanaman secara aseksual merupakan suatu pendekatan yang mempunyai potensi dalam memanipulasi sistem tanaman pada tingkat sel. Beberapa spesies merespon terhadap satu atau lebih dari pendekatan-pendekatan ini, sementara tanaman lain, termasuk tebu, lebih sulit (Heinz et al., 1977). Selain itu tebu mempunyai karakteristik monokotil yang menarik untuk proses perbaikan sifat melalui transformasi genetik. Pada awal perkembangannya, gen yang ditransfer ke dalam tanaman adalah gen-gen yang berfungsi dalam teknik transfer atau memiliki kemampuan sebagai sekuen pengendali (promotor) dalam mengendalikan ekspresi suatu gen di dalam sel tanaman. Dalam perkembangannya selanjutnya, gen yang ditransfer adalah gen-gen yang mengendalikan karakter-karakter yang mempunyai nilai ekonomi tinggi pada tanaman (Aswidinoor, 1990). Perkembangan sistem transfer gen ini akan sangat mendukung usaha untuk mengintroduksi gen agronomik yang penting sehingga menghasilkan kultivar tebu yang unggul (Gallo-Meagher dan Irvine, 1996). Gen Fitase Gen fitase yang akan disisipkan ke dalam tanaman tebu merupakan gen yang menghasilkan enzim fitase. Enzim ini secara alamiah dapat ditemukan dalam tanaman dan mikroorganisme, khususnya fungi. Peranan fitase dalam setiap organisme berbeda-beda. Di dalam tanaman, fitase terinduksi selama perkecambahan untuk membantu pertumbuhan benih dengan Pi dan tanaman dengan myo-inosotol bebas, yang merupakan faktor penting untuk pertumbuhan. Fitase mampu mengkatalisis hidrolisis monoester fosfat dari asam fitat (myoinositol heksa fosfat) (Wyss et al., 1999). Hidrolisis fitat oleh fitase akan menghasilkan myo-inositol fosfat yang rendah dan fosfat in-organik (Andrea et al., 2000). Hidrolisis fosfomonoester dalam sistem biologi merupakan proses