LAMPIRAN. Lampiran 1. Sequence primer ISSR yang digunakan

Transkripsi

1 65 LAMPIRAN Lampiran 1. Sequence primer ISSR yang digunakan Tabel Sequence primer ISSR yang digunakan No Primer Sequence primer Tm 1 SBLT 2 (AG)8T 52 2 SBLT 3 (AG)8C 50 3 SBLT 5 (GA)8C 53 4 SBLT 8 (CT)8G 52 5 SBLT 13 (GAA)6 50

2 66 6 SBLT 14 (GACA) SBLT 15 (GA) SBLT 17 (TG)8G 52 9 SBLT 18 (CCCT) SBLT 19 (GATA)2(GACA)2 51 Lampiran 2. Tahapan isolasi DNA genom daun tanaman sambiloto Tahapan isolasi DNA genom tanaman sambiloto adalah: daun dibersihkan dari kotoran yang menempel dan ditimbang sebanyak 200 mg. Daun yang telah ditimbang dimasukkan dalam mortal dan dipotong kecil-kecil kemudian ditambahkan 1% PVPP sebanyak 100 µl, larutan 2% merkaptoetanol hangat sebanyak 100 µl dan bufer ekstraksi sebanyak 250 µl. Daun tersebut ditumbuk

3 67 sampai halus menggunakan pestle sampai membentuk pasta. Kemudian pasta daun dimasukkan dalam tabung mikrotube 1,5 ml dan ditambahkan bufer ekstraksi sebanyak 250 µl. Larutan DNA divortex dan diinkubasi selama 30 menit dalam waterbath suhu 60 o C. Larutan ditambahkan larutan CIAA dengan perbandingan 24:1 sebanyak 500 µl. Tabung dibolak balik selama 15 menit dan kemudian disentrifugasi pada kecepatan 800 rpm selama 10 menit pada suhu 25 o C. Supernatan yang didapatan dipindahkan pada tabung mikrotube baru dan ditambahkan larutan 5M NaCl sebanyak 250 µl sambil dibolak balik perlahanlahan. Supernatan ditambahkan larutan isopropanol dingin sebanyak 0,6 volume supernatan dan dibolak balik perlahan-lahan. Larutan tersebut kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 60 menit. Setelah itu larutan disentrifugasi dengan kecepatan rpm selama 10 menit pada suhu 25 o C. Supernatan dibuang dan pelet yang didapatkan dicuci dengan menggunakan 80% etanol dingin sebanyak 200 µl dan dibolak balik perlahan. Supernatan dibuang dan pelet DNA dikeringkan dengan membalikkan tutup mikotube pada kertas tissu sampai tidak tercium bau etanol. Pelet ditambahkan larutan Tris-EDTA (TE) sebanyak 100 µl kemudian dihomogenkan. Larutan DNA ditambahkan 1 µl RNAse kemudian diinkubasi dalam waterbath suhu 37 o C selama 30 menit. Larutan ditambahkan larutan CIAA (24:1/v:v) dengan volume yang sama dan dibolak balik tabung perlahan-lahan. Larutan disentrifugasi 8000 rpm selama 10 menit pada suhu 25 o C. Supernatan dipindah pada tabung mikrotube baru dan ditambahkan isopropanol dingin dengan volume yang sama kemudian diinkubasi pada suhu -20 o C selama semalam (overnight). Larutan disentrifugasi rpm selama 10 menit pada suhu 25 o C. Supernatan dibuang dan pelet DNA yang didapat dikeringkan kemudian dilarutkan dalam larutan TE sebanyak 20 µl. Lampiran 3. Analisa variasi (ANOVA) pada mutan tanaman sambiloto generasi M1V0-M1V3 1. ANOVA mutan generasi M1V0 Analysis of Variance for tinggi, using Adjusted SS for Tests Dosis Error Total

4 68 Analysis of Variance for daun, using Adjusted SS for Tests Dosis Error Total Analysis of Variance for pdaun, using Adjusted SS for Tests Dosis Error Total Analysis of Variance for ldaun, using Adjusted SS for Tests Dosis Error Total Analysis of Variance for Nodus, using Adjusted SS for Tests Dosis Error Total ANOVA mutan generasi M1V1 Analysis of Variance for tinggi, using Adjusted SS for Tests dosis Error Total Analysis of Variance for daun, using Adjusted SS for Tests

5 69 dosis Error Total Analysis of Variance for pdaun, using Adjusted SS for Tests dosis Error Total Analysis of Variance for ldaun, using Adjusted SS for Tests dosis Error Total Analysis of Variance for Nodus, using Adjusted SS for Tests dosis Error Total Analysis of Variance for cabang, using Adjusted SS for Tests dosis Error Total ANOVA mutan generasi M1V2 Analysis of Variance for tinggi, using Adjusted SS for Tests dosis Error Total Analysis of Variance for daun, using Adjusted SS for Tests

6 70 dosis Error Total Analysis of Variance for pdaun, using Adjusted SS for Tests dosis Error Total Analysis of Variance for ldaun, using Adjusted SS for Tests dosis Error Total Analysis of Variance for Nodus, using Adjusted SS for Tests dosis Error Total Analysis of Variance for cabang, using Adjusted SS for Tests dosis Error Total ANOVA mutan generasi M1V3 Analysis of Variance for tinggi, using Adjusted SS for Tests dosis Error Total Analysis of Variance for daun, using Adjusted SS for Tests

7 71 dosis Error Total Analysis of Variance for pdaun, using Adjusted SS for Tests dosis Error Total Analysis of Variance for ldaun, using Adjusted SS for Tests dosis Error Total Analysis of Variance for Nodus, using Adjusted SS for Tests dosis Error Total Analysis of Variance for jcabang, using Adjusted SS for Tests dosis Error Total Lampiran 4. Data pertumbuhan tanaman sambiloto hasil irradiasi secara ex vitro

8 Lampiran 5. Data kuantitatif dan kemurnian DNA genom mutan sambiloto 72

9 73

10 Lampiran 6. Data biner pola pita pada 32 mutan sambiloto dengan 5 primer ISSR 74

11 Lampiran 7. Jarak genetik 32 mutan tanaman sambiloto hasil irradiasi 75

12 76 Lampiran 8. Data standarisasi andrographolide dan waktu retensi mutan pada HPLC Regresi Linier standar andrographolide ppm Retention Time Area % Area Height Waktu retensi mutan sambiloto 1. Kontrol (DN) Retention Time Area % Area Height Mutan DB60 Retention Time Area % Area Height Mutan DG70 Retention Time Area % Area Height

13 77 4. Mutan DG275 Retention Time Area % Area Height Mutan DK300 Retention Time Area % Area Height