REKAYASA GENETIK PADA TANAMAN KENTANG (Solanum tuberosum) KULTIVAR DIAMANT DENGAN GEN Hd3a DIBAWAH KENDALI PROMOTER 35SCaMV ANNISA NURRIZKY

Transkripsi

1 i REKAYASA GENETIK PADA TANAMAN KENTANG (Solanum tuberosum) KULTIVAR DIAMANT DENGAN GEN Hd3a DIBAWAH KENDALI PROMOTER 35SCaMV ANNISA NURRIZKY DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015

2 ii

3 iii PERNYATAAN MENGENAI SKRIPSI DAN SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA Dengan ini saya menyatakan bahwa skripsi berjudul Rekayasa genetik pada tanaman kentang (Solanum tuberosum) kultivar Diamant dengan gen Hd3a di bawah kendali promoter 35SCaMV adalah benar karya saya bersama dengan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir karya ilmiah ini. Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut Pertanian Bogor. Bogor, Februari 2015 Annisa Nurrizky NIM G

4 2 ABSTRAK ANNISA NURRIZKY. Rekayasa genetik tanaman kentang (Solanum tuberosum) kultivar Diamant dengan gen Hd3a di bawah kendali promoter 35SCaMV. Dibimbing oleh SUHARSONO dan YOHANA C. SULISTYANINGSIH. Kentang merupakan salah satu tanaman hortikultura dan pangan yang penting di Indonesia karena mempunyai nilai ekonomis yang tinggi. Untuk tujuan pemuliaan konvensional dengan persilangan maka induksi pembungaan memegang peranan yang sangat penting. Pada beberapa spesies, Hd3a menginduksi pembungaan. Pada kentang kultivar Andigena, selain menginduksi pembungaan Hd3a menginduksi pembentukan umbi. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan rekayasa genetik kentang (Solanum tuberosum) kultivar Diamant dengan gen Hd3a dibawah kendali promoter 35SCaMV. Tanaman kentang diperbanyak secara in vitro pada media MS2 makro. Transformasi genetik dilakukan dengan menggunakan ruas (internode) sebagai eksplan melalui bantuan Agrobacterium tumefaciens dengan metode ko-kultivasi. Seleksi kalus dan tanaman transgenik putatif dilakukan di media MS yang mengandung mg/l higromisin. Hasil penelitian menunjukkan bahwa rata-rata efisiensi transformasi adalah yaitu 38,88% dengan efisiensi regenerasi yang rendah yaitu 9,5%. Rata-rata tunas yang dihasilkan tiap kalus adalah 2,25. Pada umur 6 minggu, baik tanaman kentang transgenik maupun non transgenik yang ditanam secara in vitro tidak menghasilkan bunga, tetapi 10% dari tanaman transgenik menghasilkan umbi dan semua tanaman non transgenik tidak menghasilkan umbi. Hal ini menunjukkan bahwa Hd3a menginduksi pembentukan umbi pada tanaman kentang kultivar Diamant transgenik putatif. Umur 6 minggu tidak mencukupi untuk menghasilkan bunga. Kata kunci:.35s CaMV, gen Hd3a, kultivar Diamant, Solanum tuberosum, transformasi genetik. ABSTRACT ANNISA NURRIZKY. Genetic engineering of potato plant (Solanum tuberosum) cultivar Diamant with Hd3a controled by 35SCaMV promoter. Supervised by SUHARSONO and YOHANA C. SULISTYANINGSIH. Potato is one of important horticultural and food crops in Indonesia due to the high economic value. Flower has an important role in the conventional breeding to cross, so the induction of flowering is very important. In several species, Hd3a induced flowering. In potato cv. Andigena, Hd3a does not only induce the flowering, but also induces the tuber formation. This research has an objective to engineer genetically potato cv. Diamant with Hd3a under the control of the 35SCaMV promoter. Potato plants were propagated in vitro in MS2 macro media. Genetic transformation is done by using the internode fragments as explants intermediated by Agrobacterium tumefaciens with co-cultivation method. Calli and putative transgenic plants sere selected in MS media containing mg/l hygromicin. The results showed that the average transformation efficiency was 38.88% with low regeneration efficiency, i.e. 9.5%. The average of shoots produced per callus was At six weeks old, putative transgenic and non transgenic potato plants did not form a flower, but 10% of putative transgenic

5 plants formed a tuber and all non transgenic ones did not produce a tuber. This result indicates that Hd3a is capable to induce tuber formation. Six weeks is not enough time for flower formation. Keywords: 35SCaMV, cv. Diamant, genetic transformation, Hd3a gene, Solanum tuberosum 3

6

7 1 REKAYASA GENETIK PADA TANAMAN KENTANG (Solanum tuberosum) KULTIVAR DIAMANT DENGAN GEN Hd3a DIBAWAH KENDALI PROMOTER 35SCaMV ANNISA NURRIZKY Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2015

8 2

9

10 4 PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah subhanahu wa ta ala atas segala karunia-nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Tema yang dipilih dalam penelitian yang dilaksanakan sejak bulan Maret 2014 ini ialah Rekayasa genetik, dengan judul Rekayasa genetik pada tanaman kentang (Solanum tuberosum) dengan gen Hd3a dibawah kendali promoter 35SCaMV. Terima kasih penulis ucapkan kepada Bapak Prof Dr Ir Suharsono, DEA dan Ibu Dr Yohana C. Sulistyaningsih, MSi selaku pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan, saran, waktu, dukungan serta kesabaran selama penulisan karya ilmiah ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada Dr Achmad Farajallah, MSi selaku penguji skripsi atas semua saran, masukan, dan perbaikan yang telah diberikan. Terimakasih diucapkan kepada Proyek Penelitian Desentralisasi Baru IPB yang berjudul Rekayasa genetik tanaman dengan gen toleransi aluminium dan pembungaan dengan kontrak no: 48/IT3.11/LT/2014 atas nama: Prof Dr Ir Suharsono, DEA yang telah membiayai penelitian ini. Terimakasih juga penulis sampaikan kepada seluruh staf di laboratorium Biologi Molekular dan Selular Tanaman (BMST) dan BIORIN, khususnya pada Ibu Nia Dahniar, SP, Ibu Pepi Elvavina, Ibu Sarah, Bapak Asep Saripudin, Bapak Abdul Mulya, Bapak Sairi, dan Bapak Yulianto atas segala bantuan. Ucapan terimakasih juga penulis sampaikan kepada rekan-rekan seperjuangan di BMST dan BIORIN, yaitu Liyana, Ika, Eka, Ina, Scarinta, Bustomi, Aditya, Dwika, Kak Baso, Mas Ari, Mas Rudi, Mbak Wiwin, Mbak Isni, Mbak Nurul H, Mbak Uuf, Mbak Nadeak, Mbak Tiwi, Mbak Fajri, Mbak Destik, Mas Wawan, Mbak Lia, Mbak Nurul, Mbak Nuril, Mbak Efa, Mas Luthfi, Ibu Ifah, Ibu Ida, Pak Ilyas, dan Pak Asri. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada sahabat-sahabat terbaik BC, Orkes 47, rekan-rekan kost Asyita Graha, serta teman-teman biologi 47 atas segala dukungan dan kebersamaan selama ini. Ucapan terima kasih terbesar penulis sampaikan kepada kedua orang tua Ibu Chaeriyawati dan Bapak Julius Lukman, dan adik Nurul Ummi Julisti, Mutia Nurrahmah, Fajrin Akbar serta seluruh keluarga atas segala do a dan dukungan yang diberikan. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Februari 2015 Annisa Nurrizky

11 5 DAFTAR ISI DAFTAR TABEL viii DAFTAR GAMBAR viii DAFTAR LAMPIRAN viii PENDAHULUAN 1 Latar belakang 1 Tujuan Penelitian 2 METODE 2 Waktu dan Tempat 2 Bahan 2 Metode 3 Perbanyakan Tanaman in vitro 3 Kultur Agrobacterium tumefaciens 3 Transformasi, Seleksi dan Regenerasi 3 HASIL DAN PEMBAHASAN 4 Transformasi dan regenerasi 4 Seleksi dan perbanyakan tunas transgenik putatif 6 SIMPULAN DAN SARAN 7 Simpulan 7 Saran 7 UCAPAN TERIMAKASIH 8 DAFTAR PUSTAKA 8 LAMPIRAN 10 RIWAYAT HIDUP 12

12 6 DAFTAR TABEL 1 Rata-rata efisiensi transformasi kentang kultivar Diamant 5 2 Rata rata efisiensi regenerasi kentang kultivar Diamant 6 DAFTAR GAMBAR 1 Orientasi sense gen Hd3a terhadap promoter 35S CaMV pada daerah T DNA 3 2 Pembentukan kalus dan tunas 4 3 Tunas transgenik putatif yang dihasilkan oleh kalus kentang kultivar Diamant yang resisten terhadap higromisin 30 mg/l 5 4 Tunas pada media seleksi yang mengandung higromisin dengan konsentrasi 40 mg/l pada umur 2 minggu setelah tanam 6 5 Tanaman kentang kultivar Diamant in vitro yang berumur 6 minggu 7 DAFTAR LAMPIRAN 1 Komposisi media MS (Murashige dan Skoog 1962) 10 2 Komposisi media MS2 11

13 1 PENDAHULUAN Latar belakang Kentang merupakan salah satu komoditi hortikultura dan pangan yang penting di Indonesia karena mempunyai nilai ekonomi yang tinggi. Kentang dapat digunakan dalam industri makanan olahan dan dapat dikonsumsi sebagai pangan alternatif. Menurut BPS (2014), produktivitas kentang di Indonesia pada tahun 2013 mengalami penurunan sebesar 0,56 ton/ha dibandingkan pada tahun Produktivitas kentang dapat ditingkatkan melalui pemuliaan secara konvensional dengan persilangan. Tanaman kentang kultivar Diamant berasal dari Belanda dan dihasilkan dari persilangan antar mutan Cardinal pada tahun 1982 (ECPD 2013). Kultivar Diamant memiliki umbi berukuran besar, berbentuk oval, berkulit kuning, daging berwarna kuning pucat, tingkat blackening rendah, serta memiliki kadar pati sedang (ECPD 2013), sehingga cocok untuk dijadikan sebagai bahan pembuatan kentang goreng dan keripik kentang. Ciri lain dari kultivar Diamant adalah bunga berwarna merah-ungu (NPCF 2011) dan tergolong kultivar yang sukar berbunga (Sahat 1991). Dalam melakukan pemuliaan konvensional dengan persilangan diperlukan bunga. Bunga digunakan dalam proses persilangan untuk menghasilkan keturunan yang baru. Pembungaan diawali oleh transisi dari fase vegetatif menuju ke fase reproduktif (generatif). Pembungaan dipengaruhi oleh suhu udara, panjang hari, fitohormon dan florigen. Tanaman kentang merupakan tanaman hari panjang yang memerlukan panjang hari antara jam untuk pembungaan. Selain panjang hari, pembungaan pada tanaman kentang juga diinduksi oleh suhu udara (15-20 o C), kelembaban udara tinggi, sinar matahari yang cukup, dan curah hujan yang rendah (Sahat 1991). Untuk menginduksi pembungaan, salah satu pendekatannya adalah melakukan rekayasa ekspresi secara berlebihan dari gen pembungaan. Gen-gen penting pengatur waktu pembungaan telah dipetakan dengan baik oleh beberapa peneliti seperti Yamamoto et al. (1998) yang telah berhasil melakukan pemetaan beberapa gen Hd (Hd-1, Hd-2, Hd-3) dari persilangan tanaman padi kultivar Kasalath dan Nipponbare. Gen Hd3a (heading date 3 a) merupakan salah satu gen yang berhubungan dengan pembungaan dan telah diisolasi dari padi oleh Kojima et al. (2002). Tamaki et al. (2007) membuktikan bahwa Hd3a disintesis di daun dan didistribusikan ke seluruh bagian tanaman. Kojima et al. (2002) telah melakukan identifikasi gen Hd3a pada padi yang disinyalir dapat menginduksi pembungaan. Gen tersebut homolog dengan gen flowering locus T (FT) dari Arabidopsis thaliana. Gen Hd3a diidentifikasi sebagai quantitative trait locus (QTL) untuk pembungaan yang berada pada lengan pendek dari kromosom 6. Gen Hd3a mampu menginduksi pembungaan pada tanaman hari pendek seperti pada padi dan hari panjang seperti Arabidopsis (Kojima et al. 2002). Introduksi gen Hd3a dibawah kendali promoter kuat mampu menginduksi pembungaan pada Saussurea involucrate (Li et al. 2011), Jatropha curcas (Sulistyaningsih 2012) dan Nicotiana benthamiana (Syafitri 2012). Keturunan dari N. benthamiana transgenik yang mengandung gen Hd3a di bawah kendali

14 2 promoter 35SCaMV juga berbunga lebih cepat dibandingkan dengan tanaman non transgenik (Senjaya 2013). Ekspresi Hd3a di kentang kultivar Andigena transgenik menginduksi pembungaan (Navarro et al. 2011). Oleh karena itu, ekspresi Hd3a secara berlebih di kentang kultivar Diamant diharapkan dapat menginduksi pembungaan sehingga dapat disilangkan dengan kultivar lain. Transformasi genetik tanaman kentang telah banyak dilakukan diantaranya oleh Nurhasanah et al. (2003), Navarro et al. (2011) dan Manguntungi (2014). Pengekspresian gen Hd3a secara berlebih pada tanaman kentang di bawah kendali promoter rolc telah dilakukan pada kultivar Baraka (Bustomi 2014), Agria (Salsabila 2014), Diamant (Mardiyyah 2014), dan Kennebec (Maulani 2014). Pada kultivar Andigena (Navarro et al. 2011), kultivar Baraka (Bustomi 2014) dan Agria (Salsabila 2014) telah menghasilkan tanaman transgenik yang mengandung gen Hd3a dibawah kendali promoter rolc berumbi sedangkan tanaman non transgenik tidak berumbi pada umur yang sama. Hal ini menunjukkan bahwa Hd3a dapat menginduksi pembentukan umbi pada kultivar kentang tertentu. Oleh sebab itu rekayasa genetik kentang kultivar Diamant dengan gen Hd3a di bawah kendali promoter kuat 35SCaMV kemungkinan dapat menginduksi pembentukan umbi. Induksi pembentukan umbi ini dapat bermanfaat untuk meningkatkan produktivitas kentang kultivar Diamant. Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan untuk melakukan rekayasa genetik tanaman kentang kultivar Diamant dengan gen Hd3a dibawah kendali promoter kuat 35SCaMV. METODE Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juni sampai dengan Desember 2014 di Laboratorium Biologi Molekuler dan Seluler Tanaman (BMST) dan Laboratorium Biotechnology Research Indonesia The-Netherland (BIORIN), Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), LPPM, Institut Pertanian Bogor (IPB), Kampus IPB Dramaga, Bogor. Bahan Tanaman kentang kultivar Diamant yang ditanam secara in vitro pada media MS (Murashige dan Skoog 1962) (Lampiran 1) dan MS2 makro (Lampiran 2) digunakan sebagai bahan tanaman dan media MS yang mengandung higromisin digunakan sebagai media seleksi tanaman transgenik. Agrobacterium tumefaciens galur LBA4404 mengandung plasmid pcambia1300-hd3a (Sulistyaningsih 2012) yang membawa gen Hd3a (Tamaki et al. 2007) di bawah kontrol promoter 35SCaMV yang difusikan dengan gen penanda seleksi hpt digunakan untuk melakukan transformasi genetik (Gambar 1). Gen Hd3a yang digunakan diperoleh dari Prof. Ko Shimamoto (Nara Institute of Science and Technology, Japan).

15 3 LB KpnI KpnI RB hpt 35S Pro CA Hd3a 35S Pro Gambar 1 Daerah T-DNA dari plasmid pcambia1300-hd3a. LB: left border, RB: right border, 35S Pro: promoter 35S dari cauliflower mosaic virus (CaMV), Hd3a: gen Hd3a dari padi. CA: sekuen polya dari 35S CaMV, hpt: gen higromisin phosphotransferase. Metode Perbanyakan Tanaman in vitro Tunas in vitro tanaman kentang yang berumur 4 minggu dipotong di dalam cawan petri steril menjadi potongan buku yang mengandung satu mata tunas. Potongan buku ditanam pada media MS dan diinkubasi selama satu minggu, kemudian dipindahkan pada media MS2 Makro (Lampiran 2) padat tanpa zat pengatur tumbuh. Kultur dipelihara di dalam ruang kultur pada suhu o C selama 4 minggu. Kultur Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium tumefaciens galur LBA4404 yang mengandung plasmid pcambia1300-hd3a ditumbuhkan di dalam 20 ml media LB (1% tripton, 0.5% yeast extract, 1% NaCl) cair yang mengandung 50 mg/l kanamisin dan 25 mg/l rifampisin di atas shaker yang digoyang dengan kecepatan ± 160 rpm pada suhu kamar selama 18 jam hingga kerapatannya mencapai 0,4-0,7 pada OD600. Biakan diendapkan dengan sentrifugasi 5000 rpm selama 15 menit dan endapan disuspensikan di dalam 20 ml media MS cair yang mengandung 200 mg/l casein hydrolisat, 0,1 mg/l naphthalene acetic acid (NAA), 1 mg/l N6-benzyl adenine purin (BAP) dan 40 mg/l asetosiringon. Transformasi, Seleksi dan Regenerasi Transformasi dilakukan dengan menggunakan Agrobacterium tumefaciens sebagai vektor menurut prosedur Akashi et al. (2005). Eksplan yang berupa satu ruas tanpa mata tunas dari tanaman in vitro yang berumur 4 minggu direndam di dalam suspensi Agrobacterium tumefaciens OD600 0,4-0,7 yang digoyang dengan kecepatan 100 rpm pada suhu ruang selama 10 menit. Eksplan dikeringkan dengan tisu steril dan ditanam di dalam media MS padat yang mengandung 200 mg/l casein hydrolisat, 0.1 mg/l NAA, 1 mg/l BAP dan 40 mg/l asetosiringon di dalam ruang gelap selama 3 hari pada suhu 25 o C. Setelah ko-kultivasi selama 3 hari, eksplan dicuci dengan air steril diikuti dengan 200 mg/l cefotaxime selama 10 menit kemudian dikeringkan dengan tisu steril. Eksplan yang telah dikeringkan kemudian ditanam dalam media induksi kalus berupa MS padat dengan penambahan 2 mg/l IAA, 3 mg/l BAP, 1 mg/l GA3, dan 200 mg/l cefotaxime tanpa agen seleksi higromisin dan diinkubasi di ruang kultur pada suhu o C selama satu minggu. Seleksi dengan higromisin

16 4 mulai dilakukan pada kalus berumur 1 minggu di media induksi kalus secara bertingkat dengan konsentrasi 10 mg/l, 20 mg/l pada subkultur kedua dan 30 mg/l pada subkultur ketiga. Kalus yang resisten higromisin dipindahkan ke media regenerasi yang sama dengan media induksi kalus. Tunas hasil regenerasi dipotong dan dipindahkan ke media MS2 Makro padat yang mengandung higromisin dengan konsentrasi 40 mg/l. Pengamatan dilakukan terhadap jumlah kalus yang resisten, jumlah kalus resisten yang beregenerasi dan jumlah tunas tiap kalus yang tumbuh pada media regenerasi. Efisiensi transformasi dan regenerasi tanaman transgenik diperoleh dengan rumus sebagai berikut: % efisiensi transformasi = KRH KT X 100% % efisiensi regenerasi = KRHT KRH x 100% Rata-rata jumlah tunas tiap kalus = Keterangan: jumlah tunas yang muncul jumlah kalus yang menghasilkan tunas KRH = jumlah kalus resisten higromisin KT = jumlah kalus total KRHT = jumlah kalus resisten higromisin yang bertunas HASIL DAN PEMBAHASAN Transformasi dan regenerasi Ruas yang telah dikokultivasi dengan Agrobacterium tumefaciens mulai menghasilkan kalus pada minggu ke-2 setelah tanam (MST) di media induksi kalus (Gambar 2). Kalus tersebut diseleksi secara bertingkat pada media yang ditambahi antibiotik higromisin sebagai agen seleksi pada setiap subkultur dengan konsentrasi 10 mg/l, 20 mg/l dan 30 mg/l. Kalus yang resisten tumbuh berwarna hijau, dan yang tidak resisten terhadap antibiotik higromisin ditandai dengan pencoklatan pada seluruh bagian eksplan. Untuk regenerasi, eksplan dipindahkan ke media regenerasi dengan penambahan 40 mg/l higromisin a b c Gambar 2 Pembentukan kalus dan tunas setelah ko-kultivasi. (a) umur 0 minggu, (b) umur 2 minggu, dan (c) umur 3 minggu. Bar berukuran 1 cm.

17 5 Transformasi kentang kultivar Diamant dilakukan sebanyak dua kali dengan efisiensi transformasi masing-masing 31,46% dan 46,30% dengan ratarata efisiensi sebesar 38,88% (Tabel 1). Efsiensi transformasi yang didapatkan pada penelitian ini lebih tinggi dibandingkan pada penelitian sebelumnya yang juga menggunakan gen Hd3a, seperti pada kentang kultivar Baraka yang memiliki rata-rata efisiensi sebesar 16,36% (Bustomi 2014) dan Jatropha curcas sebesar 26,67% (Sulistyaningsih 2012), namun lebih rendah dibandingkan pada Nicotiana benthamiana dengan nilai sebesar 86% (Syafitri 2012). Efisiensi transformasi bergantung pada strain A. tumefaciens (Riva et al. 1998, Azhakanandam et al. 2000). Selain itu, efisiensi transfer gen oleh A. tumefaciens juga dipengaruhi oleh senyawa fenolik asetosiringon yang berperan sebagai kemoatraktan bagi bakteri untuk menginduksi gen virulensi yang terdapat pada plasmid Ti (Ashby et al. 1988). Tabel 1 Rata-rata efisiensi transformasi kentang kultivar Diamant Ulangan Jenis eksplan Jumlah eksplan Jumlah kalus resisten higromisin Efisiensi transformasi (%) 1 Ruas Ruas Rata-rata Kalus resisten higromisin selanjutnya dipindahkan ke media regenerasi untuk pembentukan tunas. Tunas yang dihasilkan merupakan tunas transgenik putatif (Gambar 3). Rata-rata efisiensi regenerasi dari dua ulangan adalah 9.5%. Hal tersebut menunjukkan bahwa tidak semua kalus dapat beregenerasi. Rata-rata jumlah tunas yang tumbuh tiap kalus sebesar 2.25 tunas (Tabel 2). Efisiensi regenerasi tergantung dari genotipe dan spesiesnya. Selain itu, kondisi fisiologis eksplan juga menentukan keberhasilan regenerasi tunas, karena tidak semua sel di dalam jaringan tanaman memberikan respon yang sama terhadap zat pengatur tumbuh yang diberikan. Hal ini terkait dengan metabolism sel, ketersediaan zat pengatur tumbuh endogen serta aktifitas gen-gen yang mengendalikan proses pertumbuhan dan perkembangan (Lestari 2012). Gambar 3 Tunas transgenik putatif yang dihasilkan oleh kalus kentang kultivar Diamant yang resisten terhadap higromisin 30 mg/l. Bar berukuran 1 cm.

18 6 Tabel 2 Rata rata efisiensi regenerasi kentang kultivar Diamant Ulangan Jenis eksplan Jumlah kalus resisten higromisin Jumlah kalus beregenerasi Efisiensi regenerasi (%) Jumlah tunas Tunas tiap kalus 1 Ruas Ruas Rata-rata Seleksi dan perbanyakan tunas transgenik putatif Tunas-tunas transgenik putatif yang dihasilkan dari kalus resisten higromisin ditanam pada media MS2 untuk tujuan perbanyakan. Seleksi tunas transgenik dilakukan dengan menanam tunas transgenik putatif pada media MS2 yang mengandung 40 mg/l higromisin. Tunas yang dapat tumbuh dengan baik selama 2 minggu pada media seleksi higromisin dengan konsentrasi 40 mg/l merupakan tunas transgenik putatif, sedangkan tunas yang tidak mampu bertahan hidup merupakan tunas non transgenik (Gambar 4). Tanaman yang dapat bertahan hidup mampu mensintesis higromisin fosfotransferase yang dapat memfosforilasi gugus hidroksil dari antibiotik higromisin, sehingga tidak merusak tanaman (Brasileiro & Aragou 2001). Walaupun uji integrasi terhadap gen Hd3a belum dilakukan, namun karena gen Hd3a dipautkan (linked) dengan gen hpt, maka tanaman yang resisten terhadap higromisin juga mengandung gen Hd3a. Penelitian ini telah menghasilkan tanaman kentang transgenik yang resisten higromisin sehingga tanaman transgenik ini juga mengandung gen Hd3a di bawah kendali promoter 35SCaMV. a b Gambar 4 Tunas pada media seleksi yang mengandung 40 mg/l higromisin pada umur 2 minggu setelah tanam. (a) tunas kontrol, dan (b) tunas transgenik putatif. Bar berukuran 0,5 cm. Pada umur 6 minggu setelah tanam (MST) di media MS2 makro, 1 dari 10 tunas transgenik putatif menghasilkan umbi sedangkan semua tunas non transgenik tidak berumbi (Gambar 5). Hal ini mengindikasikan bahwa Hd3a menginduksi pembentukan umbi pada kentang kultivar Diamant. Hasil penelitian ini juga mendukung penelitian sebelumnya yang dilakukan oleh Navarro et al. (2011) pada kultivar Andigena, Bustomi (2014) pada kultivar Baraka dan Salsabila (2014) pada kultivar Agria. Walaupun menggunakan kultivar dan gen Hd3a yang sama, Mardiyyah (2014) tidak memperoleh tanaman kentang

19 7 transgenik putatif yang berumbi. Hal ini kemungkinan Mardiyyah menggunakan promoter rolc untuk mengendalikan ekspresi gen Hd3a. Apabila umur tanaman diperpanjang, kemungkinan tunas transgenik putatif yang mengandung gen Hd3a tersebut akan berumbi lebih cepat daripada tanaman non transgenik. Pada penelitian ini, tidak satu pun tanaman transgenik putatif secara in vitro menghasilkan bunga. Hal ini sama dengan penelitian yang dilakukan oleh Bustomi (2014), Mardiyyah (2014), Salsabila (2014) dan Maulani (2015). Hal ini kemungkinan disebabkan karena belum cukup umur untuk berbunga walaupun telah diinduksi oleh Hd3a. Rata-rata tanaman kentang in vitro disubkulturkan paling lama 6 MST dan 6 MST belum cukup untuk berbunga. Navarro et al. (2011) memperoleh tanaman transgenik yang mengandung Hd3a berbunga setelah ditanam di tanah. Kemungkinan tanaman kentang kultivar Diamant transgenik yang mengandung gen Hd3a di bawah kendali promoter 35SCaMV akan berbunga lebih awal dibandingkan tanaman non transgenik bila ditanam di tanah. a b Gambar 5 Tanaman kentang kultivar Diamant in vitro yang berumur 6 minggu. (a) tanaman transgenik, (b) tanaman non-transgenik. Tanda panah menunjukkan umbi. Bar berukuran 1 cm. SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Rekayasa genetik kentang kultivar Diamant telah berhasil dilakukan dengan menghasilkan 10 tunas transgenik putatif. Rata-rata efisiensi transformasi adalah 38,88%, dan rata-rata efisiensi regenerasi 9,5%. Pada umur 6 MST, satu dari sepuluh tunas transgenic putatif menghasilkan umbi, sedangkan tunas non transgenik tidak menghasilkan umbi yang menunjukkan bahwa Hd3a menginduksi pembentukan umbi. Saran Uji integrasi gen Hd3a di dalam tanaman transgenik perlu dilakukan untuk mengkonfirmasi bahwa tanaman tersebut mengandung gen sasaran. Selain itu,

20 8 aklimatisasi juga perlu dilakukan untuk melihat ekspresi dari gen tersebut di dalam tanaman kentang kultivar Diamant di lapang. UCAPAN TERIMAKASIH Terima kasih disampaikan kepada Proyek Penelitian Desentralisasi Baru IPB yang berjudul Rekayasa genetika tanaman dengan gen toleransi aluminium dan pembungaan dengan kontrak nomor: 48/ IT3.11/ LT/ 2014 atas nama: Prof. Dr. Ir. Suharsono yang telah membiayai penelitian ini. DAFTAR PUSTAKA [BPS] Badan Pusat Statistik Luas panen, produktivitas dan produksi kentang [Internet]. [diunduh 2014 Juni 4]. Tersedia pada: [ECPD] European Cultivated Potato Database Diamant (1982) [Internet]. [diunduh 2013 Desember 31]. Tersedia pada: display_description.php?variety_name=diamant%20%281982%29. [NPCF] Netherlands Potato Consultative Foundation Variety [Internet]. [diunduh 2014 Januari 1]. Tersedia pada: potatoes/variety_catalogue/ras?frmvariety=128# Akashi K, Morikawa K, Yokota A Agrobacterium-mediated transformation system for the drought and excels light stress-tolerant wild water melon (Citrullus lanatus). Plant Biotech. 22: Ashby AM, Watson MD, Loake GJ, Shaw CH Ti plasmid specified chemotaxis of Agrobacterium tumefaciens C585 1 toward vir-inducing phenolic compounds and soluble factors from monocotyledonous and dicotyledonous plants. Bacteriology. 170(9): Azhakanandam K, McCabe MS, Power JB, Lowe KC, Cocking EC, Davey MR T-DNA transfer, integration, expression and inheritance in rice: effects of plant genotype and Agrobacterium super-virulence. Plant Physiol. 157: Brasileiro ACM, Aragou FJL Marker genes for in vitro selection of transgenic plants. J. Plant. Biotech. 3(3): Bustomi Transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum L.) Kultivar Baraka dengan Gen Pembungaan Hd3a [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Dwelle RB, Love SL Potato growth and development. Adapted with permission from Potato health management. Second edition. AP Press. Kojima S, Takahashi Y, Kobayashi Y, Monna L, Sasaki T, Araki T, Yano M Hd3a, a rice ortholog of the arabidopsis FT gene, promotes transition to flowering downstream of Hd1 under short-day conditions. Plant Cell Physiol. 43: Komiya R, Ikegami A, Tamaki S, Yokoi S, Shimamoto K Hd3a and RFT1 are essential for flowering in rice. Development. 135 :

21 Lestari EG Regenerasi tanaman secara in vitro dan faktor-faktor yang mempengaruhi. [Internet]. [diunduh 2014 Oktober 5]. Tersedia pada: Li M, Li H, Hu X Genetic transformation and overexpression of a rice Hd3a induces early flowering in Saussurea involucrata Kar.et Kir. ex Maxim. Plant Cell Tiss Organ Cult. 106: Manguntungi AB Transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar Atlantik dengan gen penyandi lisozim melalui perantara Agrobacterium tumefaciens [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Mardiyyah I Introduksi gen pembungaan Hd3a ke dalam tanaman kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar Diamant [makalah seminar]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Maulani E Transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar Kennebec dengan gen pembungaan Hd3a [makalah seminar]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Murashige T, Skoog F A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco culture. Physiol. Plant. 15: Navarro C. Abelanda JA, Cruz EO, Carlos A, Tamaki S, Silva J, Shimamoto K, Prat S Control of flowering and storage organ formation in potato by FLOWERING LOCUS T. Nature. 478: Nurhasanah Introduksi gen Hordothionin pada tanaman kentang (Solanum tuberosum) kultivar Atlantik [tesis]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Riva GA, Gonzalez-Cabrera J, Vasquez-Padron R, Ayra-Pardo C Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation. Nature Biotechnol 1(1): Sahat S Pengaruh cara stimulasi perbungaan terhadap produksi bunga, buah, dan biji beberapa kultivar kentang (Solanum tuberosum L.). Bull Penel Hort. 20: Salsabila L Transformasi genetik kentang (Solanum tuberosum L.) kultivar Agria dengan gen pembungaan Hd3a [makalah seminar]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Senjaya SK Pewarisan genetik transgen Hd3a pada tanaman Nicotiana benthamiana transgenik [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Sulistyaningsih YC Rekayasa ekspresi gen pembungaan Hd3a pada tanaman jarak pagar (Jatropha curcas L.) [disertasi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Syafitri LN Transformasi genetik Nicotiana benthamiana dengan gen pembungaan Hd3a dari padi [skripsi]. Bogor (ID): Institut Pertanian Bogor. Syahputra AR Uji potensi hasil beberapa kultivar kentang (Solanum tuberosum L.) di Kecamatan Tambangan Kabupaten Mandailing Natal [skripsi]. Medan (ID): Universitas Sumatera Utara. Tamaki S, Matsuo S, Wong HL, Yokoi S, Shimamoto K Hd3a protein is a mobile flowering signal in rice. Science 316: Yamamoto T, Kuboki Y, Lin SY, Sasaki T, Yano M Fine mapping of quantitative trait loci Hd-1, Hd-2 and Hd-3, controlling heading date of rice, as single Mendelian factors. Theor. Appl. Genet. 97:

22 10 Lampiran 1 Komposisi media MS (Murashige dan Skoog 1962) Bahan Konsentrasi dalam media (mg/l) Hara makro NH4NO KNO MgSO47H2O 370 KH2PO4 170 CaCl22H2O 440 FeSO47H2O 27,8 Na2EDTA 37,3 Hara mikro H3BO2 6,2 MnSO4H2O 16,9 ZnSO47H2O 8,6 KI 0,83 Na2MoO47H2O 0,25 CuSO45H2O 0,025 CoCl26H2O 0,025 Vitamin Niacin 0,5 Pyridoxine 0,5 Thiamin 0,4 Glycine 2 Myo-Inositol 100 Myo inositol 100 Sukrosa 30g/l ph 5,8

23 11 Lampiran 2 Komposisi media MS2 Bahan Konsentrasi dalam media (mg/l) Hara makro NH4NO KNO MgSO47H2O 740 KH2PO4 340 CaCl22H2O 880 FeSO47H2O 55,6 Na2EDTA 74,6 Hara mikro H3BO2 6,2 MnSO4H2O 16,9 ZnSO47H2O 8,6 KI 0,83 Na2MoO47H2O 0,25 CuSO45H2O 0,025 CoCl26H2O 0,025 Vitamin Niacin 0,5 Pyridoxine 0,5 Thiamin 0,4 Glycine 2 Myo-Inositol 100 Myo inositol 100 Sukrosa 30g/l ph 5,8

24 12 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Bogor pada tanggal 25 Oktober 1992 sebagai anak pertama dari empat bersaudara dari pasangan Julius Lukman dan Chaeriyawati. Tahun 2010, penulis lulus dari SMA Negeri 2 Kota Bogor dan pada tahun yang sama berhasil lulus seleksi mahasiswa IPB jalur Undangan Saringan Masuk IPB (USMI) pada Program Studi Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA). Selama mengikuti perkuliahan, penulis aktif dalam berbagai kegiatan kampus. Penulis terlibat aktif dalam kegiatan organisasi Himpunan Mahasiswa Biologi (HIMABIO) sebagai staf divisi Informasi dan Komunikasi (INFOKOM) pada tahun 2012/2013. Penulis juga aktif terlibat dalam berbagai kepanitiaan dan dipercaya menjadi staf divisi Fundrising Seminar BIONIC & BOX pada tahun 2011, bendahara Logistik Grand Biodiversity (GB) pada tahun 2012, staf divisi Logistik dan Transportasi Morfologi 48 pada tahun 2012, staf divisi Penginapan Pesta Sains Nasional pada tahun 2012 dan bendahara Penginapan Pesta Sains Nasional pada tahun Penulis juga pernah menjadi asisten praktikum Biologi Cendawan pada tahun 2014 dan asisten praktikum Genetika Molekuler pada tahun Penulis mengikuti Studi Lapangan di Taman Nasional Gunung Gede Pangrango (TNGGP) pada tahun 2012 dengan topik Sebaran Jenis Passiflora di Taman Nasional Gunung Gede Pangrango dan Praktik Lapangan di PT Indolakto, Jakarta Timur pada bulan Juli-Agustus 2013 dengan topik Pengawasan Mutu pada Proses Produksi Susu Kental Manis di PT Indolakto.