HASIL DAN PEMBAHASAN Pengujian Kuantitas dan Kualitas DNA

Transkripsi

1 HASIL DAN PEMBAHASAN Gen sitokrom b digunakan sebagai pembawa kode genetik seperti halnya gen yang terdapat dalam nukleus. Primer tikus yang dikembangkan dari gen sitokrom b, terbukti dapat mengamplifikasi DNA yang berasal dari genus Rattus dan Mus (Nuraini dan Sumantri, ) dikarenakan kedekatan hubungan kekerabatannya. Kedekatan hubungan kekerabatan dapat dilihat dari tingkat homologi R. norvegicus dengan spesies Rattus lainnya dan Mus musculus yang nilainya tidak kurang dari 88% (Tabel ). Hasil pengujian primer dengan menggunakan DNA hasil isolasi bakso disampaikan di bawah ini. Pengujian Kuantitas dan Kualitas DNA DNA template merupakan salah satu materi yang kritis keberadaannya dalam aplikasi teknik PCR. Pengujian kuantitas dan kualitas DNA hasil isolasi perlu dilakukan untuk menilai hasil isolasi DNA. Hasil pengukuran konsentrasi DNA disajikan pada Tabel dan Tabel 5. Hasil pengukuran kuantitatif menunjukkan bahwa DNA yang berhasil diisolasi dari produk bakso sangat beragam dengan rentangan nilai antara µg/µl hingga µg/µl. Hasil isolasi DNA dari bakso yang berasal dari pasar tidak jauh berbeda. DNA yang diisolasi dari bakso pasar memiliki rentangan nilai konsentrasi yang lebih sempit dibandingkan bakso buatan namun masih cukup luas, yaitu antara 56 µg/µl dengan rasio OD 6 / OD 8 sebesar, hingga,. Rentangan nilai rasio yang sama dimiliki oleh DNA hasil ekstraksi dari bakso buatan. Keberadaan campuran bahan penyusun bakso seperti tepung tapioka, garam, bawang putih, merica, STPP dan air menentukan nilai konsentrasi DNA hasil isolasi. Banyaknya bahan campuran selain daging memperkecil konsentrasi daging dalam bakso, sehingga peluang terisolasinya protein daging dalam bakso berkurang. Semakin banyak bahan campuran, semakin kecil peluang tersebut. Rasio OD 6 / OD 8 menunjukkan tingkat kemurnian DNA. Kepadatan optik (Optical Density) pada panjang gelombang 6 nm (OD 6 ) menunjukkan daerah serapan DNA, sedangkan OD 8 nm merupakan daerah serapan protein. Muladno () menyatakan bahwa molekul DNA dikatakan murni apabila rasio nilai OD 6 dengan OD 8 berkisar antara,8 hingga,.

2 Tabel. Hasil Perhitungan Konsentrasi DNA Bakso dengan Campuran Daging Tikus Sampel/ Ulangan Abs 6 Abs 8 Abs 6/ Abs 8 %,7,,99,,86,6,,6,5,,,9 5% % 5% % 5%,9,,,,,,7,7,,,7,,7,,,6,7,,,,6,9,8,,,9,,,,8,,7,5,,9,8,,8,7,5,5,77,65,,,556,55,55,88,75,75,9,,,9,65,5,57,9,67 Konsentrasi (µg/µl)

3 Tabel 5. Hasil Perhitungan Konsentrasi DNA Bakso Pasar Sampel Abs 6 Abs 8 Abs 6/ Abs 8 Aa,,9, Ab,,5,67 Aa Ab Aa Ab Aa Ab A5a A5b A6a A6b A7a A7b Ba Bb Ja Jb Ja Jb,5,,5,8,,,,,7,9,7,6,,,6,8,9,5,,,5,,7,,,7,,,6,8,,8,5,,,7,6,69,,,,,65,5,8,,688,,9,667,7,5,6,7 Keterangan: A = Pasar Anyar, B = Pasar Bogor, J = Pasar Jambu Dua. 7 = urutan pengambilan sampel ab = ulangan Konsentrasi (µg/µl) Hasil dari semua sampel yang diisolasi, hanya empat sampel yang memiliki nilai perbandingan di antara rentang tersebut, yaitu bakso dengan campuran daging tikus % ulangan ke, bakso dengan campuran daging tikus 5% ulangan ke, serta bakso ulangan ke dari pedagang ke6 dan ke7 di Pasar Anyar (A6b dan A7b). Clark dan Christopher () menyebutkan bahwa rasio nilai OD 6 dengan OD 8 yang kurang dari,8 mengindikasikan adanya kontaminasi dari protein dan atau fenol sementara nilai OD 6 / OD 8 yang lebih besar dari, menandakan 6

4 adanya kontaminasi ribonucleic acid (RNA). Kontaminasi protein dan fenol sulit dibedakan karena keduanya dapat terabsorpsi dengan baik pada panjang gelombang 8 nm. Glasel (995) mengungkapkan bahwa dibutuhkan jumlah kontaminasi protein yang besar untuk mempengaruhi rasio ini secara signifikan. Rentangan nilai konsentrasi DNA yang luas pada kedua jenis sampel memungkinkan distandarkannya konsentrasi DNA sebesar 5 µg/µl, kecuali untuk bakso dengan campuran daging tikus % ulangan ke dan bakso dengann campuran daging tikus % ulangann ke yang memiliki konsentrasi kurang dari 5 µg/µl. Penyeragaman DNA template pada konsentrasi 5 µg/µl dilakukan untuk mengurangi keragaman hasil identifikasi akibat keragaman konsentrasi DNA sekaligus mengefisienkan penggunaan DNA. Sampel DNA dengan konsentrasi 5 µg/µl dielektroforesis dalam larutan gel % untuk diuji secara kualitatif. Hasil elektroforesis ditampilkan pada Gambar. M () (+) Gambar. Hasil Elektroforesis DNA Bakso dalam % Gel Agarose. M: Marker pb, : A, : A, : A, : A, 5: A5, 6: A6, 7: A7, 8: B, 9: J, : J. Tampilan hasil elektroforesis yang smear mengindikasikan beragamnya panjang fragmen molekul sehingga molekulmolekul tersebar di sepanjang kolom. Hal ini diduga terjadi karena DNA yang digunakan belum murni. Banyak molekul dapat molekul bukan DNA yang turut terdispersi dalam larutan buffer. Protein terdispersi akibat proses pengolahan bakso yang memungkinkan penghancuran molekul protein menjadi potonganpotongan kecil molekul melalui penggilingan. Proses penggilingan daging hingga lumat menyebabkan pecahnya serabut daging, 7

5 sehingga protein terekstrak (Sugiharti, 9). Aberle et al. () menyebutkan bahwa garam yang ditambahkan pada daging giling akan meningkatkan protein miofibril yang terekstraksi. Hal ini terjadi karena garam menyebabkan struktur myofibril rusak sehingga protein bebas seperti fiber, fibril dan filamen terdispersi (Nuraini, ). Thenawijaya (995) juga menyebutkan bahwa polisakarida yang berasal dari tepung, mempunyai kelarutan yang sama dengan DNA sehingga sulit dipisahkan. Keduanya dapat larut dalam pelarut polar. Proteinprotein terdispersi ditambah dengan polisakarida inilah yang menyebabkan beragamnya panjang fragmen komponen sampel yang terperangkap dalam gel sehingga hasil yang tampak pun smear. Namun demikian, teknik PCR sangat sensitif sehingga tetap dapat mengidentifikasi keberadaan DNA walaupun tidak menggunakan DNA murni sebagai template. Hasil Amplifikasi DNA Amplifikasi DNA dari Darah Visualisasi hasil amplifikasi campuran DNA sapi dan tikus yang diisolasi dari darah disajikan pada Gambar. Level campuran yang digunakan sama seperti level campuran yang diaplikasikan dalam bakso, yaitu, 5,, 5, dan 5%. M 5 6 () Tikus 6 pb Sapi 7 pb Gambar. Hasil Amplifikasi DNA dalam % Gel Agarose. M: Marker pb, : Tikus %, : Tikus 5%, : Tikus %, : Tikus 5%, 5: Tikus %, 6: Tikus 5% (+) 8

6 Fragmen DNA sapi teramplifikasi pada panjang DNA 7 pb sementara tikus pada 6 pb. Berdasarkan hasil elektroforesis, DNA tikus dapat teramplifikasi pada level campuran %. Intensitas pita DNA pada hasil amplifikasi DNA dari darah terlihat mengalami perubahan seiring meningkatnya persentase campuran. Semakin besar persentase campuran DNA tikus, pita DNA tikus semakin tebal sementara pita DNA sapi semakin tipis. Hal ini sesuai dengan hasil penelitian Kesmen et al. () yang menyatakan bahwa intensitas DNA dari produk PCR pada gel agarose berbanding lurus dengan konsentrasi DNA. Gambaran serupa juga diperoleh pada hasil penelitian Matsunaga et al. (999) dan Meyer et al. (995) dimana intensitas produk PCR pada gel agarose meningkat secara proporsional dengan konsentrasi DNA. Amplifikasi DNA Bakso dengan Campuran Daging Tikus Bakso dibuat dari daging sapi yang dicampurkan dengan daging tikus pada level campuran, 5,, 5, dan 5%. Sampel DNA dari darah masingmasing spesies (sapi, tikus) dan campurannya (sapi : tikus = : ), digunakan sebagai kontrol positif. Air sebagai kontrol negatif. Gambaran hasil amplifikasi DNA dari bakso campuran tikus disajikan dalam Gambar sementara tabulasinya disajikan dalam Tabel 6. M S T ST () Tikus 6 pb Sapi 7 pb Gambar. Hasil Amplifikasi DNA Bakso dengan Campuran Daging Tikus dalam % Gel Agarose. M: Marker pb, S: Sapi, T: Tikus, ST: Sapi+tikus, dan : Tikus %, dan : Tikus 5%, 5 dan 6: Tikus %, 7 dan 8: Tikus 5%, 9 dan : Tikus %, dan : Tikus 5%, : Air. (+) 9

7 Tabel 6. Hasil Amplifikasi DNA Bakso dengan Campuran Daging Tikus Sampel/ Ulangan PCR ke Total DNA tikus teramplifikasi Keberhasilan identifikasi cemaran (%) Sapi Tikus Sapi Tikus Sapi Tikus Sapi Tikus Sapi+Tikus % 5% 58, % 5 5% % 9,67 5% Air Keterangan: DNA teramplifikasi; DNA tidak teramplifikasi

8 Campuran DNA tikus mulai teridentifikasi pada tingkat campuran 5% dengan tingkat keberhasilan amplifikasi sebesar 58,%. Persentase sedikit menurun pada tingkat pencampuran %. Tingkat keberhasilan identifikasi lebih dari 9% dicapai saat campuran berada pada tingkat 5% hingga 5%. Perolehan hasil ini lebih rendah bila dibandingkan hasil uji efektivitas dengan menggunakan DNA hasil isolasi dari darah yang menunjukkan bahwa DNA tikus dapat diidentifikasi hingga tingkat pencampuran % (Gambar ). Hasil ini dapat terjadi karena pengaruh bahan penyusun bakso, seperti yang telah dijelaskan di atas. Semakin kecil persentase campuran, semakin kecil pula peluang DNA bahan pencampuran terisolasi, sehingga pita DNA bahan pencampur tidak tertangkap dalam foto dengan sinar ultra violet. Hasil amplifikasi DNA bakso dengan daging tikus (Gambar ) tidak memiliki gambaran intensitas yang sama dengan hasil amplifikasi campuran DNA dari darah (Gambar ). Intensitas pita DNA sapi memang terlihat menurun seiring dengan meningkatnya persentase campuran, namun pola ini terlihat kabur pada pita DNA tikus. Pita DNA tikus terlihat dengan jelas mulai tingkat penyampuran 5% hingga 5% dengan intensitas yang relatif sama. Pita tampak tipis pada tingkat penyampuran 5% dan %, bahkan terkadang tidak muncul. Hal ini berkaitan dengan peluang DNA terisolasi dari butiranbutiran bakso. Oleh karena itu, hasil amplifikasi DNA dalam produk olahan bakso tidak dapat digunakan sebagai dasar untuk menentukan jumlah daging yang dicampurkan dalam suatu produk. Amplifikasi DNA Bakso Pasar Pengambilan sampel di lapangan (pasar) dilakukan untuk mengetahui ada tidaknya campuran material tikus di pasaran sekaligus sebagai bentuk awal aplikasi metode uji yang telah dikembangkan. Tiga pasar dipilih berdasarkan besarnya prospek pemalsuan. Pasarpasar ini adalah pasar tradisional yang tidak mengharuskan keberadaan label dalam setiap barang yang diperjualbelikan di dalamnya. Sebagian besar produk yang diperjualbelikan ialah produkproduk buatan tangan karya penjualnya sendiri dan dipasarkan secara lisan dan atau visual berdasarkan bentuknya. Produkproduk tersebut berpeluang besar untuk dipalsukan tanpa disadari oleh konsumen.

9 Pengambilan sampel dilakukan secara acak berdasarkan metode proportional random sampling (Soekartawi, ). Tabulasi hasil amplifikasi DNA dari bakso pasar ditampilkan pada Tabel 7. Tabel 7. Hasil Amplifikasi DNA Bakso Pasar PCR ke Total DNA Sampel tikus Sapi Tikus Sapi Tikus Sapi Tikus teramplifikasi Sapi Tikus Sapi+Tikus Aa Ab Aa Ab Aa Ab Aa Ab A5a A5b A6a A6b A7a A7b Ba Bb Ja Jb Ja Jb Air Keterangan: DNA teramplifikasi; DNA tidak teramplifikasi

10 Hasil tabulasi menunjukkan bahwa tidak ada campuran daging tikus dalam semua sampel bakso. Tidak ada satu kali pun DNA tikus teramplifikasi dalam gel. Hanya DNA sapi yang teramplifikasi dan terlihat pada gel agarose. Tampilan hasil amplifikasi dapat dilihat pada Gambar 5. M S T ST () 6 pb 7 pb (+) Gambar 5. Hasil Amplifikasi DNA Bakso Pasar dalam % Gel Agarose. M: Marker pb, S: Sapi, T: Tikus, ST: Sapi+tikus, : A, : A, : A, : A, 5: A5, 6: A6, 7: A7, 8: B, 9: J, : J, : Air. Intensitas pita DNA sapi terlihat beragam, sesuai dengan banyak sedikitnya DNA daging yang terisolasi dari bakso. Hal ini juga berkaitan dengan banyak sedikitnya daging yang digunakan dalam pembuatan bakso oleh masingmasing produsen. Semakin banyak daging yang digunakan dalam adonan bakso, semakin besar peluang DNA terisolasi dari daging. Semakin banyak DNA daging terisolasi, semakin tinggi pula intensitas pita DNA yang tampak pada gel.