SINTESIS SENYAWA ANALOG UK-3A DAN PENGARUHNYA TERHADAP BIOAKTIVITAS IN-VITRO ANTI KANKER LEUKEMIA P-388

Transkripsi

1 Teknologi Indonesia 33 () 200: 27 3 Teknologi Indonesia LIPI Press 200 SITESIS SEYAWA AALG UK-3A DA PEGARUYA TERADAP BIAKTIVITAS I-VITR ATI KAKER LEUKEMIA P-388 usniati ), Muhammad anafi 2) Baristand Industri Bandar Lampung ), Pusat Penelitian Kimia LIPI Puspiptek, Serpong 2), husniati.eni@gmail.com ABSTRAK Senyawa analog UK-3A baru yang didefinisikan sebagai 2-idroksi--oktilbenzamida berhasil disintesis dari reaksi amidasi asam karboksilat aromatik dan amina primer dengan menambahkan aktivator DCC (, - disikloheksilkarbodiimida), katalisator DMAP (4-dimetil amino piridin), dan kloroform sebagai pelarut sebanyak 5 ml. Reaksi berlangsung dalam alat dean-stark dengan pengadukan tetap pada suhu 60ºC selama 24 jam. Melalui reaksi tersebut diperoleh rendemen sebanyak 93%. Struktur senyawa ini diidentifikasi menggunakan UV, FT-IR, -MR, dan 3 C-MR. Bioaktivitas senyawa diuji secara in vitro terhadap sel kanker Murine leukemia P-388 menggunakan metode MTT (3-(4,5-dimetiltiazo-2-il-)2,5-difeniltetrazolium bromide. asil bioassay menunjukkan bahwa senyawa tersebut dapat menghambat pertumbuhan sel kanker dengan aktivitas lebih tinggi dari pada senyawa induk yang ditunjukkan dari nilai (inhibitory concentration). Analog UK-3A mempunyai =7,5μg/mL sedangkan UK-3A induk =38μg/mL. Kata kunci: UK-3A, analog UK-3A, Antikanker, P-388. ABSTRACT The novel compound of analog UK-3A defi ned as 2-hydroxy--octylbenzamide was successfully synthesized by the amidation reaction of aromatic carboxylic acids and primary amine by adding the activator of DCC (, -dicyclohexylcarbodiimide), catalyst DMAP (4-dimethyl amino pyridine), and chloroform as a solvent (5 ml). The reaction held in the dean-stark device with continue stirring at 60ºC for 24 hours. Result shows yield as much as 93%. The structure was identifi ed using UV, FT-IR, -MR, and 3 C-MR. Bioactivity of the compound was tested in vitro against murine leukemia cancer cells P-388 by using the MTT (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide. The result of bioassay showed that this analog compound can inhibit the growth of cancer cell Murine leukemia P- 388 with a higher activity than UK-3A indicated by the value of (inhibitory concentration). of analog UK-3A was found 7,5 μg/ml whereas for UK-3A was 38 μg/ml. Keywords: UK-3A, analog UK-3A, anticancer, P-388. PEDAULUA UK-3A telah diisolasi dari Streptomyces sp sebagai komponen minor. [,2,3] Senyawa UK-3A ini memiliki aktivitas penghambatan yang tinggi terhadap pertumbuhan jamur, bakteri, dan sel kanker. [2,3,4-7] Aktivitas antikanker dari senyawa antibiotika UK-3A telah terbukti memiliki daya sitotoksik terhadap pertumbuhan sel kanker Murine leukemia P388 di mana nilai sebesar 38 μg/ml secara in-vitro. [4,5] Senyawa UK-3A memiliki kemiripan struktur dengan senyawa Antimisin A 3 yang telah dikenal sebagai antibiotika dan bekerja sebagai inhibitor rantai respirasi mitokondria sehingga tidak terjadi konversi energi untuk kelangsungan hidupnya. [8] Kedua struktur ditunjukkan pada Gambar. ff print request to: usniati & Muhammad anafi 27

2 Jurnal Teknologi Indonesia 33 () 200 R tidak memperlihatkan aktivitas biologisnya pada konsentrasi di atas 00 μg/ml. [6] UK-2A: R=Me UK-2A: R= Antimisin A 3 Gambar. Struktur molekul UK-3A dan kemiripan struktur terhadap antimisin A 3 Sintesis senyawa UK-3A memerlukan beberapa bahan baku dengan rute reaksi yang cukup panjang sehingga memerlukan pembiayaan yang kurang ekonomis. [9] Untuk memperoleh senyawa analog UK-3A dilakukan suatu rancangan dalam struktur UK-3A dengan cara teknik modifikasi gugus fungsi. Patrick, 200, mendefinisikan senyawa ana log, yaitu senyawa yang dibuat berdasarkan senyawa induk yang telah ditemukan mempunyai aktivitas biologi. Ada dua alasan penting disintesisnya senyawa analog ini, pertama, sebagai studi identifikasi gugus fungsi yang penting dalam menjelaskan mekanisme pengikatan senyawa induk dengan targetnya. Kedua, mempunyai keuntungan dalam pengembangan obat bahwa aktivitas senyawa induk dapat diperbaiki dan mengurangi munculnya efek samping. Sintesis senyawa analog mempunyai tahapan reaksi seminimal mungkin dan menggunakan bermacammacam reaktan sehingga sebanyak mungkin senyawa analog berbeda dapat disintesis. [0] asil sintesis senyawa analog dari modifikasi gugus aktif diharapkan mempunyai aktivitas biologi serupa, lebih rendah, atau lebih tinggi dari senyawa induk. [9,0] Peranan gugus aktif hidroksil, amida, dan dilakton cincin sembilan dalam UK-3A mempunyai pengaruh terhadap daya sitotoksik sel kanker P-388. Beberapa penelitian telah memberikan hasil uji dari pengaruh gugus aktif - dan C[ 4,5,] dan dilakton cincin sembilan terhadap aktivitas anti kanker. Bila dilakton cincin sembilan terhidrolisis oleh asam/basa menghasilkan senyawa seperti pada Gambar 2, yaitu 3-hidroksipikoliin serin metil ester (A) dan ester lakton cincin lima (B). Kedua senyawa A dan B tidak mempunyai aktivitas antikanker terutama P388 yang sebelumnya ada pada senyawa induk, UK-3A. [2] Suatu senyawa Gambar 2. Struktur hidrolisis molekul UK-3A, 3- hidroksipikoliin serin metil ester (A) dan ester lakton cincin lima (B). Aktivitas senyawa A dilakton cincin terbuka dapat ditingkatkan dengan cara esterifikasi senyawa asam karboksilat seperti PSME (3-hidroksi pikolinin serin metil oktil ester) memberikan nilai sel kanker P-388 adalah 5,4 μg/ml lebih tinggi dari aktivitas antikanker UK-3A. [2] Pada makalah ini akan dilaporkan hasil sintesis senyawa analog UK-3A dan uji bioaktivitasnya. Sintesis senyawa analog dilakukan dengan cara menghilangkan gugus dilakton rantai terbuka sehingga senyawa analog baru menjadi lebih sederhana karena hanya merupakan satu reaksi amidasi. Senyawa analog baru tetap mempertahankan gugus-gugus aktif (hidroksil) dan C (amida). BAA DA METDE Bahan baku sintesis: 0,276 g asam salisilat (E. Merck); 0,364 ml oktilamin (E. Merck); 0,454 g DCC (,-disikloheksil karbodiimida) (Sigma); 0,269 g DMAP (,-4-dimetil amino piridin) (Sigma) dan 5mL pelarut kloroform (E. Merck). Bahan proses pemurnian: filtrat yang diperoleh diekstraksi dengan 25 ml CCl 3 (teknis) kemudian dilewatkan dalam kolom kromatografi silika gel (E. Merck) menggunakan eluen 4: n-heksana: etil asetat (teknis). Bahan uji sitotoksik: Reagen MTT [3-(4,5- dimetilthiazol-2-il)-2,5-difenil tetra zolium bromida]; Fetal Bovine Serum (FBS); penisilin; streptomisin; Kultur sel kanker Murine leukemia 28

3 usniati dan Muhammad anafi : Sintesis Senyawa Analog... P388; DMS (dimetil sulfoksida); PBS (phosphoric buffer solution); cis-platin; SDS (sodium dodesil sulfat). instrumentasi UV, FT-IR, MR. Aktivitas biologi senyawa sintesis diuji menggunakan sel kanker Murine leukemia P 388 secara in vitro. [3] Alat Identifikasi kromofor menggunakan alat UV dengan kisaran panjang gelombang, λ= nm dengan konsentrasi 000 ppm dalam pelarut metanol. Analisis gugus fungsi menggunakan FT-IR. Serapan sampel padatan yang digerus bersama KBr kemudian dibentuk menjadi cakram tipis dan serapannya diukur pada daerah infra merah dengan panjang gelombang, λ= 5,4-2,5 μm ( cm - ). Konfirmasi struktur lebih lanjut ditentukan dengan -MR dan 3 C-MR. Metode Sintesis: Bahan baku dari 0,276 g asam salisilat (E. Merck); 0,364 ml oktilamin (E. Merck); 0,454 g DCC (,-disikloheksil karbodiimida) (Wako); 0,269 g DMAP (,-4-dimetil amino piridin) dan 5mL pelarut kloroform direaksikan selama 24 jam pada suhu 60ºC dalam alat dean-stark berukuran 200mL sambil dilakukan pengadukan secara terus-menerus menggunakan pengaduk magnet dan hot plate stirrer. Reaksi pembentukan senyawa 2-idroksi-oktilbenzamida disertakan dengan pembentukan produk samping DCU (disikloheksil urea). Kelebihan DCC dihilangkan dengan penambahan air sedangkan DCU dipisahkan melalui penyaringan. Kemudian filtrat diekstraksi dengan 25mL kloroform. Air yang terbawa dalam pelarut organik dihilangkan dengan penambahan magnesium sulfat anhidrat hingga jenuh. Sampel dikeringkan dari pelarutnya dengan penguapan menggunakan evaporator vakum pada 50ºC. Sampel dimasukkan ke dalam kolom kromatografi yang berisi silika gel dan dielusi dengan gradien konsentrasi n-heksan:etil asetat mulai dari 00% hingga 50% n-heksan. Fraksi yang menunjukkan spot tunggal (fraksi murni) dari produk yang diinginkan selanjutnya dikarakterisasi secara kualitatif menggunakan KLT (E. Merck) dan diamati menggunakan lampu UV pada λ= 254 dan 360 nm. Identifikasi struktur molekulnya juga dianalisis menggunakan Uji Bioaktivitas antikanker secara invitro Kultur sel kanker Murine leukemia P388 sejumlah 3 x 0 3 sel/ml disuspensikan ke dalam media RPMI 640 yang telah mengandung FBS (Fetal Bovine Serum), penisilin dan streptomisin. Sel pada hari pertama diinokulasikan ke dalam microplate 96 well plate dan diinkubasi dalam inkubator C 2. ari kedua dilakukan penambahan sampel yang dilarutkan dalam pelarut DMS (dimetil sulfoksida). Sampel dengan konsentrasi beragam diencerkan dengan penambahan PBS (phosphoric buffer solution) dengan p (7,30 7,65) ditambahkan ke dalam sel dalam microplate lalu dikocok dan disimpan kembali dalam inkubator C 2. Kontrol negatif terhadap aktivitas antikanker digunakan pelarut DMS sedangkan kontrol positif digunakan senyawa standar cis-platin. Setelah 48 jam, ke dalam sel ditambahkan reagen MTT dan diinkubasi selama 4 jam untuk selanjutnya ditambahkan SDS dan dikocok dengan baik. Inkubasi sel dilanjutkan kembali selama 24 jam. Perubahan warna dari MTT kuning menjadi formazan ungu di dalam mitokondria sel yang masih hidup dapat dikuantifikasi pada panjang gelombang λ=550 nm dengan spektrofotometer. ilai dilihat dari grafik hubungan antara konsentrasi senyawa bahan uji (μg/ml) dengan intensitas larutan dari viabilitas sel. (4) ASIL DA PEMBAASA. Sintesis senyawa Analog 2-idroksi- -oktilbenzamida Mekanisme reaksi sintetis senyawa analog 2- idroksi--oktilbenzamida mengikuti mengikuti persamaan reaksi yang ditunjukkan pada Gambar 3. Senyawa analog 2-idroksi--oktilbenzamida telah disintesis secara optimal menggunakan bahan baku asam karboksilat aromatik dan amina primer, aktifator DCC, katalis DMAP dan pelarut kloroform secara bersamaan direaksikan selama 24 jam pada suhu 60 0 C dalam alat deanstark sambil dilakukan pengadukan secara terus-menerus. Reaksi pembentukan senyawa 29

4 Jurnal Teknologi Indonesia 33 () 200 disertakan dengan pembentukan produk samping DCU (disikloheksil urea) yang dapat dihilangkan melalui penyaringan. DMAP C 6 C C 6 DCU C 6 C C 6 DCC 2 Asam salisilat ktilamin C C C 6 2-hidroksi--oktil-benzamida DMAP Gambar 3. Mekanisme reaksi pembentukan. Penggunaan secara bersamaan katalis dan aktifator memberikan rendemen produk lebih tinggi dan reaksi berlangsung pada suhu tidak terlalu tinggi. [5] Melalui reaksi tersebut dihasilkan rendemen sebanyak 93% dengan spesifikasi senyawa berbentuk kristal jarum berwarna putih dengan titik leleh C. Untuk analisis produk dilakukan identifikasi adanya kromofor dalam struktur molekulnya menggunakan UV. Kurva absorbsi memberikan serapan maksimal pada titik tertinggi kurva dengan λ max = 246, 298,5 dan 324nm. Absorbsi tersebut terjadi karena transisi π π* ditandai munculnya tiga puncak berasal dari sistem aromatik. Analisis produk untuk penentuan gugus fungsi dilakukan menggunakan FT-IR. asil analisis ditunjukkan seperti pada Tabel. Berdasarkan penafsiran spektrum IR maka senyawa yang telah terbentuk ditemukannya gugus fungsi C= dan amida, C- alifatik, C- aromatik, dan -. Tabel. Daftar daerah spektrum gugus fungsi senyawa Ikatan Daerah absorbsi (υ cm - ) C= 64 - dan C- alifatik C- aril 3223 C=C aril Konfirmasi lebih lanjut terhadap struktur molekul untuk produk yang diperoleh menggunakan analisis spektrum -MR dan 3 C-MR. al ini dilakukan untuk mengatasi problema penentuan struktur suatu senyawa hanya melalui informasi gugus fungsi saja. Informasi pengukuran dari spektrum -MR dapat memberikan deskripsi mengenai bagian hidrokarbon molekul dari nilai pergeseran kimia yang menunjukkan proton untuk masing-masing lingkungan kimia, konstanta kopling (J), dan jumlah proton dari hasil integrasinya. Pengukuran dari spektrum 3 C-MR dapat diketahui jenis karbon primer, sekunder, tersier dan kuartener (-C 3, -C 2 -, C-, -C-, -C, C=, -C-, dan lain-lain) (6). Lihat Gambar 4. Data pergeseran kimia pada Tabel 2. Tabel 2. Data pergeseran kimia (δ, ppm) spektrum -MR dan 3 C-MR senyawa (CDCl 3, 500 Mz) C/ -C- 2 3-C Pergeseran Kimia (δ, ppm) -MR(m*,J dalam z) - - 2,43 (, s) 6,8(, m) 7,36(, m) 6,96(, m) 7,37(, m) 3,42 (2, q),60 (2, m),27 (0, m) 0,87 (3, t, 7,35) 6,48(, d, 4,75) m*=multiplisitas, J = konstanta kopling 2. Bioaktivitas antikanker 3 C-MR 70,0 4,56 6,00 8,67 34,20 8,75 25,47 39,40 3,90 29,37 4,2 - Uji bioaktivitas senyawa analog UK-3A terhadap sel kanker seperti terlihat pada Tabel 3. 30

5 usniati dan Muhammad anafi : Sintesis Senyawa Analog C C- - ' 2' 3' 4' Proton Aromatik 2 C-Aromatik 5' 6' 7' 3-7 C-Alkil Gambar 4. Spektrum -MR dan 3 C-MR Tabel 3. asil uji senyawa analog UK-3A terhadap sel kanker Murine leukemia P388 o. 2 3 Senyawa 2-idroksi--oktilbenzamida cis-platin UK-3A (μg/ ml) 7, adalah nilai penghambatan pertumbuhan sel kanker sebesar 50%. Aktivitas senyawa ditunjukkan dari struktur molekul salisilat/fenol. Gugus fenol yang ada pada senyawa analog diperkirakan mempunyai peranan penting dalam aktivitas. Gugus pada senyawa diduga mempunyai interaksi pengikatan senyawa pada sisi pengikatan (binding site) sel target melalui ikatan hidrogen yang terlibat antara dua molekul yang bekerja sebagai donor dan akseptor. Donor ikatan hidrogen adalah proton dari fenol yang menempel pada atom oksigen yang bersifat elektronegatif dan sebagai akseptornya adalah gugus-gugus yang ada pada sel target/reseptor. [0] Pengaruh gugus hidrokarbon netral dari senyawa ini yang memiliki gugus alkil mempunyai kemampuan untuk cocok/tepat ke dalam kantong hidropobik (hydrophobic pocket) dengan interaksi van der Waals Interaksi tersebut penting untuk pengikatan molekul obat dengan binding site sel. [0] KESIMPULA Senyawa analog UK-3A, 2-hidroksi-oktilbenzamida, disintesis dari asam salisilat dan oktilamina dengan rute reaksi lebih sederhana dan diperoleh rendemen sebanyak 93%. Spesifikasi senyawa analog tersebut berbentuk kristal jarum berwarna putih dengan titik leleh C. Aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker Murine Leukemia P388 memberikan hasil uji =7,5 μg/ml. Senyawa analog UK-3A tersebut mempunyai aktivitas sitotoksik terhadap sel kanker Murine Leukemia P388 lebih tinggi dibandingkan senyawa induk, UK-3A dengan =38 μg/ml. Berdasarkan tabel di atas, senyawa analog 2-idroksi--oktilbenzamida mempunyai aktivitas antikanker leukemia P388 lebih tinggi jika dibandingkan dengan senyawa induk, UK- 3A. Keuntungan senyawa analog yang disintesis ini diperoleh berdasarkan modifikasi struktur molekul senyawa UK-3A induk dengan satu tahap reaksi amida dan mempunyai aktivitas biologi lebih unggul. Aktivitas anti kanker ditunjukkan oleh nilai yang lebih rendah karena UCAPA TERIMA KASI Terima kasih atas bantuan dana penelitian kepada Badan Penelitian dan Pengembangan Industri dan Pusat Pendidikan dan Pelatihan Departemen Perindustrian. DAFTAR PUSTAKA [] Ueki, M., anafi, M., Shibata, K., and Taniguchi, M UK-3A a novel antifungal 3

6 Jurnal Teknologi Indonesia 33 () 200 antibiotics from Streptomyces sp , fermentation, isolation, and biological properties, J. Antibiotic, 49: [2] Taniguchi, M., Shibata, K., Abe, K., Kodama, R., and Uotani, K Jpn. Patent, [3] 3. Ueki, M., anafi, M., Shibata, K., and Taniguchi, M UK-2A, B, C and D novel antifungal antibiotics from Streptomyces sp , structure elucidation. J. Antibiotics, 49: [4] anafi, M., Shibata, K., Ueki, M., and Taniguchi, M UK-2A, B, C, and D: a novel antifungal antibiotics from Streptomyces sp : II. Structural elucidation, J. Antibiotics, 49 (2): [5] Ueki, M., Kusumoto, A., anafi, M., Shibata, K., Tanaka, T., and Taniguchi, M. 997a. UK-3A a novel antifungal antibiotics from Streptomyces sp , fermentation, isolation, structure elucidation and biological properties, J. Antibiotic, 50 (7): [6] Ueki, M. and Taniguchi, M. 997b. The mode of action of UK-2A and UK-3A novel antifungal from Streptomyces sp , J. Antibiotic, 50 (2): [7] Shimono, M., Kamei,., Shibata, T., Inoguchi, K., Itoh,., Ikari, T., and Senda, Total synthesis of the antifungal dilactones UK-2A and UK3A: The determination of their relative and absolute configurations, analog synhesis and antifungal activities. Tetrahedron, 54: [8] Shiomi, K., atae, K., atano,., Matsumono, A., Takahashi, Y., Lin Jiang, C., Tomoda,., Kobayashi, S., Tanaka,., and mura, S A new antibiotic, antimycin A9, produced by Streptomyces sp. K J. Antibiot., 58 (): [9] Usuki Y., Adachi., Fujita K., Ichimura A., Iio., and Taniguchi, M Structure Activity Relationship Studies on UK-2A, a ovel Antifungal Antiniotic from Streptomyces sp Part 5: Roles of the 9-Membered Dilactone-Ring Moiety in Respiratory Inhibition. J. Bioorganic and Medicinial Chemistry Letter, 6: [0] anafi, M Studies of novel antibiotics metabolites from Streptomyces sp Thesis Departemen of Chemistry Faculty of Science. saka City University. saka. [] Patrick, G Instant notes in medicinal chemistry, BIS Scientific Publisher. [2] anafi, M dan Thelma, A. B Sintesis senyawa analog antibiotika UK-3, pengaruh gugus hidroksi terhadap aktivitas biologi. Prosiding Seminar asional II Kimia dalam Pembangunan, oliday Inn. Yogyakarta. [3] anafi, M., Anita, Y., dan Putra, A. M. J Sintesis pengaruh lipofilisitas pada analog UK-3A terhadap aktivitas antikanker leukemia P-388. Seminar IPT. LIPI. Serpong [4] usniati, Sintesis senyawa analog UK-3A: 3-hidroksi--oktilpikolinamida, 2-hidroksi--fenil-benzamida, 3-hidroksi--fenilpikolinamida, dan 2-hidroksi--oktilbenzamida, dan uji bioaktivitas secara in-vitro terhadap sel kanker murine leukemia P-388, Tesis, Magister Sains Ilmu Kimia, Program Pascasarjana U.I, Depok. [5] Sahidin., Cytotoxic properties of oligostilbenoids from the tree barks of hopea dryobalanoides, J. aturforsch, 60: [6] Akitt, J. W An introduction to the fourier transform-multinuclear era, 2 nd ed., Chapman & all Ltd., ew York, USA. 32