SINTESIS SENYAWA ANALOG UK-3A DAN UJI AKTIVITAS SECARA IN VITRO TERHADAP SEL KANKER MURINE LEUKEMIA P-388 UJIATMI DWI MARLUPI

Transkripsi

1 SITESIS SEYAWA AALG UK-3A DA UJI AKTIVITAS SECARA I VITR TERHADAP SEL KAKER MURIE LEUKEMIA P-388 UJIATMI DWI MARLUPI SEKLAH PASCASARJAA ISTITUT PERTAIA BGR BGR 2007

2 PERYATAA MEGEAI TESIS DA SUMBER IFRMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Sintesis Senyawa Analog UK- 3A dan Uji Aktivitas secara In Vitro terhadap Sel Kanker Murine Leukemia P- 388 adalah karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, 4 Desember 2007 Ujiatmi Dwi Marlupi IM G

3 ABSTRACT ovel antibiotics UK-3A that were elucidated as nine-membered ring dilactone derivative have been isolated from the mycelial of Streptomyces sp UK-3A was active to inhibit bacterial and cancer cells growth. Functional groups of hydroxyl, amide, and nine-membered ring dilactone were active groups in the activity test. Analog compounds of UK-3A, i.e. 3-hydroxypicolinyl serine methyl ester, was synthesized. This methyl ester was esterified with pentanoic acid, hexanoic acid, and heptanoic acid to produce 3-hydroxypicolinyl serine methyl penthyl ester (a), 3-hydroxypicolinyl serine methyl hexyl ester (b), and 3- hydroxypicolinyl serine methyl hepthyl ester (c), respectively. These compounds were confirmed with Fourier transformed infrared, liquid chromatography mass spectroscopy, nuclear magnetic resonance spectrometers. In vitro test to Murine leukemia P-388 cells demonstrated that the inhibition to growth of cancer cells with IC 50 for a, b, and c were 39,0; 51,0; and 82,0 µg/ml, repectively. The IC 50 values indicated that the synthesed products were sufficiently potential to be anticancer agent for Murine leukemia P-388 cells. Keywords: anticancer, UK-3A analog, Murine leukemia P-388 RIGKASA Antibiotika baru, yaitu UK-3A, dielusidasi sebagai turunan dilakton cincin beranggota sembilan, diisolasi dari miselium Streptomyces sp dan terbukti aktif menghambat pertumbuhan bakteri dan sel kanker. Gugus fungsi hidroksil, amida, dan dilakton cincin beranggota sembilan merupakan gugus aktif yang terdapat dalam senyawa UK-3A. Telah dilakukan sintesis senyawa analog UK-3A baru, yaitu 3-hidroksipikolinil serin metil ester. Senyawa metil ester ini diesterifikasi menggunakan asam pentanoat, heksanoat, dan heptanoat berturutturut menghasilkan senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil pentil ester (a), 3- hidroksipikolinil serin metil heksil ester (b), dan 3-hidroksipikolinil serin heptil ester (c). Senyawa hasil sintesis dikonfirmasi menggunakan spektrofotometer inframerah tertransformasi Fourier, kromatografi cair spektroskopi massa, dan resonansi magnetik inti. Uji aktivitas senyawa dilakukan secara in vitro terhadap sel kanker Murine leukemia P-388 dan hasilnya memperlihatkan penghambatan pada pertumbuhan sel kanker dengan nilai IC 50 untuk senyawa a, b, dan c masingmasing sebesar 39,0; 51,0; dan 82,0 µg/ml. ilai IC 50 ini menunjukkan bahwa ketiga senyawa hasil sintesis cukup berpotensi sebagai antikanker terhadap sel Murine leukemia P388. Kata kunci: antikanker, analog UK-3A, Murine leukemia P-388

4 @ Hak Cipta milik IPB, tahun 2007 Hak Cipta dilindungi Undang-undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyasunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

5 SITESIS SEYAWA AALG UK-3A DA UJI AKTIVITAS SECARA I VITR TERHADAP SEL KAKER MURIE LEUKEMIA P-388 UJIATMI DWI MARLUPI Tesis Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Kimia SEKLAH PASCASARJAA ISTITUT PERTAIA BGR BGR 2007

6 Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis : Dr. Zaenal A. Mas ud, DEA

7 Judul Tesis ama IM : Sintesis Senyawa Analog UK-3A dan Uji Aktivitas secara In Vitro terhadap Sel Kanker Murine Leukemia P-388 : Ujiatmi Dwi Marlupi : G Disetujui Komisi Pembimbing Prof. Dr. Ir. Suminar S. Achmadi, M.Sc Ketua Dr. Muhammad Hanafi Anggota Diketahui Ketua Program Studi Kimia Dekan Sekolah Pascasarjana Prof. Dr. Ir. Latifah K. Darusman, MS Prof. Dr. Ir. Khairil A. otodiputro, MS Tanggal Lulus: Tanggal Ujian: 4 Desember 2007

8 PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT yang telah melimpahkan rahmat dan karunia-ya sehingga tesis ini dapat diselesaikan. Tesis ini berjudul Sintesis Senyawa Analog UK-3A dan Uji Aktivitas secara In Vitro terhadap Sel Kanker Murine Leukemia P-388 sebagai salah satu syarat yang harus dipenuhi untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Kimia, Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Penulis mengucapkan terima kasih kepada Prof. Dr. Suminar S Achmadi dan Dr. Muhammad Hanafi selaku pembimbing atas semua bimbingan, saran, dan arahannya. Ucapan terima kasih kepada Pusat Penelitian Kimia LIPI, Pusat Penelitian Ilmu dan Teknologi (Puspiptek) yang telah mensponsori penelitian ini. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada ibu, ayah, serta seluruh keluarga, atas doa, dukungan, dan kasih sayangnya. Semoga tesis ini bermanfaat. Bogor, 4 Desember 2007 Ujiatmi Dwi Marlupi

9 RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Banyumas pada tanggal 4 Maret 1982 dari ayah Sumaryo Andi Wibowo, A.Ma.Pd dan ibu Rasiyati, S.Pd. Penulis merupakan putri kedua dari dua bersaudara. Tahun 2000 penulis lulus dari SMU egeri 5 Purwokerto dan pada tahun yang sama lulus seleksi sebagai mahasiswa Universitas Jenderal Soedirman melalui jalur Ujian Masuk Perguruan Tinggi egeri. Penulis memilih Program Sarjana Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Jurusan Kimia. Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten mata kuliah Kimia Dasar pada tahun ajaran 2002/2003 serta mata kuliah Kimia Anorganik 1 pada tahun ajaran 2003/2004. Penulis lulus dari pendidikan sarjana pada tahun Tahun 2005 penulis diterima sebagai mahasiswa Program Studi Kimia, Sekolah Pascasarjana IPB.

10 DAFTAR ISI Halaman ABSTRACT... iii RIGKASA... iii DAFTAR GAMBAR... x DAFTAR TABEL... x DAFTAR LAMPIRA... xi PEDAHULUA... 1 Latar belakang... 1 Tujuan Penelitian... 2 Manfaat Penelitian... 2 TIJAUA PUSTAKA... 3 Senyawa UK-3A... 3 Sintesis Senyawa Analog UK-3A... 5 Perkembangan Sintesis Senyawa Analog UK-3A... 7 Aktivitas Hayati Senyawa UK-3A... 9 Leukemia METDE PEELITIA Waktu dan Tempat Penelitian Alat dan Bahan Prosedur HASIL DA PEMBAHASA Senyawa Analog UK-3A Aktivitas Senyawa Analog UK-3A KESIMPULA SARA DAFTAR PUSTAKA LAMPIRA... 38

11 DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Struktur UK-2A, UK-3A, dan Antimisin A Reaksi sintesis senyawa analog UK-3A Reaksi sintesis senyawa Reaksi sintesis senyawa Senyawa 10, 11, dan Sel kanker leukemia Usulan mekanisme reaksi sintesis tahap Senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester Usulan mekanisme reaksi sintesis senyawa a, b, dan c Senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil pentil ester (a) Senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil heksil ester (b) Senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil heptil ester (c) DAFTAR TABEL Halaman 1. Aktivitas sitotoksik senyawa UK-3A, UK-2A, dan Antimisin A Aktivitas sitotoksik ilai Rf hasil KLT produk reaksi tahap Geseran kimia (δ, ppm) spektrum 1 H-MR dan 13 C-MR untuk senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester (CDCl 3, 500 MHz) ilai Rf hasil KLT produk reaksi tahap Geseran kimia (δ, ppm) spektrum 1 H-MR dan 13 C-MR untuk senyawa a (CDCl 3, 500 MHz) Geseran kimia (δ, ppm) spektrum 1 H-MR dan 13 C-MR untuk senyawa b (CDCl 3, 500 MHz) Geseran kimia (δ, ppm) spektrum 1 H-MR dan 13 C-MR untuk senyawa c (CDCl 3, 500 MHz)... 30

12 9. Aktivitas senyawa a, b, c, dan UK-3A terhadap sel kanker Murine leukemia P DAFTAR LAMPIRA Halaman 1. Kromatogram dan spektrum LC-MS senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester, senyawa a, b, dan c Spektrum FT-IR senyawa serin metil ester hidroklorida, 3-hidroksipikolinil serin metil ester, senyawa a, b, dan c Spektrum 1 H-MR senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester, senyawa a, b, dan c Spektrum 13 C-MR senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester, a, b, dan c Aktivitas secara in vitro terhadap sel kanker Murine leukemia P

13 PEDAHULUA Latar Belakang Senyawa yang mempunyai aktivitas sebagai antibiotika baru, yaitu UK-2A sebagai komponen utama dan UK-3A sebagai komponen minor, telah diisolasi dari miselium Streptomyces sp dan dielusidasi (Ueki et al. 1996). Penelitian Ueki et al. pada tahun 1997a menyatakan bahwa senyawa UK-3A memiliki aktivitas sebagai antibiotik, antifungal, dan antikanker. UK-3A memiliki potensi sebagai antikanker, tetapi aktivitasnya masih kurang tinggi. Hal ini mendorong perlunya penelitian untuk mensintesis senyawa analog UK-3A yang lebih sederhana dan memiliki aktivitas tinggi sebagai antikanker dengan cara memodifikasi gugus aktif pada senyawa induk UK-3A. Aktivitas yang cukup tinggi pada senyawa UK-3A ditunjukkan oleh gugus hidroksi (H) dan amida (CH). Kedua gugus ini menunjukkan aktivitas menghambat pertumbuhan bakteri dan sel kanker. Aktivitas yang cukup tinggi juga ditunjukkan oleh gugus dilakton atau ester yang merupakan gugus yang mempunyai sifat sebagai gugus hidrofobik (Hanafi 1997a). Sintesis senyawa analog UK-3A dapat dilakukan dengan modifikasi pada gugus aktif yang diharapkan dapat meningkatkan aktivitas senyawa. Penelitian untuk menemukan senyawa antikanker baru dengan aktivitas yang tinggi sangat diperlukan, mengingat penyakit kanker telah semakin meluas dan menjadi penyakit yang mendunia. Kanker merupakan salah satu penyebab kematian yang paling sering dan kasus penderita kanker semakin bertambah (Abdulah et al. 2005). Kanker dapat dipicu oleh kebiasaan hidup yang tidak baik, pencemaran lingkungan, efek radiasi, dan karsinogen kimia. Semakin banyak jumlah penderita kanker yang perlu diatasi, salah satunya dengan meningkatkan pemenuhan kebutuhan akan obat-obatan. Kebutuhan obat dapat dipenuhi dari berbagai sumber di antaranya hasil sintesis kimia, semisintetik, tumbuh-tumbuhan, hewan, dan mikroorganisme. Sejak abad ke-19 telah banyak digunakan bahan alami secara empirik untuk pengobatan. Bahan alami untuk obat ini mulai dikembangkan dengan cara isolasi

14 senyawa aktif, identifikasi struktur molekul, dan selanjutnya diupayakan untuk dibuat melalui sintesis (Siswandono & Soekardjo 1995). Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan 1. Mensintesis senyawa analog UK-3A baru, yaitu senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil pentil ester (a), 3-hidroksipikolinil serin metil heksil ester (b), dan 3-hidroksipikolinil serin metil heptil ester (c) dengan cara memodifikasi gugus aktif senyawa induk UK-3A. 2. Memperoleh senyawa antikanker yang efektif terhadap sel kanker Murine leukemia P-388. Manfaat Penelitian Hasil penelitian ini diharapkan berma nfaat sebagai obat antikanker baru yang memiliki aktivitas tinggi. Senyawa yang dihasilkan diharapkan dapat digunakan sebagai calon obat antikanker yang bermanfaat untuk penyembuhan penyakit kanker yang masih sulit diatasi.

15 TIJAUA PUSTAKA Senyawa UK-3A Selama tahun 1993 sampai 1997 telah berhasil dilakukan isolasi senyawa baru, yaitu benzokazol sitotoksik UK-1 dan antifungal UK-2A, B, C, dan D, dari Streptomyces sp (Hanafi et al. 1996). Senyawa aktif juga diperoleh pada ekstrak aseton dari miselium Streptomyces sp Senyawa aktif ini disebut UK-3A yang mempunyai aktivitas sebagai antifungal dan antibiotik. Senyawa UK-3A merupakan kristal tidak berwarna dan berbentuk jarum. Senyawa UK-3A juga menunjukkan aktivitas sebagai antibakteri dan antikanker (Ueki et al. 1996). UK-3A mempunyai sruktur yang hampir sama dengan struktur UK-2A (Gambar 1). Struktur UK-2A dan UK-3A hanya berbeda pada gugus metoksi yang terikat pada cincin pikolinat sehingga UK-3A dielusidasi sebagai demetoksi UK- 2A (Ueki et al. 1997a). Struktur senyawa UK-3A juga mempunyai kemiripan dengan struktur senyawa antibiotik yang sudah ditemukan sebelumnya, yaitu Antimisin A 3 yang diisolasi dari Streptomyces sp. K (Shiomi et al. 2005). Antimisin A 3 diketahui sebagai antibiotik dan berperan dalam apoptosis melalui jalur intrinsik pada sel kanker. Antimisin A 3 dapat menginduksi apoptosis sel leukemia HL-60. R H H H H H H UK-2A : R = Me UK-3A : R = H Antimisin A 3 Gambar 1 Struktur UK-2A, UK-3A, dan Antimisin A 3

16 Sintesis senyawa analog UK-3A dilakukan dengan mempelajari korelasi antara struktur dan aktivitas hayatinya, yang dapat diperoleh dari data metilasi dan hidrolisis senyawa UK-2A yang mempunyai struktur dan aktivitas hampir sama dengan senyawa UK-3A. Kajian mengenai hubungan struktur dan aktivitas hayati senyawa UK-2A, UK-3A, dan turunannya bertujuan mendapatkan informasi mengenai gugus-gugus yang berperan dalam aktivitas hayati (Hanafi 1997a). Hasil yang diperoleh diharapkan dapat disintesis senyawa analog dengan struktur yang lebih sederhana dan mempunyai aktivitas lebih tinggi jika dibandingkan dengan senyawa UK-3A induk. Metilasi senyawa UK-2A dengan diazometana menghasilkan senyawa UK-2(Me) dan UK-2(Me) yang mengakibatkan hilangnya aktivitas hayati. Hal ini menunjukkan bahwa gugus hidroksil pada cincin pikolinat dan H pada gugus amida merupakan gugus yang aktif. Senyawa UK-3A tidak mempunyai gugus metoksi, tetapi tidak mengakibatkan hilangnya aktivitas antibakteri, bahkan meningkatkan kemampuan menghambat pertumbuhan sel kanker. Hidrolisis senyawa UK-2A menggunakan HCl kering dan metanol menghasilkan senyawa yang tidak menunjukkan aktivitas hayati. Hal ini membuktikan bahwa dilakton cincin sembilan merupakan gugus aktif yang bersifat lipofilik (Hanafi 1997a). Struktur senyawa UK-3A memiliki gugus hidroksil (H) dan amida (CH) yang merupakan gugus aktif yang mempunyai aktivitas yang cukup tinggi sebagai antibakteri dan antikanker. Aktivitas yang tinggi juga ditunjukkan oleh gugus dilakton atau ester yang merupakan gugus yang bersifat lipofilik (Hanafi 1997a). Berdasarkan hal tersebut, khususnya hubungan antara struktur kimia dan aktivitas hayati, maka dirancang strategi untuk mensintesis senyawasenyawa analog UK-3A dengan cara meragamkan posisi dan jenis gugus hidroksi pada cincin aromatik dan gugus dilakton pada senyawa UK-3A, dengan harapan akan diperoleh senyawa baru dengan bahan dasar yang cukup murah, tetapi memiliki aktivitas yang lebih tinggi (Hanafi & Thelma 1998).

17 Sintesis Senyawa Anolog UK-3A Telah dilaporkan bahwa senyawa UK-3A mempunyai aktivitas sebagai antimikrob, antifungal, dan sitotoksik terhadap beberapa sel kanker (Ueki et al. 1997a), seperti aktivitas yang ditunjukkan oleh senyawa Antimisin A 3 (Liu et al. 2003). Aktivitas sitotoksik yang ditunjukkan oleh senyawa UK-3A masih dipandang kurang sehingga perlu dilakukan sintesis senyawa analog UK-3A yang diharapkan memiliki aktivitas yang lebih tinggi. Sintesis senyawa analog UK-3A dilakukan dengan memodifikasi atau memanipulasi struktur molekul senyawa UK-3A. Modifikasi struktur molekul ini bertujuan mendapatkan senyawa baru yang mempunyai aktivitas lebih tinggi, masa kerja lebih panjang, tingkat kenyamanan lebih besar, efek samping rendah, selektif, dan lebih stabil (Siswandono & Soekardjo 1995). Topliss telah mengembangkan petunjuk nonmatematis, nonstatistik, dan nonkomputer (Widodo 1998), yaitu dengan menggunakan prinsip pendekatan hubungan struktur dalam modifikasi struktur induk suatu molekul yang sudah diketahui aktivitasnya. Hal ini dilakukan sebagai upaya untuk mengoptimumkan aktivitas zat dengan efisien. Modifikasi molekul menurut pendekatan Topliss adalah dengan memasukkan gugus-gugus yang bersifat lipofilik dan sterik pada posisi tertentu pada suatu molekul induk, dengan ramalan akan menghasilkan senyawa yang memberikan aktivitas yang lebih tinggi, sama, atau lebih rendah dibanding aktivitas senyawa induk, kemudian dicari jalur sintesis yang paling menguntungkan. Sintesis senyawa analog UK-3A dicoba dilakukan dengan mengubah gugus dilakton rantai tertutup menjadi rantai terbuka dengan gugus yang mengandung rantai yang memiliki panjang yang berbeda-beda. Peragaman tersebut diharapkan akan memberikan informasi mengenai gugus yang berperan dalam meningkatkan aktivitas senyawa analog UK-3A. Perbedaan sifat lipofilik senyawa diharapkan dapat berpengaruh pada aktivitas hayatinya (Hanafi et al. 1999). Pembukaan cincin dilakton diharapkan dapat mempertinggi aktivitas senyawa ini. Reaksi pembukaan cincin pada UK-2A telah menghasilkan senyawa dengan aktivitas yang cukup tinggi (Usuki et al. 2006). Tahapan reaksi sintesis senyawa analog UK-3A dapat dilihat pada Gambar 2.

18 CH 3 DMAP H HCl.H 2 H + DCC/piridin,55 o H C, 24 jam H H H CH 3 L-serin metil ester hidroklorida 3-hidroksipikolinat 3-hidroksipikolinil serin metil ester RCH DMAP, DCC/kloroform 37 o C, 4 jam H H CH 3 a : R = C 4 H 9 b : R = C 5 H 11 c : R = C 6 H 13 R DCC = disikloheksilcarbodiimida DMAP = dmetil amino piridin Gambar 2 Reaksi sintesis senyawa analog UK-3A (Shimano et al. 1998) Reaksi yang terjadi dalam sintesis senyawa analog UK-3A adalah reaksi esterifikasi dan amidasi. Metode umum untuk sintesis ester adalah dengan mereaksikan alkohol dengan suatu asam karboksilat. Reaksi ini merupakan reaksi reversibel dan berlangsung lambat. Agar reaksi berjalan satu arah dan lebih cepat digunakan katalis asam. RCH + R'H R-CR' + H 2 Agar reaksi menjadi sempurna, dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu dengan menggunakan alkohol berlebih dan cara yang kedua dengan memisahkan air yang terbentuk agar tidak terjadi reaksi sebaliknya. Katalis yang biasa digunakan dalam reaksi esterifikasi adalah asam sulfonat dan asam klorida. Selain itu juga dapat digunakan asam p-toluena sulfonat (ptsh), karbonil diimidazol (CDI), dan dimetil amino piridin (DMAP) (Carey & Sunberg 1990). Disikloheksilkarbodiimida (DCC) adalah suatu aktivator dalam reaksi pembentukan ester yang dapat mengubah asam karboksilat menjadi senyawa pengalkilasi yang reaktif. Bagian terpenting dari DCC adalah gugus imida yang memiliki atom karbon pusat yang kekurangan elektron setelah bereaksi dengan proton dari asam karboksilat sehingga dapat diserang oleh suatu agen nukleofilik dan membentuk spesies asilisourea. Gugus asilisourea ini sangat reaktif karena ikatan antara asil dan oksigen dapat mengubah ikatan rangkap karbon dan nitrogen dari isourea menjadi suatu gugus karbonil yang lebih stabil. leh karena itu pada akhir reaksi akan terbentuk ester dan disikloheksilurea (DCU) sebagai

19 hasil samping penggunaan DCC (March 1992). DCC secara luas juga dikenal berperan dalam pembentukan amida dan sintesis polipeptida dari asam amino (Kurzer & Zadeh 1967). Aktivator DCC umumnya digunakan untuk menggabungkan asam karboksilat dengan amina yang menghasilkan amida. DMAP (4-,-dimetilaminopiridin) merupakan suatu katalis nukleofil yang memiliki efek yang cukup kuat. Gugus dimetilamino berfungsi sebagai suatu substituen donor elektron yang meningkatkan sifat basa dari nitrogen piridin (Carey & Sunberg 1990). Katalis DMAP dapat dikombinasikan dengan aktivator DCC menghasilkan metode yang berguna untuk meragamkan asam karboksilat agar dapat bereaksi dengan alkohol untuk menghasilkan ester. Perkembangan Sintesis Senyawa Analog UK-3A Modifikasi struktur yang telah banyak digunakan dalam sintesis senyawa analog UK-3A dan UK-2A adalah dengan cara mengubah gugus dilakton cincin beranggota sembilan menjadi rantai terbuka dan meragamkan panjang rantai alifatik (Usuki et al. 2006). Perbedaan gugus aktif akan mempengaruhi aktivitas yang ada pada suatu senyawa. Hal ini telah diteliti, yaitu dengan mempelajari perbedaan aktivitas pada senyawa UK-2A dan UK-3A (Ueki et al. 1997b). Senyawa analog UK-3A yang berhasil disintesis pada tahun 1997 adalah senyawa 1-9. Asetilasi senyawa 1 (3-hidroksipikolinil metil serin ester) dengan anhidrida asetat menghasilkan senyawa 2. Sementara itu, esterifikasi senyawa 1, masing-masing dengan asam 3-fenil propionat, asam heksanoat, dan asam oktanoat menghasilkan senyawa 3, 4, dan 5 (Hanafi et al. 1997b). Senyawa 7, 8, dan 9 diperoleh dengan mereaksikan senyawa 6 (3-hidroksipikolinil etil serin ester) masing-masing dengan asam 3-fenilpropionat, asam heksanoat, dan asam oktanoat (Hanafi et al. 1997c). Reaksi pembentukan senyawa 1-5 dan 6-9 dapat dilihat pada Gambar 3 dan 4.

20 H H HCl.H 2 H + DCC/DMAP CH 3 piridin, 55 o C 24 jam H 1 H CH 3 H 1 RCH DCC/DMAP CH 2 Cl 2, 25 o C, 2 jam H R * Ac2, piridin, DMAP H CH 3 2 * : R = CH 3 C- 3 : R = PhCH 2 CH 2 C- 4 : R = C 5 H 11 C- 5 : R = C 7 H 15 C- Gambar 3 Reaksi sintesis senyawa 1-5 (Hanafi et al. 1997b) H 6 H HCl.H 2 RCH DCC/DMAP CH 2 Cl 2, 25 o C, 2 jam H + DCC/DMAP piridin, 55 o C 24 jam H H R 7 : R = PhCH 2 CH 2 C- 8 : R = C 5 H 11 C- 9 : R = C 7 H 15 C- Gambar 4 Reaksi sintesis senyawa 6-9 (Hanafi et al. 1997c) H 6 H H Uji aktivitas antibiotika senyawa 1-5 terhadap pertumbuhan beberapa jenis spesies bakteri dan jamur dilakukan pada berbagai konsentrasi antara 100 sampai 2000 ppm dengan Antimisin A 3 sebagai kontrol positif. Hasil uji aktivitas senyawa 1 menunjukkan aktivitas dalam menghambat pertumbuhan bakteri Bacillus cereus, Arthrobacter simplex, dan Acetobacter aceti sampai konsentrasi 1000 ppm. Senyawa 2 aktif menghambat pertumbuhan bakteri A. simplex sampai konsentrasi 100 ppm. Senyawa 3 sampai dengan konsentrasi 500 ppm aktif terhadap Escherichia coli, Staphylococcus aureus, B. substilis, B. licheriformis, dan Mycobacterium phlei. Uji aktivitas senyawa 6-9 menunjukkan bahwa semakin panjang rantai alifatik pada gugus ester kemampuan dalam menghambat

21 pertumbuhan bakteri juga meningkat sampai dengan konsentrasi 100 ppm untuk senyawa 7, yaitu terhadap B. steorothermophillus. Agar pembentukan senyawa analog UK-3A menghasilkan rendemen yang tinggi, maka dilakukan optimasi. ptimasi dilakukan dengan cara meragamkan penggunaan katalis dan aktivator. Selain itu juga dilakukan ragam kondisi reaksi, yaitu suhu dan waktu reaksi (Hanafi et al. 1997d). Penelitian mengenai sintesis senyawa analog UK-3A oleh Sherley (1998), menghasilkan senyawa 10, 11, dan 12 (Gambar 5). Hasil uji aktivitas menyatakan bahwa senyawa 10 aktif menghambat pertumbuhan B. substilis, S. aereus, dan C. albicans pada konsentrasi 1000 ppmb sedangkan pada E. coli dapat dihambat pada 500 ppm. Senyawa 11 menghambat E. coli pada 250 ppm, B. substilis sampai 2000 ppm dan 1000 ppm aktif terhadap S. aereus dan C. albicans. Senyawa 12 aktif menghambat pertumbuhan E. coli dan C. albicans dengan konsentrasi 75 ppm dan 250 ppm terhadap B. substilis. H H R H H : R = C 6 H 5 C 2 H 4 12 : R = C 7 H 15 Gambar 5 Senyawa 10, 11, dan 12 (Sherley 1998) Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, dicoba untuk mensintesis senyawa analog UK-3A dengan memodifikasi panjang rantai alifatik pada gugus ester, yaitu dengan rantai pentil, heksil, dan heptil kemudian melakukan uji aktivitas senyawa hasil sintesis terhadap sel kanker Murine leukemia P-388. Aktivitas Hayati Senyawa UK-3A Senyawa UK-3A telah diuji aktivitasnya sebagai antimikrob dan telah terbukti menghambat pertumbuhan khamir dan filamen fungi. Selain itu, sitotoksisitas senyawa UK-3A dan Antimisin A 3 telah diuji secara in vitro terhadap sel murnine leukemia (P-388), mouse melanoma (B-16), human oral

22 epidermoid carcinomai (KB), human colon adenocarcinoma (CL201), dan mouse fibroblast (3T3). Data hasil yang diperoleh, Antimisin A 3 terbukti dapat menghambat pertumbuhan sel kanker dengan IC 50 0,015-0,063 µg/ml, kecuali pada sel 3T3. Senyawa UK-2A dan UK-3A memperlihatkan hasil efek sitotoksisitas yang tidak signifikan dengan IC 50 masing-masing dan µg/ml (Ueki et al. 1997a). Uji aktivitas senyawa UK-3A sebagai antimikrob telah dilakukan oleh Ueki et al. (1997a). Hasil penelitian ini adalah senyawa UK-3A tidak memperlihatkan aktivitas penghambatan pertumbuhan bakteri Gram positif dan Gram negatif sampai konsentrasi 100 µg/ml. Akan tetapi senyawa UK-3A dapat menghambat pertumbuhan beberapa jenis khamir dan filamen fungi. Data yang diperoleh merupakan perbandingan aktivitas senyawa UK-3A, UK-2A, dan Antimisin A 3, yaitu spektrum antimikrob dari senyawa ini hampir mirip. Penelitian lain mengenai uji aktivitas senyawa UK-2A, UK-3A, dan analognya sebagai antifungal telah dilakukan oleh Shimano et al. (1998). Senyawa ini tidak begitu memperlihatkan aktivitas antifungal yang tinggi karena baru memperlihatkan aktivitas sebagai antifungal pada konsentrasi > 100 µg/ml. Aktivitas sitotoksik senyawa UK-3A juga telah diuji terhadap beberapa sel kanker, di antaranya oleh Ueki et al. (1997a) mengenai fermentasi, isolasi, elusidasi struktur, dan uji aktivitas antibiotik senyawa UK-3A dari Streptomyces sp Hasil uji sitotoksisitas senyawa UK-3A dalam penelitian ini dapat dilihat pada Tabel 1. Tabel 1 Aktivitas sitotoksik senyawa UK-3A, UK-2A, dan Antimisin A 3 (Ueki et al. 1997a) Senyawa IC 50 (µg/ml) P-388 B-16 KB CL201 3T3 UK-3A UK-2A Antimisin A 3 0,015 0,02 0,063 0, IC 50 = Inhibition Concentration

23 Aktivitas sitotoksik senyawa UK-3A juga telah dilaporkan oleh Shimano et al. (1998). Senyawa ini diujikan terhadap 3 macam sel kanker, yaitu sel human embrionic lung fibroblast (HEL), sel murine laukemia (P-388), dan sel mouse lymphoma (EL-4). Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa senyawa UK-3A mempunyai aktivitas sitotoksik yang mirip dengan UK-2A, tetapi lebih rendah dari Antimisin A 3. Data hasil uji aktivitas sitotoksik dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2 Aktivitas sitotoksik (Shimano et al. 1998) rganisme uji ED 50 (µg/ml) UK-2A (7R)-UK-2A UK-3A (7R)-UK-3A Antimisin A 3 HEL P < 0,05 EL ,6 > 100 < 0,05 ED 50 = Effective Dose Leukemia Leukemia merupakan salah satu jenis kanker yang terbentuk pada jaringan darah. Leukemia berasal dari bahasa Yunani, yang berarti darah putih. Leukemia pertama kali ditemukan pada tahun 1847 oleh Rudolf Virchow, seorang ahli patologi dari Jerman. Penemuan ini diawali dari adanya ketidaknormalan jaringan pada sumsum tulang belakang. Kelainan ini disebabkan oleh mutasi DA (Princeton University 2001). Sel leukemia dapat dilihat pada Gambar 6. Gambar 6 Sel kanker leukemia (Princeton University 2001) Sel sumsum tulang belakang berfungsi untuk memproduksi sel darah merah dan sel darah putih, yang masing-masing sebagai pembawa oksigen dan melawan penyakit yang menyerang tubuh. Adanya kelainan pada sumsum tulang

24 belakang akan menyebabkan produksi sel darah merah dan sel darah putih mengalami kelainan Leukemia dapat dikelompokkan berdasarkan banyaknya sel yang tidak normal yang terdapat dalam darah. Pengelompokan ini terdiri atas 4, yaitu acute lymphocytic leukemia (ALL), acute myelogenous leukemia (AML), chronic lymphocytic leukemia (CLL), dan chronic myelogenous leukemia (CML). Ciri leukemia akut dapat dilihat dari laju pertumbuhan sel darah yang belum matang dan akan lebih cepat mati, yaitu antara 1 sampai 5 bulan. Leukemia kronis dapat dibedakan berdasarkan adanya kelebihan jumlah sel darah yang telah matang, tetapi tidak normal. Sel ini akan hidup lebih lama dan jumlah sel darah putih yang terbentuk dalam darah sangat banyak (IC Group International, 2004).

25

26 METDE PEELITIA Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini telah dilaksanakan selama 6 bulan, mulai bulan Februari sampai Agustus 2007 bertempat di Laboratorium Bahan Alam Pangan dan Farmasi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Puspiptek Serpong dan Laboratorium Kimia rganik, Institut Teknologi Bandung (ITB). Alat dan Bahan Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain spektrofotometer inframerah (FT-IR) Perkin Elmer, FT-MR 500 MHz, kromatografi cair spektrometri massa (LC-MS), inkubator C 2, mikroskop, freezer -80 C, laminar flow, sentrifus rpm, microplate mixer, microplate reader, lampu UV, pipet multichannel. Bahan yang digunakan antara lain asam 3-hidroksipikolinat (Aldrich 15,230-7 p.a.), L-serin metil ester hidroklorida (Sigma S 5125 p.a.), ninhidrin, asam pentanoat, asam heksanoat (Sigma C 2250 p.a.), asam heptanoat, disikloheksilkarbodiimida (DCC, Sigma D3128 p.a.), dimetil amino piridin (DMAP, Sigma D5640 p.a.), pelat kromatografi lapis tipis (KLT, Merck GF254 0,25 mm), silika gel, cell line Murine leukemia P-388, media RPMI 1640, fetal bovine serum (FBS), kanamisin sulfat, 3-(4,5-dimetiltiazo-2-il-)2,5- difeniltetrazolium bromida (MTT), dan natrium deodesil sulfat (SDS). Prosedur Sintesis tahap 1: pembentukan senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester Senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester disintesis dengan menyediakan sebuah labu dua-leher, kemudian diisi dengan 0,139 g 3- hidroksipikolinat (0,001 mol), 0,454 g aktivator DCC (0,0022 mol), dan 0,049 g katalis DMAP (0,0004 mol). Ke dalam labu ditambah dengan 0,311 g L-serin metil ester hidroklorida (0,002 mol). Campuran divakum selama 1 jam, selanjutnya ditambah 10 ml pelarut piridin melalui septum, kemudian reaksi dilakukan pada suhu 55 C selama 24 jam (Hanafi et al. 1997d). Selama refluks

27 dan setelah reaksi berlangsung, larutan diperiksa secara kualitatif menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dengan fase gerak n-heksana:etil asetat (1:1) untuk mengetahui hasil senyawa yang terbentuk. Penggunaan DCC menyebabkan hasil samping berupa disikloheksil urea (DCU) yang berwujud serbuk putih dan mengganggu pada proses pemurnian. leh karena itu, setelah reaksi selesai tambahkan air, kemudian disaring. Filtrat yang diperoleh diekstraksi dengan dengan diklorometana dan AH 1% sebanyak 3 sampai 4 kali untuk menghilangkan sisa asam. Fase organik dicuci beberapa kali untuk menghilangkan piridin yang tersisa. Pemurnian dilakukan dengan kromatografi kolom dengan fase diam silika gel dan fase gerak n- heksana:etil asetat secara bergradien. Produk yang diperoleh ditimbang dan ditentukan titik lelehnya. Senyawa hasil 3-hidroksipikolinil serin metil ester yang terbentuk diidentifikasi dengan KLT, spektrofotometer FT-IR, LC-MS, 1 H-MR, dan 13 C-MR. Sintesis tahap 2: pembentukan senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil pentil ester (a), 3-hidroksipikolinil serin metil heksil ester (b), dan 3- hidroksipikolinil serin metil heptil ester (c) Reaksi sintesis senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil pentil ester (a), 3- hidroksipikolinil serin metil heksil ester (b), dan 3- hidroksipikolinil serin heptil ester (c) dilakukan dengan menyediakan 3 buah labu-dua leher, kemudian masingmasing diisi dengan 0,096 g 3-hidroksipikolinil serin metil ester (0,0004 mol), 0,248 g aktivator DCC (0,0012 mol), dan 0,024 g katalis DMAP (0,0002 mol). Labu I ditambah dengan 0,065 ml asam pentanoat (0,0006 mol), labu II ditambah 0,075 ml asam heksanoat (0,0006 mol), dan labu III ditambah dengan 0,083 ml asam heptanoat (0,0006 mol). Setiap labu selanjutnya ditambah 10 ml pelarut kloroform. Labu reaksi dialiri dengan gas nitrogen yang berfungsi untuk mengusir gas oksigen yang dapat mengganggu dalam reaksi esterifikasi. Reaksi dilakukan pada suhu ruang selama 4 jam sambil diaduk menggunakan pengaduk magnetik. Produk yang terbentuk dianalisis menggunakan KLT dengan fase diam silika gel dan fase gerak n-heksana:etil asetat (3:1). Hasil reaksi dikeringkan dengan menggunakan rotavapor. Produk yang telah kering dilarutkan dalam

28 diklorometana, kemudian disaring untuk memisahkan DCU sebagai hasil samping dari penggunaan DCC. Filtrat ditambah dengan a 2 C 3 untuk menghilangkan sisa asam dengan membentuk garam, kemudian garam yang terbentuk dipisahkan dengan penyaringan. Filtrat dikeringkan dan dimurnikan menggunakan kromatografi kolom dengan fase diam silika gel dan fase gerak n-heksana:etil asetat secara bergradien. Produk yang diperoleh ditimbang, ditentukan titik lelehnya, dan diidentifikasi menggunakan spektrofotometer FT-IR, LC-MS, 1 H- MR, dan 13 C-MR. Rendemen hasil sintesis dapat diperoleh dengan perhitungan: Bobot hasil sintesis % Rendemen = 100% Bobot teoretis Identifikasi Spektrum FT-IR dari senyawa hasil reaksi diukur dalam bentuk pelet KBr dengan menggunakan instrumen FT-IR spektrofotometer Perkin Elmer. Spektrum MR diukur menggunakan instrumen MR, Unity Inova Variant, 500 MHz. ilai geseran kimia (δ) suatu sinyal diukur dalam satuan ppm. Pengukuran pada 1 H-MR dan 13 C-MR menggunakan pelarut kloroform (CDCl 3 ) dan sebagai standar dalam digunakan tetrametilsilana (TMS) yang memberi nilai geseran kimia pada δ 0,0 ppm. Kromatografi lapis tipis (KLT) analitik dilakukan menggunakan plat KLT silika gel Merck GF254 dengan ketebalan 0,25 mm. Identifikasi pemisahan spot KLT menggunakan lampu UV pada panjang gelombang 254 dan 366 nm, kemudian dideteksi menggunakan pereaksi warna ninhidrin dan dipanaskan pada suhu C. Kromatografi kolom dilakukan menggunakan fase diam silika gel Merck dengan ukuran mesh.

29 Uji aktivitas antikanker secara in vitro terhadap sel murine leukemia P-388 Sel kanker Murine leukemia P-388 dengan pertumbuhan pada fase logaritma, dilarutkan dalam tabung kultur dengan jumlah sel sekitar sel/ml dalam media RPMI Sel diinokulasikan dalam microplate 96 lubang dasar rata dan dikultivasi dalam inkubator C 2 selama 24 jam untuk menumbuhkan sel. Hari kedua dilakukan penambahan sampel yang dilarutkan dalam pelarut DMS. Sampel diencerkan dengan menambahkan larutan bufer fosfat (PBS) ph (7,30 7,65). Sampel dengan konsentrasi yang beragam ditambahkan ke dalam sel dalam microplate lalu dikocok dengan microplate mixer dan disimpan kembali dalam inkubator C 2. Sebagai kontrol negatif digunakan DMS dan kontrol positif digunakan senyawa standar cis-platin. Sel diinkubasi selama 48 jam, kemudian ditambahkan reagen MTT [3-(4,5-dimetil tiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolium bromida] dan dikocok menggunakan microplate mixer. Inkubasi dilanjutkan selama 4 jam, kemudian ditambahkan stop solution (SDS) dan dikocok dengan baik tanpa meninggalkan busa yang mengganggu dalam pengamatan. Inkubasi dilanjutkan kembali selama 24 jam. Pengukuran rapatan optis (D) dilakukan dengan microplate reader, 24 jam setelah penambahan SDS. ilai IC 50 dilihat dari grafik hubungan antara konsentrasi senyawa bahan uji (µg/ml) dan intensitas larutan setelah perlakuan dengan bahan uji. Apabila dilihat di bawah mikroskop, sel hidup berbentuk bulat dengan warna biru, sedangkan sel mati berbentuk tidak teratur. IC 50 merupakan konsentrasi yang diperlukan untuk penghambatan pertumbuhan sel sebesar 50%. Uji aktivitas antikanker ini dilakukan dengan tiga kali ulangan (Alley et al diacu dalam Sahidin et al. 2005).

30 HASIL DA PEMBAHASA Senyawa Analog UK-3A Senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester Rendemen sintesis senyawa 3-hidroksi pikolinil serin metil ester dari asam 3-hidroksi pikolinat dan L-serin metil ester sebagai material awal adalah 42,4%. Rendemen produk reaksi senyawa 3-hidroksi pikolinil serin metil ester yang dilakukan pada penelitian sebelumnya sebesar 68,4% (Hanafi et al. 1997b) dan 61,2% (Arifin 2007). Reaksi ini berlangsung pada kondisi optimum, yaitu pada suhu 55 C selama 24 jam menggunakan aktivator disikloheksilkarbodiimida (DCC), katalis dimetil amino piridin (DMAP), dan pelarut piridin (Hanafi et al. 1997d). Reaksi sintesis senyawa 3-hidroksi pikolinil serin metil ester dalam penelitian ini menghasilkan rendemen yang masih rendah karena reaksi belum sempurna. Hal ini dibuktikan dengan hasil analisis kromatografi lapis tipis (KLT) menggunakan eluen n-heksana:etil asetat (1:1) yang memperlihatkan adanya 4 spot yang menunjukkan masih ada hasil samping reaksi dan sisa reaktan yang belum bereaksi. ilai Rf dari keempat spot dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3. ilai Rf hasil KLT produk reaksi tahap 1 Spot Rf Keterangan hidroksipikolinat 2 0,176 3-hidroksi pikolinil serin metil ester 3 0,544 produk samping 4 0,882 produk samping Spot produk senyawa 3-hidroksi pikolinil serin metil ester merupakan spot paling dominan dengan Rf 0,176. Spot produk ini berupa spot berwarna ungu, mirip dengan spot standar 3-hidroksi pikolinat, tetapi spot senyawa 3-hidroksi pikolinil serin metil ester ini memiliki nilai Rf yang lebih tinggi dibanding spot standar 3-hidroksipikolinat karena bersifat lebih nonpolar. Spot dengan Rf 0 merupakan bahan baku 3-hidriksipikolinat yang tersisa karena tidak bereaksi. Spot

31 dengan Rf 0,544 dan Rf 0,882 merupakan produk samping reaksi. Produk samping reaksi dapat terbentuk karena adanya reaksi yang tidak spesifik, sehingga terjadi reaksi pada gugus aktif lain yang tidak diinginkan (Arifin 2007). Reaksi sintesis tahap 1 merupakan reaksi amidasi yang diajukan mengikuti mekanisme seperti pada Gambar 7. + H.. H 3-hidroksipikolinat C 6 H 11 C C 6 H 11 DCC H.. C 6 H 11 H C DMAP C 6 H 11 H H + C 6 H 11 H C H C6 H 11 DCU ClH: H H CH 3 L-serin metil ester hidroklorida H + + H (-) H H _ H CH 3.. DMAP H H H CH 3 3-hidroksipikolinil serin metil ester Gambar 7 Usulan mekanisme reaksi sintesis tahap 1 Hasil reaksi sintesis senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester sebelum pemurnian berupa larutan berwarna coklat bercampur dengan padatan putih disikloheksil urea (DCU) yang merupakan hasil samping dari penggunaan aktivator DCC (March 1992). Hasil reaksi dipisahkan dari DCU dengan penyaringan. Flitrat yang dihasilkan kemudian dibebaskan dari pelarut menggunakan evaporator. Hasil reaksi dilarutkan dalam diklorometana, kemudian ditambahkan 1% ah untuk menetralkan HCl yang dilepaskan dari L-setin metil ester hidroklorida. ah juga berfungsi mengikat asam pikolinat yang

32 tersisa sehingga membentuk garam. Larutan diekstraksi menggunakan diklorometana dan air agar sisa pelarut piridin, DMAP, garam acl, dan garam pikolinat yang bersifat polar akan larut dalam air dan produk reaksi larut dalam diklorometana (Hanafi et al. 1997d). Senyawa hasil samping dipisahkan dari produk senyawa 3- hidroksipikolinil serin metil ester dengan kolom kromatografi yang menggunakan fase diam silika gel dan fase gerak n-heksana:etil asetat secara bergradien. Fraksifraksi dengan spot yang memiliki nilai Rf 0,176 digabungkan, kemudian pelarut diuapkan. Senyawa yang dihasilkan berupa kristal jarum berwarna putih dengan titik leleh C. Kristal tersebut dapat dikatakan murni karena dalam analisis menggunakan KLT menunjukkan 1 spot. Senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester memiliki jarak leleh yang sempit, yaitu sebesar 1 C yang menunjukkan senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester hasil sintesis ini merupakan senyawa yang telah murni karena senyawa organik dikatakan murni jika jarak lelehnya sempit, yaitu antara 0,5-2 C (Cheronis 1963 diacu dalam Arsianti 1998). Senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester hasil sintesis penelitian terdahulu memiliki titik leleh C (Arifin 2007). Analisis menggunakan LC-MS terhadap senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester menghasilkan 1 puncak pada kromatogram dengan area (Lampiran 1). Kemurnian senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester mendekati 100% karena tidak terdapat puncak lain yang memiliki area yang cukup berarti pada kromatogram. Puncak dominan ini muncul pada waktu retensi 4,02 menit (T4.0). Spektrum massa menghasilkan nilai bobot molekul (m/z) sebesar 240,887 g/mol yang merupakan bobot molekul senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester. ilai bobot molekul hasil pengukuran senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester pada penelitian sebelumnya adalah 240,270 g/mol dengan kemurnian senyawa mendekati 100 % (Arifin 2007). Spektrum FT-IR senyawa L-serin metil ester hidroklorida sebagai material awal (Lampiran 2) menunjukkan pita-pita serapan antara lain pada bilangan gelombang 3350 cm -1 yang merupakan serapan lebar dari vibrasi ulur H, bilangan gelombang 1743 cm -1 yang merupakan vibrasi ulur gugus karbonil (C=) ester, dan 1448 cm -1 merupakan vibrasi tekuk C- (Silverstein et al. 1986).

33 Spektrum FT-IR untuk senyawa hasil sintesis 3-hidroksipikolinil serin metil ester menunjukkan pita serapan baru pada 1634 cm -1 yang merupakan vibrasi ulur karbonil (C=) dari amida dan serapan ganda pada cm -1 yang merupakan vibrasi ulur H dari amida (Silverstein et al.1986). Hasil analisis juga menunjukkan masih adanya vibrasi ulur karbonil (C=) ester pada 1735 cm - 1 dan serapan pada 3186 cm -1 yang menunjukkan vibrasi ulur H (Lampiran 2). Hasil analisis FT-IR ini menunjukkan senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester telah terbentuk karena adanya serapan-serapan baru yang menunjukkan ada gugus amida yang tidak terdapat pada spektrum FT-IR senyawa L-serin metil ester hidroklorida sebagai material awal. Hasil analisis FT-IR ini juga sesuai dengan spektrum FT-IR senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester yang pernah dilakukan sebelumnya (Hanafi et al. 1997b). Spektrum hasil analisis senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester menggunakan spektrometer 1 H-MR (Lampiran 3) dan 13 C-MR (Lampiran 4) dapat ditunjukkan dalam Tabel 4 dan menggunakan panduan Gambar H 2 Gambar 8 Senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester H 2' 1' 3' H 1"'

34 Tabel 4 Geseran kimia (δ, ppm) spektrum 1 H-MR dan 13 C-MR untuk senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester (CDCl 3, 500 MHz) Pergeseran Kimia (δ, ppm) C/H 1 H-MR (J dalam Hz) 13 C-MR 1 3,83 (s, 3H, CH 3 ) 53, ,48 2 4,83 (dt, 1H, CH, J = 3,7; 7,3) 54,37 3 4,06 (dd, 1H, CH 2, J = 3,7; 11,6) 63,36 4,13 (dd, 1H, CH 2, J = 3,7; 11,6) 3 -H 2,55 (t,1h, 3 -H, J = 6,1) - CH 8,72 (d, 1H, CH, J = 7,3) 169, , ,99 4 7,31 (dd, 1H, CH, J = 8,6; 4,3) 126,39 5 7,36 (dd, 1H, CH, J = 4,3; 1,3) 129,21 6 8,10 (dd, 1H, CH, J = 8,6; 1,3) 140,09 3-H 11,69 (s, 1H, 3-H) - Pembentukan amida pada hasil reaksi sintesis senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester didukung oleh data spektrum 1 H-MR (500 MHz, CDCl 3 ), yaitu dengan munculnya sinyal pada geseran kimia 8,72 (d, CH, J 7,3) yang menunjukkan proton pada gugus amida. Proton aromatik pada cincin pikolinat ditunjukkan oleh sinyal pada 7,31 (dd, 1H, H-4, J 8,6; 4,3), 7,36 (dd, 1H, H-5, J 4,3; 1,3), dan 8,10 (dd, 1H, H-6, J 8,6; 1,3). Tetapan kopling untuk H-6 terhadap H-5, yaitu 1,3 Hz merupakan tetapan kopling untuk proton aromatik heteroatom pada posisi orto dan meta yang kisaran tetapan koplingnya adalah 1-5 Hz. Tetapan kopling untuk H-6 terhadap H-4 adalah 8,6 Hz yang ada dalam kisaran 1 sampai 9 Hz yang merupakan tetapan kopling untuk proton aromatik heteroatom pada posisi orto dan para. Tetapan kopling untuk H-5 terhadap H-4 sebesar 4,3 Hz yang kisaran koplingnya masuk pada tetapan kopling untuk posisi meta dan para, yaitu 1-6 Hz (Jenie et al. 2006). Sinyal pada 4,83 (dt, 1H, CH, J 3,7; 7,3), 4,06 (dd, 1H, CH 2, J 3,7; 11,6 ), 4,13 (dd, 1H, CH 2, J 3,7; 11,6), 3,83 (s, 3H, CH 3 ), dan 2,55 (t,1h, 3 -H, J 6,1) menunjukkan adanya serin metil ester. Spektrum 13 C-MR yang mendukung data terbentuknya gugus amida pada produk senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester antara lain sinyal pada 169,14 ppm yang merupakan geseran kimia untuk karbon CH. Cincin pikolinat C2-C5 ditunjukkan oleh geseran kimia karbon pada 129,21-157,99 ppm.

35 Karbon-karbon pada serin metil ester memiliki nilai geseran kimia C1 -C3 berturut-turut pada 170,48; 54,37; dan 63,36 ppm, serta C1 pada 53,16 ppm yang merupakan geseran kimia gugus metoksi. ilai geseran kimia 1 H-MR dan 13 C-MR senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester ini sesuai dengan geseran kimia senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester penelitian sebelumnya (Arifin 2007). Geseran kimia senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester ini telah dikonfirmasi strukturnya dan diestimasi 1 H-MR dan 13 C-MR menggunakan program ChemDraw Ultra 5.0. Senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil pentil ester (a), 3-hidroksipikolinil serin metil heksil ester (b), dan 3-hidroksipikolinil serin metil heptil ester (c) Reaksi sintesis tahap kedua untuk menghasilkan senyawa analog UK-3A, yaitu senyawa a, b, dan c dilakukan dengan mereaksikan senyawa hasil sintesis tahap pertama, yaitu 3-hidroksipikolinil serin metil ester dengan asam pentanoat untuk membentuk senyawa a, asam heksanoat untuk membentuk senyawa b, dan asam heptanoat untuk membentuk senyawa c. Rendemen hasil sintesis dari ketiga senyawa ini secara berturut-turut sebesar 32,2; 36,4; dan 38,8%. Rendemen sintesis tahap kedua masih rendah, hal ini disebabkan reaksi tidak berjalan sempurna dan dibuktikan dari adanya spot bahan awal, yaitu senyawa 3- hidroksipikolinil serin metil ester masih tersisa. Usulan mekanisme reaksi sintesis senyawa a, b, dan c dapat dilihat pada Gambar 9. Perpanjangan rantai ester pada sintesis a, b, dan c ini dilakukan untuk menggantikan cincin dilakton, sementara cincin dilakton merupakan gugus yang berperan dalam aktivitas hayati senyawa UK-3A (Hanafi 1997a). Perpanjangan rantai ini bertujuan mendapatkan senyawa yang lebih aktif dengan cara meningkatkan lipofilitas senyawa. Lipofilitas senyawa akan berpengaruh pada kemampuan senyawa dalam menembus dinding sel kanker yang tersusun dari fosfolipid yang bersifat nonpolar (Hanafi et al. 1999).

36 C 6 H 11 + R H C C 6 H 11 DCC DMAP - R.... C 6 H 11 H C H + + C 6 H 11 + R + + C 6 H 11 H C H C6 H 11 DCU + R H.. H 3 C H H (-) R :.. : - H 3 C H H - DMAP H H CH 3 R a : R = C 4 H 9 b : R = C 5 H 11 c : R = C 6 H 13 Gambar 9 Usulan mekanisme reaksi sintesis senyawa a, b, dan c Analisis KLT terhadap produk reaksi, yaitu senyawa a, b, dan c menggunakan eluen n-heksana:etil asetat (3:1) menunjukkan reaksi yang belum sempurna yang dapat dilihat dari munculnya 2 spot untuk setiap hasil reaksi (Tabel 5).

37 Tabel 5 ilai Rf hasil KLT produk reaksi tahap 2 Produk sintesis Rf Keterangan Senyawa a Spot ke-1 = 0,088 3-hidroksipikolinil serin metil ester Spot ke-2 = 0,440 produk senyawa a Senyawa b Spot ke-1 = 0,088 3-hidroksipikolinil serin metil ester Spot ke-2 = 0,500 produk senyawa b Senyawa c Spot ke-1 = 0,088 3-hidroksipikolinil serin metil ester Spot ke-2 = 0,557 produk senyawa c Spot senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester sebagai bahan awal ditunjukkan oleh spot dengan nilai Rf 0,088. Produk reaksi, yaitu senyawa a, b, dan c secara berturut-turut memiliki nilai Rf 0,440; 0,500; dan 0,557. ilai Rf produk reaksi ini cenderung semakin meningkat karena kepolaran senyawa semakin menurun. Hasil analisis KLT terhadap senyawa 3-hidroksipikolinil serin metil ester menggunakan eluen n-heksana:etil asetat (2:1) yang dilakukan pada penelitian sebelumnya menunjukkan nilai Rf 0,175. Hasil sintesis terdahulu, yaitu senyawa β-hidroksi pikolinil serin metil oktanoil ester (PSME) yang memiliki struktur mirip dengan senyawa a, b, dan c, hanya berbeda pada panjang rantai alifatik pada gugus ester memiliki nilai Rf 0,75 menggunakan eluen n-heksana:etil asetat (2:1) (Arifin 2007). Hasil reaksi sintesis senyawa a berupa larutan berwarna kuning jernih, senyawa b berupa larutan jernih, dan c berupa larutan kuning jernih. Pemurnian dilakukan menggunakan kolom kromatografi dan menghasilkan senyawa a yang berupa seperti minyak (oily) berwarna kuning jernih, senyawa b berupa minyak berwarna kuning, dan c berupa minyak berwarna putih. Hasil analisis LC-MS senyawa a menunjukkan adanya 1 puncak, b muncul 2 puncak, dan c muncul 2 puncak. Puncak senyawa a muncul pada kromatogram pada waktu retensi 6,04 menit (T6.0) dengan area sebesar 17526,44 yang merupakan produk senyawa a. Hal ini dibuktikan dari nilai bobot molekul (m/z) sebesar 324,89 g/mol yang merupakan bobot molekul senyawa a, muncul pada serapan spektroskopi massa. Kemurnian senyawa hasil sintesis mendekati 100 %. Kromatogram senyawa a memperlihatkan tidak ada puncak lain yang

38 berarti dan hanya ada 1 puncak dominan. Kromatogram senyawa b menunjukkan adanya 2 puncak. Puncak dominan pada kromatogram senyawa b muncul pada waktu retensi 7,56 menit (T7.4) dengan area sebesar 70020,0 yang merupakan produk senyawa b. Hal ini dibuktikan dari nilai bobot molekul (m/z) sebesar 338,91 g/mol yang merupakan bobot molekul senyawa b. Puncak kedua muncul pada waktu retensi 11,77 menit (T11.7) dengan area sebesar 20258,1 yang merupakan pengotor atau hasil samping reaksi yang masih tersisa pada produk. Senyawa yang muncul pada puncak kedua ini memiliki nilai bobot molekul (m/z) sebesar 323,04 g/mol. Kemurnian senyawa hasil sintesis adalah sebesar 77,56%. Kromatogram senyawa c memperlihatkan adanya 2 puncak. Puncak dominan senyawa c muncul pada waktu retensi 8,13 menit (T8.0) dengan area sebesar 56656,2 yang merupakan produk c. Hal ini dibuktikan dari nilai bobot molekul (m/z) sebesar 352,96 g/mol yang merupakan bobot molekul senyawa c. Puncak kedua muncul pada waktu retensi retensi 14,59 menit (T14.4) dengan area 2038,6 yang merupakan pengotor atau hasil samping reaksi yang masih tersisa pada produk. Senyawa pengotor ini memiliki bobot molekul (m/z) sebesar 337,09 g/mol. Kemurnian senyawa hasil sintesis c cukup tinggi, yaitu sebesar 96,53%. Spektrum FT-IR untuk senyawa a, b, dan c (Lampiran 2) memiliki kemiripan karena semua gugus fungsi yang terdapat dalam ketiga senyawa ini sama. Spektrum FT-IR untuk a menunjukkan pita serapan pada 1745 cm -1 yang merupakan vibrasi ulur karbonil (C=) dari ester, 1653 cm -1 yang merupakan vibrasi ulur karbonil (C=) dari amida, dan serapan tunggal pada 3371 cm -1 yang merupakan vibrasi ulur H dari amida sekunder. Hasil analisis juga menunjukkan adanya vibrasi ulur CH alifatik pada cm -1. Spektrum FT-IR senyawa b menunjukkan pita serapan pada 1745 cm -1 yang merupakan vibrasi ulur karbonil (C=) dari ester, vibrasi pada 1651 cm -1 yang merupakan vibrasi ulur karbonil (C=) pada gugus amida, dan serapan tunggal pada 3327 cm -1 yang merupakan vibrasi ulur H dari amida sekunder. Hasil analisis senyawa b juga menunjukkan adanya vibrasi ulur CH alifatik pada cm -1 yang menunjukkan terbentuknya rantai alifatik pada ester yang baru. Spektrum FT-IR untuk senyawa c menunjukkan pita serapan pada 1747 cm -1 yang merupakan vibrasi ulur karbonil (C=) dari ester, 1653 cm -1 merupakan vibrasi ulur karbonil (C=) pada