METODE. Bahan IID : Temet 0,2 ml dan ditambah aquadestilata 100 ml.

Transkripsi

1 METODE Waktu da Tempat Idetifikasi keragama geetik protei darah itik Pegaga, Alabio da Mojosari dilaksaaka pertegaha September sampai dega Desember Peelitia dilakuka di Laboratorium Geetika Molekuler Terak, Bagia Pemulia da Geetika Terak, Fakultas Peteraka, Istitut Pertaia Bogor. Materi Sampel Darah Materi darah yag diguaka dalam peelitia ii sebayak 30 sampel, yag terdiri dari :10 sampel itik Pegaga, 10 sampel itik Alabio da kemudia 10 sampel itik Mojosaril.Sampel darah yag diguaka didalam peelitia ii merupaka koleksi dari Ibu Dr. Ir. Meisji Liaa Sari, M.Si. Polyacrylamide Gel Electrohoresis (PAGE) Gel elektroforesis terdiri dari gel pemisah da gel peggertak. Gel pemisah merupaka gel yag dicampurka dari beberapa baha diataraya baha IA, IB, IC, da ID. Masig-masig ba ha terdiri dari : Baha IA : 39,0 g acrylamide; 1,0 g bis Acrylamide; 20,0 mlglycero da aquadestilata sampai 100 ml. Baha IB : 9,15 g tris; 3 ml HCL da aquadestilata sampai 100 ml. Baha IC : 0,2 g ammoium persulfat da aquadestilata sampai 100 ml Baha ID : Temed 400 ml da ditambah aquadestilata sampai 100 ml Gel peggertak merupaka gel yag dicampurka dari beberapa baha diataraya baha IIA, IIB, IIC da IID. Masig-masig baha terdiri dari: Baha IIA : 38,0 g acrylamide; 2,0 g bis acrylamide; 20,0 ml glycerol da aquadestilata sampai 100 ml. Baha IIB : 1,5 g Tris; 1 ml HCL, da aquadestilata higga 100 ml. Baha IIC : 0,4 g ammoium persulfat da aquadestilata sampai 100 ml. Baha IID : Temet 0,2 ml da ditambah aquadestilata 100 ml. Buffer Elektroda Buffer elektroda yagdiguaka terdiri dari 1,5 g tris, 7,2 g glycie da ditambahka aquadestilata 100 ml. 27

2 Pewaraa Protei Baha-baha ut uk pewaraa utuk pe et ua pita protei yagdiguaka terdiri dari baha pewara plasma da baha pecuci. protei trasferri, albumi, post albumi, post-trasferri 1 da post-trasferri 2 pada plasma darah diguaka amido blade 10B, 0,5 g, methaol 25 ml, asam asetat 5 ml ditambah aquadestilata 100 ml.baha utuk laruta pecuci terdiri dari aquadestilata ml, methaol 150 ml, da 50 asam asetat. Pros edur Pega mbila Sampel Darah Pegambila sampel darah itik sebayak 0,3-0,4 cc per ekordilakuka megguaka Veoject lalu dimasukk a kedalam tabug vaccutaier yag dimasukka kedalam termos es da disimpa dalam suhu 4 o C. Preparas i Sampel Darah disetrifugasi dega kecepata rpm selama 30 meit. Plasma yag terbetuk kemudia dipidahka ke tabug de ga ukura 1,5 ml da disimpa pada suhu 4 o C sampai dilakuka pemisaha protei megguaka metode elektroforesis. Proses preparasi sampel ditampilka pada Gambar 4. Gambar 4. Preparasi Sampel Darah Itik Elektroforesis Protei Darah Elektroforesis protei plasma darahdilakuka megguaka preparat elektroforesis EP-155 (Advatec) pada arus 25 ma dega tegaga 150 V selama 1 jam 20 meit (PS300, Advatec). Gel yag diguaka merupaka stackig PAGE dega ko setrasi 5% da 3%. 28

3 Visualisasi da Geotypig Visualisasi pita protei pada stackig PAGE dilakuka dega megguaka pewara Coomassie Brilliat Blue 250 R sebayak 1,25 g, methaol 225 ml, asam asetat 50 ml, dry water ( DW ) 500 ml. Selajutya gel dicuci dega megguaka methaol sampai mucul pita selama 15 meit. Geotypig dilakuka dega mesejajarka pita-pita protei pada gel. Protei yag diamati meliputi Albumi (Alb), Post Albumi (PAlb), Trasferri (Tf), Post Trasferri-1 (PTf-1), Post Trasferri -2 (PTf-2). Geotypig yag dilakuka megikuti Nozawa et al. (1981) (Gambar 5). Gambar 5. Pola Pita Protei Darah Albumi, Post Albumi, Trasferri Hemoglobi (Nozawa et al., 1981) Aalisis Data Frekuesi Geot ipe Frekuesi geotipe merupaka rasio dari jumlah suatu geotipe terhadap jumlah geotipe pada populasi. Model matematika frekuesi geot ipe yag diguaka adalah (Nei da Kumar, 2000): X ii= 29

4 Keteraga: X ii ii = frekuesi geot ipe ke ii = jumlah sampel bergeotipe ii N = jumlah seluruh sampel Frekuesi Alel Frekuesi alel merupaka rasio relatif suatu alel terhadap keseluruha alel pada suatu lokus dalam populasi. Model matematika ya g diguaka utuk meghitug frekuesi alel meurut Nei da Kumar(2000): Keteraga : X i ii ij = frekuesi alel ke i X i = jumlah sampel yag bergeotipe ii = jumlah sampel yag bergeotipe ij = N = jumlah seluruh sampel Hukum Keseimbaga Hardy-Weiberg Pegujia frekuesi geotipe atara hasil pegamata da harapa diukur dega megguaka uji Chi-Kuadrat (Nei da Kumar, 2000): = Keteraga: = Chi-Kuadrat O = ilai pegamata E = ilai harapa = sigma (jumlah dari ilai-ilai) Suatu populasi dikataka seimbag jika ilai yag didapatka lebih kecil dibadigka tabel pada selag kepercayaa 5% da derajat bebas tertetu. Sebalikya suatu populasi dikataka tidak seimbag jika ilai yag didapatka lebih besar dibadigka tabel pada selag kepercayaa 5% da derajat bebastertetu. 30

5 Heterozigositas Tigkat keragama geetik dalam sebuah populasi biasaya diukur dega rataa keaekaragama ge, yag serig disebut rataa heterozigositas (Weir, 1996). Keragama ge pada lok us dihitug dega rumus : H = Keteraga: H = ilai heterozigositas N1ij= jumlah idividu heterozigot pada lokus ke-i N = jumlah idividu yag diamati Jarak Geetik da Poho Filoge etik Jarak geetik da poho kekerabata dibuat dega metodeupgma meurut Nei da Kumar(2000). megguaka 31