Konsentrasi Konsentrasi Kultur campuran bakteri kandidat resisten antibiotik. Kultur murni kandidat bakteri resisten antibiotik

Transkripsi

1 LAMPIRAN 1. Alur kerja isolasi bakteri resisten antibiotik Sampel Tanah Sampel Air Sampel Udang - Ditimbang sebanyak 1 g - Dihomogenkan dalam 10 ml aquadest steril. - Dipipet 1ml - Ditambah aquadest steril 9 ml - Dihomogenkan. - Ditimbang sebanyak 1 g - Dihomogenkan dalam 10 ml dalam aquadest steril. Konsentrasi Dilanjutkan pengenceran sampai 10-4 Konsentrasi 10-4 Kultur campuran bakteri kandidat resisten antibiotik - Dipipet 100 µl - Disebarkan pada media NA - Diinkubasi pada suhu 0±2 C selama jam - Disubkultur masing-masing ke media NA Kultur murni kandidat bakteri resisten antibiotik

2 LAMPIRAN 2. Pembuatan larutan standar McFarland 10 8 cfu/ml 0,048 M BaCl 2 0,6 N H 2 SO 4 - Diambil sebanyak 0,5 ml - Diambil sebanyak 99,5 ml - Dihomogenkan kedua larutan Hasil - Diukur densitas suspensi dengan menggunakan spektrofotometer (nilai absorbansinya 625nm ± 0,1) Larutan standar McFarland 10 8 cfu/ ml

3 LAMPIRAN. Alur kerja uji sensitivitas bakteri terhadap beberapa jenis antibiotik Isolat murni tanah Isolat murni udang Isolat murni air - Diambil dengan jarum ose - Disuspensi kedalam larutan fisiologis (NaCl 0,9%) - Dibandingkan dengan larutan McFarland (10 8 cfu/ml) - Disebarkan pada media MHA - Diletakkan cakram yang berisi antibiotik - Diinkubasi pada T; 0±2 C selama jam Zona Hambat - Diukur pada 2 posisi dengan jangka sorong Diameter zona hambat

4 LAMPIRAN 4. Alur kerja isolasi bakteri patogen Vibrio sp. Air Tambak PT. BUDI - Diambil sebanyak 0,1 ml - Disebarkan pada media TCBSA - Diinkubasi pada T: 0±2 C selama jam Isolat tunggal - Dikarakterisasi secara morfologi, pewarnaan gram dan uji biokimia sederhana Hasil

5 LAMPIRAN 5. Alur kerja uji patogenitas bakteri resisten antibiotik terhadap larva udang windu PL10 Bakteri resisten antibiotik - Diambil dengan ose - Dimasukkan dalam 5 ml air laut - Dihomogenkan - Diambil sebanyak 9,9 ml air laut - Dihomogenkan - Disesuaikan kekeruhannya sesuai dengan standar Mc Farland (10 8 cfu/ml) Suspensi bakteri kandidat biokontrol dengan kepekatan 50 X - Sebanyak 10 ml (10 8 cfu/ml) ditambah pada pemeliharaan yang berisi 1 l air laut dan 20 ekor larva. - Direndam selama 96 jam - Dihitung jumlah larva yang mati Hasil

6 LAMPIRAN 6. Alur kerja uji daya hambat bakteri resisten antibiotik terhadap Vibrio sp. secara in vitro Bakteri resisten antibiotik Vibrio sp. - Masing-masing disubkultur selama ± 24 jam pada media NA - Diambil dengan jarum ose - Masing-masing dilarutkan dalam larutan fisiologis (NaCl 0,9%) - Dihomogenkan dan disesuaikan kekeruhannya dengan standar McFarland (10 8 cfu/ml) Suspensi bakteri resisten antibiotik Suspensi bakteri Vibrio sp. - Ditetesi sebanyak10-20μl pada cakram steril dipermukaan media MHA yang berisi isolat Vibrio sp. - Disebarkan dengan cotton swab pada permukaan media MHA Hasil Diameter zona hambat - Diinkubasi pada T: 0±2 C selama jam - Diukur zona hambat yang terbentuk dengan jangka sorong

7 LAMPIRAN 7. Alur kerja uji tantang bakteri resisten antibiotik terhadap Vibrio sp. pada pemeliharaan larva udang PL 9 Wadah berkapasitas 2 liter - Dimasukkan air laut steril 1 liter - Ditebari larva udang 20 ekor Uji tantang Kontrol positif Kontrol negatif - Ditambah 5 ml suspensi Bakteri Resisten Antibiotik - Ditambah 5 ml suspensi Vibrio sp. - Dihitung jumlah larva yang mati setelah 96 jam - Ditambah 10 ml suspensi Vibrio sp. - Dihitung jumlah larva mati setelah 96 jam perendaman Vibrio sp. - Dihitung jumlah larva yang mati setelah 96 jam Hasil Hasil Hasil

8 Lampiran 8. Alur kerja uji khitinase bakteri patogen Vibrio sp. Vibrio sp. - Diambil dengan ose. - Kemudian dihomogenkan dalam larutan fisiologis 0,9% hingga kekeruhannya sesuai dengan standar McFarland 10 8 cfu/ml - Ditetesi sebanyak ±20μl pada cakram steril. - Cakram diletakkan pada media yang mengandung khitin. - Diinkubasi pada T: 0±2 C selama jam - Diamati diameter zona bening disekitar Diameter zona hambat

9 LAMPIRAN 9. Diameter hasil uji sensitivitas bakteri resisten terhadap beberapa jenis antibiotik Isolat Sumber isolat A K E ST sp1 Udang 21,0,0 5,0 7,0 sp2 Udang 9,0 22,0 2,0 14,0 sp Udang 6,0 9,0 1,0 21,0 sp4 Udang 6,0,0 11,0 27,0 sp5 Udang 6,0 28,0 1,0 20,5 sp6 Air 6,0 26,0 14,0 15,0 sp7 Air 6,0 25,2 15,0 20,5 sp8 Air 7,0 2,5 20,0 2,0 sp9 Air 1,0 15,0 9,50 15,0 sp10 Air 12,0 21,0 1,0 22,5 sp11 Tanah 15,0 28,0 6,0 25,0 sp12 Tanah 7,5 27,0 18,0 10,0 sp1 Tanah 6,0 2,0 21,0 2,0 sp14 Tanah 15,5 10,9 22,5 25,0 sp15 Tanah 6,0 25,0 17,5 6,0 Keterangan: A: 25μg Amoksisilin, K: 0 μg Kloramfenikol, E: 15 μg Eritromisin, dan ST : 25 μg Sulfametoksazol/Tritmetropim. Diameter Zona Hambat Standar Antibiotik Jenis antibiotik Konsentrasi cakram antibiotik Diameter zona hambat (mm) Sensitif Intermediate Resisten Amoksisilin 25 μg s/d Kloramfenikol 0 μg 18 1 s/d Eritromisin 15 μg 2 14 s/d 22 1 Sulfametoksazol/Trimetropim 25 μg s/d Sumber: Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS) Providing NCCLS standards and guidelines ISO/TC 212 standards, and ISO/TC 76 standards (2010).

10 Lampiran 10. Analisis statistik dengan menggunakan SPSS 16 a. Pengaruh isolat bakteri resisten antibiotik dalam menghambat pertumbuhan Vibrio sp. secara in vitro. ANOVA Zona Hambat JK DB KT F hitung Sig. Perlakuan Galat Total Zona Hambat Deskriptif ISOLAT 95% Confidence Interval for Mean N Mean Std. Deviasi Std. Error Batas bawah Batas atas Minimum Maksimum sp sp sp sp sp sp sp sp sp sp sp sp sp sp sp Total

11 Zona Hambat Duncan Isolat N Subset for alpha = sp11 6. sp sp sp sp sp sp sp sp sp sp sp sp sp 12.7 sp Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

12 b. Pengaruh isolat bakteri resisten antibiotik terhadap pertumbuhan Vibrio sp. dalam pemeliharaan larva udang PL9 ANOVA LARVA MATI JK DB KT F hitung Sig. Perlakuan Galat Total Deskriptif LARVA MATI 95% Confidence ISOLAT Std. Interval for Mean Batas Batas N Rataan Deviasi Std. Error bawah atas Minimum Maksimum sp sp sp sp sp sp sp sp sp sp sp sp sp sp sp Kontrol Kontrol Total

13 LARVA MATI Duncan ISOLAT N Subset for alpha = sp sp17 4. sp sp sp sp sp sp sp sp sp1 10. sp sp sp sp9 14. sp sp Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed.

14 LAMPIRAN 11. Kemampuan isolat sp2 menghambat pertumbuhan patogen Vibrio sp. secara in vitro. sp2 LAMPIRAN 12. Isolat sp6 pada uji resistensi terhadap beberapa antibiotik sp6

15 LAMPIRAN 1. Lokasi pengambilan sampel pada tambak udang di Kabupaten Serdang Bedagai. a b c d Keterangan : a. Tambak aktif (50 m dari tepi pantai), b. Tambak non aktif (100 m dari tepi pantai), c. Tambak aktif Dinas Perikanan dan Kelautan (1000 m dari tepi pantai), d. Tambak non aktif (000 m dari tepi pantai).

16 LAMPIRAN 14. Pengujian isolat bakteri resisten antibiotik terhadap Vibrio sp. di lokasi pembibitan udang Kabupaten Serdang Bedagai. Keterangan : Wadah yang digunakan untuk pengujian Keterangan : Bak pemeliharaan larva udang

17 LAMPIRAN 15. Hasil uji biokimia beberapa isolat bakteri resisten antibiotik sp2 sp sp2 sp 4 sp8 vib sp1 sp2 sp sp5 sp6 sp7 a b sp1 sp2 sp sp5 sp6 sp4 sp1 sp2 sp sp4 sp6 sp7 c d Keterangan: a: Uji TSIA, b: Uji Penggunaan Sitrat, c: Uji Gelatin, d: Uji Motilitas

18 LAMPIRAN 16. Proses sebagian preparasi sampel larva udang untuk SEM a b c d e Keterangan: a. Sampel dibekukan dalam larutan tersier -butanol, b. Sampel dikeringkan dengan alat freeze drying, c. Sampel ditempelkan pada stub, d. Sampel dibalut dengan ion coater, e. Stub dipasang pada stub horder, f. Alat SEM JSM- 510LV. f

19

20 a b c Gambar 1. Scanning Electron Microscopy larva udang pada pembesaran 7500x, a: kontrol negatif (tanpa penambahan Vibrio sp.), b: kontrol positif (dengan penambahan Vibrio sp.), c: larva udang dengan penambahan isolat p2 dan Vibrio sp.

21