II. BAHAN DAN METODE 2.1 Seleksi Bakteri Probiotik Karakterisasi morfologi dan fisiologis kandidat probiotik

Transkripsi

1 II. BAHAN DAN METODE 2.1 Seleksi Bakteri Probiotik Karakterisasi morfologi dan fisiologis kandidat probiotik Sebanyak 16 jenis bakteri hasil isolasi Ardiani (2011) ditumbuhkan pada media agar Sea Water Complete (SWC) lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 28 o C. Koloni yang tumbuh dilakukan serangkaian uji untuk mengetahui karakter morfologi dan fisiologis dari masing-masing isolat. Uji yang dilakukan meliputi (1) pewarnaan Gram dengan menggunakan larutan kristal violet, lugol, alkohol absolut, dan safranin (2) uji oksidatif-fermentatif dengan menggunakan media uji oksidatif-fermentatif, glukosa, dan parafin; (3) uji motilitas dengan menggunakan media Sulfide Indol Motility (SIM); (4) uji katalase dengan menggunakan Hidrogen Peroksida (H 2 O 2 ) 3%; dan (5) uji oksidase dengan menggunakan p-aminodhymethylalanin oxalat 1% Uji Aktivitas amilolitik dan proteolitik Uji ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas amilase dan protease dari masing-masing isolat melalui kemampuannya menghidrolisis karbohidrat dan protein. Bakteri kandidat probiotik ditumbuhkan pada media SWC yang telah ditambahkan tepung kanji sebanyak 2% untuk uji amilolitik. Kemampuan menghidrolisa karbohidrat ditandai dengan terbentuknya warna kuning terang di sekitar isolat sedangkan isolat yang tidak mampu menghidrolisa karbohidrat, area di sekitar isolat tetap berwarna gelap setelah penambahan reagen KI 1%. Sedangkan pada uji aktivitas proteolitik, bakteri kandidat probiotik ditumbuhkan pada media SWC yang telah ditambahkan susu skim sebanyak 2%. Kemampuan menghidrolisa protein ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar isolat Uji sensitivitas antibiotik Uji ini dilakukan untuk mengetahui tingkat sensitivitas bakteri kandidat probiotik pada beberapa jenis antibiotik serta membantu dalam pembuatan penanda untuk memonitor keberadaan bakteri yang akan digunakan pada uji in vivo sehingga bisa dibedakan dengan jenis bakteri yang sudah ada di lingkungan 22

2 pemeliharaan pascalarva. Jenis antibiotik yang digunakan adalah rifamfisin, streptomisin, kanamisin, dan penisilin G. Konsentrasi yang digunakan adalah 50 µg/ml dan 100 µg/ml. Kandidat probiotik ditumbuhkan pada media SWC agar yang telah mengandung antibiotik dengan konsentrasi 50 µg/ml dan 100 µg/ml menggunakan metode streak plate lalu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 28 o C. Bakteri yang sensitif terhadap antibiotik ditandai dengan tidak adanya pertumbuhan koloni pada media SWC agar yang telah mengandung antibiotik, sedangkan bakteri yang resisten akan tetap tumbuh pada media tersebut Metode kultur bersama Kemampuan kandidat bakteri probiotik melawan bakteri V. harveyi MR 5339 Rf R diuji juga dengan menggunakan metode kultur bersama. Isolat bakteri kandidat probiotik dan bakteri V. harveyi MR 5339 Rf R yang telah berumur 24 jam diencerkan hingga mencapai kepadatan yang sama yakni mencapai 10 6 CFU/ml. Sebanyak 100 µl bakteri kandidat probiotik dan bakteri V. harveyi MR 5339 Rf R dimasukkan kedalam media SWC broth, lalu diinkubasi selama 24 jam pada shaker berkecepatan 140 rpm dengan suhu 29 o C. Sebagai kontrol digunakan bakteri V. harveyi MR 5339 Rf R yang ditumbuhkan sendiri (tanpa bakteri kandidat probiotik) dengan kepadatan yang sama. Kemampuan bakteri kandidat probiotik menghambat pertumbuhan bakteri V. harveyi MR 5339 Rf R ditandai dengan kepadatan bakteri V. harveyi MR 5339 Rf R pada perlakuan kontrol yang lebih banyak dibandingkan dengan bakteri V. harveyi MR 5339 Rf R pada hasil kultur bersama Uji patogenitas bakteri kandidat probiotik Sebanyak satu lup inokulan dari masing-masing isolat ditumbuhkan pada media SWC broth dan diinkubasi pada shaker dengan kecepatan 140 rpm pada suhu 29 o C. Hasil kultur disentrifuse pada 4000 rpm selama 30 menit lalu dibilas dengan Posphate Buffer Saline sebanyak dua kali. Suspensi bakteri kandidat probiotik dimasukkan dalam media steril pemeliharaan larva udang vaname hingga mencapai kepadatan akhir 10 6, 10 7, dan 10 8 CFU/ml. Percobaan dilakukan sebanyak dua kali ulangan dengan kontrol positif berupa penambahan bakteri 23

3 V. harveyi MR 5339 Rf R. Pemberian pakan dilakukan sebanyak 5 kali sehari dengan menggunakan pelet berjenis crumble. Pengamatan tingkat kelangsungan hidup dilakukan setiap hari selama 5 hari (Vijayan et al. 2006) Pembuatan mutan bakteri kandidat probiotik Isolat-isolat yang menghasilkan kelangsungan hidup terbaik pada uji patogenisitas, diberi penanda resisten streptomisin (St R) terlebih dahulu sebelum digunakan pada uji in vivo. Pemberian penanda streptomisin dilakukan dengan menumbuhkan isolat secara spontan pada media SWC agar yang mengandung streptomisin sebanyak 50 µg/ml media. Sedangkan patogen yang digunakan adalah V. harveyi MR 5339 Rf R yang ditumbuhkan secara spontan pada media SWC yang mengandung 50 µg/ml rifamfisin. Pemberian penanda ini dilakukan untuk memonitor keberadaan bakteri pada media pemeliharaan. 2.2 Uji in vivo Kandidat Probiotik Isolat bakteri kandidat probiotik diinokulasikan pada media pemeliharaan hingga mencapai konsentrasi akhir 10 6 CFU/ml sehari setelah larva udang dimasukkan. Patogen V. harveyi MR 5339 Rf R diinokulasikan hingga mencapai kepadatan akhir 10 6 CFU/ml enam jam setelah pemberian kandidat probiotik. Percobaan dilakukan sebanyak empat kali ulangan termasuk kontrol positif (dengan inokulasi bakteri V. harveyi MR 5339 Rf R saja) dan kontrol negatif (tanpa penambahan bakteri kandidat probiotik maupun V. harveyi MR 5339 Rf R). Pengamatan dilakukan selama 14 hari meliputi tingkat kelangsungan hidup (SR), total populasi bakteri V. harveyi MR 5339 Rf R, total populasi bakteri kandidat probiotik, serta laju pertumbuhan panjang dan bobot harian. 2.3 Rancangan Penelitian dan Teknik Analisa Penelitian ini dirancang dengan menggunakan Rancangan Acak Faktorial (RAF) dengan dua ulangan pada uji patogenisitas, dan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan empat ulangan pada uji in vivo. Analisa data dilakukan dengan ANOVA single factor dan uji lanjut dengan menggunakan uji Duncan. 24

4 2.4 Parameter yang Diamati Tingkat kelangsungan hidup pascalarva udang vaname Tingkat kelangsungan hidup pascalarva udang vaname dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut: SR = x 100% (Effendi 2004) Keterangan: SR = tingkat kelangsungan hidup (%) Nt = jumlah pascalarva udang hidup pada akhir pengamatan No = jumlah pascalarva udang pada awal pengamatan Pertumbuhan panjang dan bobot harian pascalarva udang vaname Pertumbuhan panjang dan bobot total diamati pada awal dan akhir penelitian. Pertumbuhan bobot pascalarva udang vaname dihitung berdasarkan pertambahan bobot berdasarkan rumus berikut : SGR = {( ) } (Effendie 1997) Keterangan: SGR = laju pertumbuhan harian bobot larva udang (%) t = lama waktu pemeliharaan larva udang (hari) Wt = bobot rata-rata akhir pascalarva udang (mg) Wo = bobot rata-rata awal pascalarva udang (mg) Nilai pertumbuhan panjang harian (Daily increment in length) pascalarva udang vaname dihitung dengan menggunakan rumus sebagai berikut: DIL = (Mai et al. 2000) DIL = pertumbuhan panjang harian Lt = panjang rata-rata akhir pascalarva udang (mm) Lo = panjang rata-rata awal pascalarva udang (mm) Populasi bakteri Populasi bakteri yang dihitung pada uji in vitro metode kultur bersama adalah jumlah V. harveyi MR 5339 Rf R pada tabung kontrol dan kultur campuran 25

5 probiotik. Populasi bakteri yang dihitung pada uji in vivo meliputi jumlah bakteri probiotik, jumlah V. harveyi MR 5339 Rf R pada media pemeliharaan. Jumlah bakteri dihitung berdasarkan rata-rata jumlah koloni yang tumbuh dan dikalikan dengan faktor pengenceran dan volume inokulan yang disebar pada media. 26