HASIL DAN PEMBAHASAN. Perhitungan Kadar Kadar residu antibiotik golongan tetrasiklin dihitung dengan rumus:

Transkripsi

1 8 Kolom : Bondapak C18 Varian 150 4,6 mm Sistem : Fase Terbalik Fase Gerak : Asam oksalat M - asetonitril (4:1, v/v) Laju Alir : 1 ml/menit Detektor : Berkas fotodioda 355 nm dan 368 nm Atenuasi : 4 kali Perhitungan Kadar Kadar residu antibiotik golongan tetrasiklin dihitung dengan rumus: C s ialah konsentrasi sampel, C st ialah konsentrasi standar, A s ialah luas puncak sampel, A b ialah luas puncak standar, V t ialah volume akhir sampel (µl), dan m s ialah bobot sampel (g). Presisi: Keterulangan (Repeatability) Larutan standar campuran tetrasiklin, oksitetrasiklin, dan klortetrasiklin konsentrasi 1000, 1000, dan 2000 ppb sebanyak 40 µl dianalisis dengan KCKT. Analisis dilakukan sebanyak lima kali ulangan dan dilakukan oleh tiga orang pelaksana. Luas puncak yang diperoleh kemudian ditentukan simpangan baku (SD) dan simpangan baku relatifnya (RSD). Ct merupakan konsentrasi tetrasiklin, oksitetrasiklin, dan klortetrasiklin total setelah penambahan standar; Cu ialah konsentrasi tetrasiklin, oksitetrasiklin, dan klortetrasiklin dalam larutan uji (sampel); dan Cs ialah konsentrasi tetrasiklin, oksitetrasiklin, dan klortetrasiklin standar. Uji Linearitas Dibuat larutan standar campuran antibiotik tetrasiklin dengan konsentrasi 125, 250, 500, 1000, 2000, dan 4000 ppb. Sebanyak 40 µl larutan dianalisis dengan KCKT. Linearitas ditentukan menggunakan metode regresi kuadrat terkecil sebanyak tiga kali ulangan untuk setiap konsentrasi. Persamaan linearitas yang digunakan ialah y = a + bx dengan a ialah titik potong dan b ialah kemiringan. Penentuan Batas Konsentrasi Terendah Larutan standar tetrasiklin, oksitetrasiklin, dan klortetrasiklin dengan konsentrasi 50, 25, 10, 5, dan 1 ppb sebanyak 40 µl dianalisis dengan KCKT. Dihitung respons simpangan standarnya menggunakan rumus: Q ialah batas deteksi dan batas kuantitasi dengan x = luas puncak rata rata konsentrasi terendah, SD atau standar deviasi simpangan standar luas puncak blangko, nilai k = 3 untuk batas deteksi dan 10 untuk batas kuantitasi. HASIL DAN PEMBAHASAN Akurasi: Uji Perolehan Kembali (Recovery Test) Sebanyak 5,0 gram sampel daging ayam dimasukkan ke dalam tabung sentrifus lalu ditambahkan 250 µl larutan standar campuran tetrasiklin (1:1:1) konsentrasi 1000 ppb. Perlakuan selanjutnya sama seperti preparasi sampel. Percobaan diulangi untuk penambahan 500 µl dan 750 µl larutan standar campuran yang sama. Nilai % perolehan kembali (recovery) dihitung menggunakan rumus: Parameter KCKT-Detektor PDA Metode analisis residu antibiotik golongan tetrasiklin dalam daging ayam pedaging secara KCKT diambil dari metode yang dikembangkan oleh Cinquina et al. (2003) serta Castellari dan Reguiro (2003) berdasarkan referensi dari AOAC Official Method KCKT yang digunakan ialah KCKT Shimadzu LC-20AD dengan detektor PDA. Detektor tersebut dapat mendeteksi senyawa yang memiliki spektrum serapan pada daerah UV ( nm) dan sinar tampak ( nm). KCKT tersebut juga dapat digunakan untuk menganalisis lebih dari 1 senyawa yang memiliki 2 panjang gelombang yang berbeda secara simultan.

2 6 Menurut Cinquina et al. (2003), antibiotik golongan tetrasiklin memiliki ciri serapan UV-Vis pada panjang gelombang di sekitar 350 nm sehingga dapat dideteksi oleh KCKT dengan detektor PDA. Panjang gelombang maksimum OTC dan TC ialah 355 nm, sedangkan CTC 367,5 nm (Neil et al. 2006). (c) Gambar 4 Spektrum serapan sinar UV-Vis tetrasiklin (a), oksitetrasiklin (b), dan klortetrasiklin (c). (a) (b) Hasil penelitian menunjukkan spektrum serapan OTC, TC, dan CTC (Gambar 4) memiliki serapan maksimum masing masing pada panjang gelombang 355,04; 355,22; dan 368,10 nm. Oleh karena itu, untuk tahapan analisis selanjutnya dilakukan pada dua panjang gelombang, yaitu 355 dan 368 nm secara simultan. Kolom yang digunakan ialah kolom C18 Bondapak dengan fase terbalik. Menurut Horwitz dan Latimer (2005), kolom ini baik digunakan karena selektif untuk menganalisis antibiotik golongan tetrasiklin dengan fase gerak metanol, asetonitril, dan asam oksalat. Tabel 1 Presisi antibiotik golongan tetrasiklin konsentrasi 1000 dan 2000 ppb Pelaksana Ulangan OTC TC CTC 1 1 3, , , , , , , , , , , , , , , Rataan 36597, , ,2 SD 354, , ,1565 RSD 0,97% 0,87% 0,73% 2 1 3, , , , , , , , , , , , , , , Rataan , SD 243, , ,2872 RSD 0,67% 0,66% 1,51% 3 1 3, , , , , , , , , , , , , , , Rataan 36323, , ,4 SD 182, , ,0610 RSD 0,50% 0,83% 0,41%

3 7 Presisi Presisi untuk KCKT dilakukan dengan cara menganalisis satu seri larutan standar oleh pelaksana yang berbeda. Presisi pada penelitian ini dilakukan oleh 3 orang pelaksana yang berbeda. Kromatogram presisi dapat dilihat di Lampiran 1. Presisi dikatakan baik jika memiliki nilai simpangan baku relatif kurang dari 2% dengan konsentrasi 0-150% kadar analat (IUPAC 2002). Berdasarkan hasil pada Tabel 1, simpangan baku relatif OTC, TC, dan CTC masing masing 0,97; 0,87; dan 0,73%. Hal ini menunjukkan bahwa kondisi KCKT telah sesuai dan dapat digunakan untuk analisis residu antibiotik golongan tetrasiklin. Linearitas Uji linearitas merupakan suatu metode analisis yang menggambarkan kemampuan suatu alat untuk memperoleh hasil pengujian yang sebanding dengan kadar analat dalam zat uji pada rentang kadar tertentu. Uji linearitas dilakukan dengan membuat kurva kalibrasi dari serangkaian konsentrasi larutan standar antibiotik golongan tetrasiklin. Setelah diperoleh kurva kalibrasi, persamaan regresi dihitung untuk mengetahui hubungan antara konsentrasi antibiotik dengan luas puncak. Kromatogram linearitas OTC, TC, dan CTC dapat dilihat pada Lampiran 2. Persamaan regresi linear yang diperoleh ialah y = 29018,1x - 271,12 untuk OTC, y = 37906,2x - 864,08 untuk TC, dan y =18536,7x - 848,58 untuk CTC. Nilai koefisien korelasi 0,99969 untuk OTC, 0,99947 untuk TC, dan 0,99934 untuk CTC (Gambar 5). Nilai ini telah memenuhi persyaratan metode yang baik dari segi linearitas, yaitu koefisien korelasi lebih dari 0,9995 (IUPAC 2002). Oleh karena itu, analisis antibiotik golongan tetrasiklin dapat dilakukan secara simultan oleh KCKT. Batas Deteksi dan Batas Kuantitasi Menurut IUPAC (2002), batas deteksi ialah batas konsentrasi terendah yang masih dapat dideteksi oleh instrumen. Batas deteksi dan batas kuantitasi merupakan ukuran sensitivitas dari KCKT. KCKT tidak dapat mendeteksi keberadaan OTC, TC, dan CTC pada konsentrasi 1 dan 2 ppb (Tabel 2). Hal ini disebabkan pada konsentrasi 1 dan 2 ppb sinyal yang dihasilkan oleh KCKT sangat rendah dan tidak terbaca sebagai sinyal OTC, TC, dan CTC. Oleh karena itu, penentuan batas deteksi dilakukan pada konsentrasi 5 dan 10 ppb. Kromatogram batas deteksi dan batas kuantitasi dapat dilihat di Lampiran 3. Batas deteksi yang diperoleh untuk OTC, TC, dan CTC berturut turut ialah 5,28; 5,09; dan 10,52 ppb. Oleh karena itu pada konsentrasi di bawah 5,28 ppb, 5,09 ppb, dan 10,52 ppb, kadar OTC, TC, dan CTC tidak dapat ditentukan. Batas kuantitasi yang diperoleh untuk OTC, TC, dan CTC berturut turut ialah 5,93; 5,30; dan 13,52 ppb. Gambar 5 Linearitas antibiotik golongan tetrasiklin

4 8 Tabel 2 Batas terendah antibiotik golongan tetrasiklin ulangan OTC TC CTC rerata , SD 6,6106 2,1279 5,1769 LOD (ppb) 5,28 5,09 10,52 LOQ (ppb) 5,93 5,3 13,52 Menurut Badan Standarisasi Nasional (BSN 2000), BMR antibiotik golongan tetrasiklin yaitu 100 ppb, sedangkan nilai batas deteksi yang diperoleh lebih kecil dari nilai BMR tersebut. Hal ini menunjukkan bahwa metode KCKT dapat digunakan untuk mendeteksi residu antibiotik golongan tetrasiklin dalam jumlah yang relatif sedikit. Perolehan Kembali (Akurasi) Uji perolehan kembali dilakukan untuk mengetahui kemampuan metode dan untuk mengetahui berapa persen analat yang ditambahkan dapat ditemukan.khasil perolehan kembali untuk OTC 107,3-113,2%, TC 40,8-46,9%, dan CTC 88,2-110,3% (Tabel 3). Tabel 3 Perolehan kembali oksitetrasiklin (OTC), tetrasiklin (TC), dan klortetrasiklin (CTC) Antibiotik Standar yang ditambahkan (ppb) Luas Puncak Konsentrasi yang diperoleh (ppb) % Perolehan kembali Rataan % Perolehan kembali OTC 50 3, ,46 113,1 107,3 3, ,18 114,6 3, ,67 94, , ,94 115,9 113,2 3, ,20 113,4 3, ,31 110, , ,36 112,5 110,5 3, ,12 110,7 3, ,93 108,4 TC 50 3, ,05 50,2 44,7 3, ,31 54,7 3, ,42 29, , ,65 51,1 46,9 3, ,43 53,5 3, ,79 36, , ,27 39,8 40,8 4, ,29 46,9 3, ,13 35,8 CTC 50 8, ,88 114,0 110,3 8, ,43 115,1 8, ,44 101, , ,96 113,9 106,9 8, ,39 117,6 8, ,56 89, , ,89 85,9 88,2 8, ,47 87,6 8, ,06 90,9

5 9 Menurut Center for Drugs Evaluation and Research (CDER), nilai perolehan kembali ialah % (CDER 1994). Berdasarkan ketetapan tersebut, nilai perolehan kembali untuk oksitetrasiklin dan klortetrasiklin memenuhi persyaratan. Namun tetrasiklin tidak memenuhi persyaratan nilai perolehan kembali yang dianjurkan. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh metode analisis yang dilakukan tidak cukup untuk mengurangi pengaruh matriks sampel yang mengganggu. Residu Antibiotik Golongan Tetrasiklin dalam Daging Ayam Pedaging Residu antibiotik dalam makanan dan minuman kemungkinan merupakan salah satu faktor penyebab resistensi kuman terhadap antibiotik. Penggunaan antibiotik sebagai bahan pengobatan dan tambahan pakan ternak saat ini masih banyak dilakukan. Adanya residu dalam daging ayam disebabkan ayam tersebut telah dipotong sebelum dicapai waktu henti (withdrawal Tabel 4 Residu antibiotik golongan tetrasiklin dalam daging ayam pedaging Lokasi Kode sampel Konsentrasi Antibiotik (ppb) OTC TC CTC Jakarta A1 5,98 14,28 35,95 A2 tt tt 38,68 A3 7,35 tt 19,46 A4 22,42 tt 18,09 A5 10,31 tt 14,72 A6 tt tt 44,37 A7 tt tt 19,00 A8 8,69 tt 13,68 A9 tt tt 26,26 A10 10,37 tt 16,34 Bekasi B1 tt tt 18,24 B2 tt tt 15,55 B3 tt tt tt B4 tt tt 15,33 B5 15,35 tt 33,24 B6 tt tt 16,71 B7 12,58 tt 29,45 B8 tt tt 38,98 B9 tt tt 38,96 B10 tt tt 18,71 Depok C1 41,55 tt 31,07 C2 tt tt 26,45 C3 tt tt 43,13 C4 7,88 tt 58,92 C5 6,85 tt 32,34 C6 tt tt 25,70 C7 8,53 58,01 37,69 C8 tt tt 23,81 C9 13,42 tt 46,76 C10 8,40 tt 53,87 *tt berarti tidak terdeteksi oleh alat KCKT (untuk OTC 5,93; TC 5,3; dan CTC 13,52 ppb).

6 8 time), yakni lima hari. Kadar residu oksitetrasiklin dalam daging ayam pedaging asal daerah Jakarta cukup rendah, yaitu sekitar 5-20 ppb (Tabel 4). Begitu juga dengan daging ayam asal daerah Bekasi dan Depok, residu oksitetrasiklin masing-masing sebesar ppb dan 6-68 ppb. Kadar residu tetrasiklin dalam hampir semua sampel daging ayam pedaging berada di bawah nilai batas kuantitasi OTC, TC, dan CTC sehingga tidak terdeteksi oleh alat KCKT atau daging ayam pedaging tersebut tidak mengandung residu tetrasiklin. Kadar residu klortetrasiklin dalam daging ayam pedaging dari daerah Jakarta, Bekasi, dan Depok ialah yang paling banyak, yaitu ppb. Perhitungan kadar OTC, TC, dan CTC dapat dilihat di Lampiran 4. Jumlah kadar residu antibiotik golongan tetrasiklin dalam semua sampel daging ayam pedaging yang dianalisis berada di bawah BMR, yaitu 100 ppb sehingga masih aman untuk dikonsumsi. Kadar residu obat yang melewati BMR yang ditetapkan akan menyebabkan daging tersebut tidak aman dikonsumsi karena dapat mengakibatkan reaksi alergis, keracunan, dan resistensi mikrob tertentu. SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Kromatografi cair kinerja tinggi dengan detektor PDA layak digunakan untuk analisis residu antibiotik golongan tetrasiklin secara simultan pada panjang gelombang 355 dan 368 nm dengan fase gerak asam oksalat 0,0025 M-asetonitril (4:1) dan laju alir 1 ml/menit. Batas deteksi yang diperoleh KCKT untuk OTC, TC, dan CTC berturut turut ialah 5,28; 5,09; dan 10,52 ppb. Batas kuantitasi OTC, TC, dan CTC berturut turut ialah 5,93; 5,30; dan 13,52 ppb. Hasil uji-uji parameter validasi yang dilakukan berupa uji presisi, linearitas, batas deteksi, dan batas kuantitasi telah memenuhi persyaratan validasi metode analisis dan memiliki kelayakan yang bagus untuk antibiotik golongan tetrasiklin. Namun untuk uji perolehan kembali, antibiotik tetrasiklin tidak memenuhi persyaratan validasi metode analisis menurut CDER (1994) karena di luar kisaran %. Nilai perolehan kembali yang didapatkan untuk oksitetrasiklin sebesar 107,3 sampai 113,2 %, tetrasiklin 40,8 sampai 46,9 %, dan klortetrasiklin 88,2 sampai 110,3 %. Penelitian terhadap 30 sampel daging ayam pedaging asal Jakarta, Bekasi, dan Depok menunjukkan bahwa kadar residu antibiotik golongan tetrasiklin berada di bawah BMR (100 ppb) sehingga masih aman untuk dikonsumsi. Semua sampel daging ayam tersebut positif mengandung antibiotik klortetrasiklin, sedangkan hampir semuanya tidak mengandung residu tetrasiklin. Saran Hasil uji perolehan kembali untuk tetrasiklin masih kurang baik yaitu di bawah 80%. Oleh karena itu, perlu dipelajari dan dikembangkan metode ekstraksi untuk mengurangi pengaruh matriks sampel agar tetrasiklin dapat terekstrak dengan baik sehingga analisis antibiotik golongan tetrasiklin (oksitetrasiklin, tetrasiklin, dan klortetrasiklin) secara simultan dapat lebih optimal. DAFTAR PUSTAKA Adnan M Teknik Kromatografi untuk Analisis Bahan Makanan. Yogyakarta: Andi Pr. [AOAC] Association of Official Analytical Chemists Chlortetracycline, Oxytetracycline, and Tetracycline in edible animal tissues. Washington: AOAC Int. Bahri S, Masbulan E, Kusumaningsih A Proses praproduksi sebagai faktor penting dalam menghasilkan produk ternak yang aman untuk manusia. [terhubung berkala]. [10 Agu 2009]. Berendsen BJA, Rijhn JAV Residue analysis of tetracycline in poultry muscle, shortcomings revealed by a proficiency test. Food Additives and Contaminants 23(11): [BSN] Badan Standarisasi Nasional Batas maksimal cemaran mikroba dan batas residu dalam bahan makanan asal hewan. Dalam Standar Nasional Indonesis No