Lampiran A. Isolat Virus Metode Malole et al. (2006): Ikan kerapu macan positif VNN

Transkripsi

1 Lampiran A. Isolat Virus Metode Malole et al. (2006): Ikan kerapu macan positif VNN Diambil organ mata dan otaknya. Digerus dengan mortal. Ditambahkan NaCl fisiologis. Virus konsentrasi 10% Disentrifugasi pada 3000 rpm selama 15 menit dengan temperatur 5 C. Diambil supernatant. Disaring dengan kertas saring miliphore 0,45 µm. Inokulan baku virus Ditambahkan antibiotik Penicilin IU dan Streptomicin µg tiap mililiter suspensi. Disimpan dalam deep freezer suhu -40 ºC. Hasil

2 Lampiran B. Uji FID 50 Metode Reed & Muench (1938) dalam Amrullah (2004): Ikan kerapu macan Diinfeksi virus VNN dengan konsentrasi masing-masing 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7, 10-8, 10-9, sebanyak 0,1 ml/ekor. Diamati gejala klinis dan dicatat. Hasil

3 Lampiran C. Uji Hematologi Metode Benjamin (1978): 1. Penentuan Hemoglobin Working Reagent Dimasukkan ke dalam 2 cuvet sebanyak 2,5 ml. Dimasukkan sampel 10 µl ke dalam cuvet pertama Dimasukkan akuades 10 µl ke dalam cuvet ke dua sebagai blank Dihomogenkan masing-masing campuran dan biarkan selama tiga menit di temperatur kamar Dinolkan spektrofotometer dengan blank Dimasukkan nilai faktor hemoglobin Dimasukkan sampel dan baca hasilnya pada panjang gelombang 540 nm. Hasil 2. Pemeriksaan Hematokrit (PCV) Darah Dimasukkan ke dalam tabung Hematoktrit sebanyak 2/3 atau 3/4 tabung dan tutup ujungnya dengan lilin. Disentrifugasi pada rpm selama 4-5 menit. Dilakukan penghitungan nilai pada microhematocrit reader. Hasil

4 3. Pemeriksaan Eritrosit Darah Hasil Dihisap dengan aspirator hingga angka 0,5 Dibersihkan ujung pipet dengan tissue Dihisap larutan Hayem sampai tanda 101 tanpa menimbulkan gelembung udara Dilepaskan aspirator Dilakukan pengadukan Dibuang cairan di ujung pipet yang tidak ikut terkocok Disiapkan kamar hitung dan mikroskop Diteteskan suspensi darah pada bagian pinggir kamar hitung, dimana tetes 1-2 dibuang terlebih dahulu Diamati di bawah mikroskop Dihitung jumlah sel darah merah pada kotak menengah di bagian tengah kamar hitung Dihitung jumlah eritrosit dengan menggunakan rumus: HPA= n x

5 4. Pemeriksaan Leukosit Darah Hasil Dihisap dengan aspirator hingga angka 0,5 Dibersihkan ujung pipet dengan tissue Dihisap larutan Turk sampai tanda 11 tanpa menimbulkan gelembung udara Dilepaskan aspirator Dilakukan pengadukan Dibuang cairan di ujung pipet yang tidak ikut terkocok Disiapkan kamar hitung dan mikroskop Diteteskan suspensi darah pada bagian pinggir kamar hitung Dimana tetes 1-2 dibuang terlebih dahulu Diamati di bawah mikroskop Dihitung jumlah sel darah putih pada kotak menengah di bagian pinggir kamar hitung Dihitung jumlah leukosit dengan menggunakan rumus: HPA= n x 40

6 Lampiran D. Uji Histopatologi Menurut Suntoro (1983): Otak dan mata Blok parafin Dicuci dengan NaCl 0,95%. Difiksasi (dimasukkan ke dalam fiksatif BNF selama 1 malam). Washing, (dengan menggunakan alkohol 70% dilakukan secara berkali-kali) direndam 1 malam. Dehidrasi dilakukan dengan merendam otak dan mata ke dalam alkohol bertingkat yaitu 70%, 80%, 96% dan 100% masingmasing 2 kali pengulangan selama 1 jam. Clearing dilakukan dengan merendam otak dan mata ke dalam xylol selama 1 malam. Infiltrasi dilakukan dengan merendam otak dan mata ke dalam xylol yang telah dipanaskan terlebih dahulu di dalam oven pada temperatur 56 0 C, selama 1 jam. Dilanjutkan dengan merendam otak dan mata ke dalam parafin murni I, II, III masing-masing selama 1 jam pada suhu 56 0 C. Embedding dilakukan dengan meletakkan otak dan mata pada kotak berbentuk segi empat yang telah dipersiapkan sebelumnya sebagai cetakan. Setelah itu, menuang parafin yang telah cair kedalam kotak tersebut, dan diberi label. Dibiarkan sampai dingin sehingga membentuk blok parafin dan dimasukkan ke dalam kulkas. Kemudian dilakukan penempelan blok-blok parafin pada holder yang terbuat dari kayu yang berbentuk persegi.

7 Blok Parafin Cutting dilakukan dengan memotong blok-blok parafin yang telah di holder pada mikrotum sehingga membentuk pita-pita parafin dengan ukuran ketebalan 6-10 µm. Pita Parafin Attaching dilakukan dengan mengambil beberapa pita parafin dengan skapel, kemudian diletakkan pada objek glass, dan, dicelupkan pada air dingin dan air hangat. Kemudian diletakkan diatas hotplate beberapa detik untuk melekatkan pita parafin pada objek glass. Deparafinasi, dilakukan dengan cara mencelupkan objek pada xylol sampai parafin habis kira-kira selama ± 15 menit. Dealkoholisasi, dilakukan dengan mencelupkan objek glass ke dalam alkohol absolut, alkohol 96%, alkohol 80% dan alkohol 70%. Pewarnaan sediaan otak dan mata diwarnai dengan menggunakan Hematoxilin Eosin. Pewarnaan dilakukan dengan cara objek glass dimasukkan ke dalam larutan pewarna Hematoxilin Erlich selama 3-7 menit, dicuci dengan dengan air mengalir ± 10 menit, dimasukkan ke dalam alkohol 70%, dimasukkan ke dalam larutan pewarna Eosin 0,5% kemudian dimasukkan ke dalam alkohol 70% selama 1-3 menit, preparat dimasukkkan berturut-turut ke dalam alkohol 70%, 80%, 96%, dan alkohol absolut, dikeringkan dengan kertas pengisap selanjutnya, preparat dimasukkan ke xylol. Mounting dilakukan dengan menutup preparat dengan canada balsam. Diusahakan supaya tidak terdapat gelembung udara. Diberi label. Diamati di bawah mikroskop. Hasil

8 Lampiran E. Uji RT-PCR Menurut panduan IQ 2000 (2003): Sampel Ikan a. Pelet Dimasukkan sampel ikan (20 mg sampel otak, atau 20 mg sampel mata) ke dalam tabung mikro 1,5 ml kemudian dilarutkan dengan 500 µl RNA Extraction Solution. Digerus sampai hancur, diamkan pada suhu kamar selama 5 menit. Ditambahkan 100 µl CHCl 3, kemudian vortex 20 detik. Biarkan pada suhu kamar selama 2 sampai 3 menit, lalu disentrifugasi pada rpm selama 15 menit. Dipipet 200 µl dari fase atas (bagian jernih) ke dalam tabung mikro 0,5 ml dengan 200 µl 2-propanol (isopropanol, IPA). Divortex sebentar, lalu disentrifugasi pada rpm selama 10 menit, lalu dibuang isopropanol tersebut. Dicuci pelet dengan 0,5 ml etanol 75%, kemudian di spin down rpm selama 5 menit untuk mendapatkan pelet RNA, kemudian tuang etanol dan dikeringkan pelet. Dilarutkan pelet dengan 200 µl air DEPC (dd H 2 O).

9 Pelet Disiapkan RT-PCR dan Nested PCR campuran dibutuhkan sesuai jumlah sampel. Untuk setiap campuran reaksi, perlu mempertimbangkan 3 standar positif (10 3, 10 2 dan 10 1 ) dan 1 kontrol negatif (ddh 2 O atau ragi trna). Dipipet 8 µl campuran reaksi reagen RT-PCR ke masingmasing 0,2 ml tabung reaksi dengan label yang tepat. Ditambahkan 2 µl ekstrak sampel RNA atau standar ke masingmasing campuran reaksi. Dimasukkan ke dalam thermal cycle untuk proses amplikasi tahap 1 (RT-PCR reaction). Ditambahkan 15 µl campuran reaksi reagen Nested PCR untuk setiap tabung setelah RT-PCR reaksi selesai. Dimasukkan ke dalam thermal cycle untuk proses amplikasi tahap 2 (Nested PCR reaction). Setelah selesai, Nested PCR reaction ditambahkan 5 µl 6X loading dye untuk masing-masing tabung reaksi dan aduk rata. sampel siap untuk elektroforesis. Hasil Dimasukkan Gel agarose 2% (2 gram agarose dilarutkan dengan 100 ml TAE 1x) ke dalam erlenmeyer. Dipanaskan larutan menggunakan microwave, sampai mendidih dan berubah menjadi bening. Didinginkan gel agarose pada temperatur kamar sampai temperatur sekitar 50 o C dan perlahan-lahan tuangkan gel ke dalam kotak gel dengan ketinggian gel agarose sekitar 0,5-0,3 cm, dan total ketebalan disarankan untuk tidak lebih besar dari 0,8 cm. Dimasukkan sisir plastik (comb) ke dalam gel agarose. Diangkat blocker pada kedua sisi kotak gel saat gel agarose di dalam benar-benar memadat. Dilakukan proses elektroforesis. Elektroforesis

10 Elektroforesis Ditambahkan buffer elektroforesis 1X ke dalam kotak gel sampai tuas penyangga hanya menutupi gel. Ditambahkan 8 µl sampel ke dalam sumur satu per satu. Dimasukkan marker ke sumur pertama sebanyak 5 µl, dan kontrol negatif ke sumur kedua, diikuti dengan sampel dan terakhir kontrol positif. Running pada tegangan Volt. Elektroforesis dihentikan bila warna biru gelap mendekati 1/2 untuk 2/3 dari gel. Dikeluarkan gel dari kotak gel. Dimasukkan 10 µl Ethidium Bromida (EtBr) ke dalam 100 ml akuades. Direndam agarose hasil elektroforesis dengan larutaan EtBr ke dalam wadah plastik selama 10 menit dan sesekali digoyang. Dikelurkan agarose dan dicuci dengan akuades steril ke dalam wadah plastik selama 10 menit. Diletakkan gel pada pertengahan transilluminator UV gelombang untuk membaca akhir hasil. Dilakukan analisis kerja. Hasil

11 Lampiran F. Amplikasi Protokol PCR 1. Kondisi Reaksi dalam mesin PCR (RT-PCR) a. Profil suhu Reaksi PCR tahap l: 42 o C 30 menit; 94 o C 2 menit, kemudian 94 o C 30 detik; 62 o C 30 detik; 72 o C 30 detik, ulangi 20 siklus, kemudian tambahkan 72 o C 30 detik; 20 o C 30 detik pada akhir siklus akhir. b. Profil suhu reaksi PCR tahap 2 (Nested PCR): 94 o C 20 detik; 62 o C 20 detik; 72 o C 30 detik, ulangi 30 siklus, kemudian tambahkan 72 o C 30 detik; 20 o C 30 detik pada akhir siklus akhir. 2. Persiapan Reagent a. RT-PCR Reaction: 8 µl/reaksi RT-PCR Pre-Mixed Reagent 7,0 µl IQzyme TM, 2 unit/µl 0,5 µl Reverse Transcription (RT) Mix Enzim 0,5 µl b. Nested PCR Reaction: 15 µl/reaksi Nested PCR Pre-Mixed Reagent 14 µl IQzyme TM, 2 unit/µl 1 µl

12 Lampiran G. Diagnosis RT-PCR 1. Sampel positif dan standar akan menunjukkan pola-pola berikut pada gel: Lane 1: standar 1, 2000 copy / reaksi Lane 2: standar 2, 200 copy / reaksi Lane 3: standar 3, 20 copy / reaksi Lane 4: ddh 2 O Lane 5: sampel dengan infeksi VNN berat Lane 6: sampel dengan infeksi VNN ringan Lane 7: sampel negatif VNN Lane M: penanda berat molekul, 848 bp, 630 bp, 333 bp 2. Prosedur Diagnosis: a. pita terbentuk hanya pada 289 bp saja: ringan P (+) b. pita terbentuk pada 289 dan 479 bp: sedang P (+) c. pita terbentuk pada 289, 479, dan 1160 bp: berat P (+) d. hanya satu pita terbentuk pada 665 bp: VNN negatif (-) 3. Setiap eksperimen memerlukan kontrol positif dan negatif, jika standar 10 2 positif tidak menimbulkan sebuah pita di 289 bp, yang berarti reaksi RT-PCR gagal. Di sisi lain, jika kontrol negatif menghasilkan sebuah pita di 289 bp, yang berarti terjadi kontaminasi.

13 Lampiran H. Pengamatan Harian Ikan Kerapu Macan Diinfeksi VNN a. Data Pengamatan Perlakuan Ikan Kerapu Macan Diinfeksi VNN Keterangan: 1-7 Waktu pengamatan hari ke- A Jumlah ikan yang mati hingga akhir percobaan B Jumlah ikan pada awal percobaan C Tingkat kesakitan ikan hingga akhir percobaan (%) D Rataan tingkat kesakitan ikan pada masing-masing perlakuan (%) b. Analisis Statistik Tests of Normality b Kolmogorov-Smirnov a Shapiro-Wilk Perlakuan Statistic df Sig. Statistic df Sig. S 20 0, , ,000 S 25 0, , ,000 S 30 0, , ,000 S 35 0, , ,000 S 40 0, , ,000 a. Lilliefors Significance Correction b. is constant when Perlakuan = So. It has been omitted.

14 Npar Tests Kruskal-Wallis Test Perlakuan N Mean Rank K ,00 S ,00 S ,67 S ,33 S ,00 S ,00 Total 18 Test Statistics a,b Chi-Square 13,522 Df 5 Asymp. Sig. 0,019 a. Kruskal Wallis Test Npar Tests Perlakuan N Mean Rank Sum of K ,00 6,00 S ,00 15,00 Mann-Whitney U 0,000 Wilcoxon W 6,000 Z -2,121 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,034 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] 0,100 a

15 Npar Tests Perlakuan N Mean Rank Sum of K ,00 6,00 S ,00 15,00 Mann-Whitney U 0,000 Wilcoxon W 6,000 Z -2,121 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,034 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] 0,100 a Npar Tests Perlakuan N Mean Rank Sum of K ,00 6,00 S ,00 15,00 Mann-Whitney U 0,000 Wilcoxon W 6,000 Z -2,121 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,034 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] 0,100 a

16 Npar Tests Perlakuan N Mean Rank Sum of K ,00 6,00 S ,00 15,00 Mann-Whitney U 0,000 Wilcoxon W 6,000 Z -2,121 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,034 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] 0,100 a Npar Tests Perlakuan N Mean Rank Sum of K ,00 6,00 S ,00 15,00 Mann-Whitney U 0,000 Wilcoxon W 6,000 Z -2,121 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,034 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] 0,100 a

17 Npar Tests Perlakuan N Mean Rank Sum of S ,33 13,00 S ,67 8,00 Mann-Whitney U 2,000 Wilcoxon W 8,000 Z -1,291 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,197 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] 0,400 a Npar Tests Perlakuan N Mean Rank Sum of S ,17 6,50 S ,83 14,50 Mann-Whitney U 0,500 Wilcoxon W 6,500 Z -1,826 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,068 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] 0,100 a

18 Npar Tests Perlakuan N Mean Rank Sum of S ,50 10,50 S ,50 10,50 Mann-Whitney U 4,500 Wilcoxon W 10,500 Z 0,000 Asymp. Sig. (2-tailed) 1,000 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] 1,000 a Npar Tests Perlakuan N Mean Rank Sum of S ,00 9,00 S ,00 12,00 Mann-Whitney U 3,000 Wilcoxon W 9,000 Z -0,745 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,456 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] 0,700 a

19 Npar Tests Perlakuan N Mean Rank Sum of S ,00 6,00 S ,00 15,00 Mann-Whitney U 0,000 Wilcoxon W 6,000 Z -2,023 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,043 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] 0,100 a Npar Tests Perlakuan N Mean Rank Sum of S ,67 8,00 S ,33 13,00 Mann-Whitney U 2,000 Wilcoxon W 8,000 Z -1,291 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,197 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] 0,400 a

20 Npar Tests Perlakuan N Mean Rank Sum of S ,33 7,00 S ,67 14,00 Mann-Whitney U 1,000 Wilcoxon W 7,000 Z -1,650 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,099 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] 0,200 a Npar Tests Perlakuan N Mean Rank Sum of S ,83 14,50 S ,17 6,50 Mann-Whitney U 0,500 Wilcoxon W 6,500 Z -1,826 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,068 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] 0,100 a

21 Npar Tests Perlakuan N Mean Rank Sum of S ,67 14,00 S ,33 7,00 Mann-Whitney U 1,000 Wilcoxon W 7,000 Z -1,650 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,099 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] Npar Tests 0,200 a Perlakuan N Mean Rank Sum of S ,00 9,00 S ,00 12,00 Mann-Whitney U 3,000 Wilcoxon W 9,000 Z -0,745 Asymp. Sig. (2-tailed) 0,456 Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] 0,700 a

22 Lampiran I. Dokumentasi Penelitian Tempat Penelitian Lab. BKI Kelas I Polonia Pembuatan Ekstraksi RNA Elektroforesis Pembuatan Isolat VNN Penyuntikan isolat VNN pada ikan Pengamatan Harian